丝氨酸331是蛋白激酶C诱导血栓素α受体磷酰化

目的：检测人类血栓素α受体（TPα）C端丝氨酸／苏氨酸残基的各种丙氨酸诱变体作为PKC底物的能力,以确定被PKC磷酰化和脱敏的特异的丝氨酸／苏氨酸残基。方法：为了易于鉴定被磷酰化的细胞内区段,使用甘胱甘肽S－转移酶（GST）－细胞内区段融合蛋白作纯作的PKC底物,然后突变磷酰化蛋白的cDNA,以找出TPα被PKC磷酰化的主要部位,并将有组氨酸尾野生型或诱变型血栓素受体α稳定地转移到人类胚胎肾（EK）293细胞,以研究该受体的磷酰化和脱敏。结果：仅C－端能充当纯化PKC底物。丝氨酸－331 （mP4)被显示强的磷酰化,丝氨酸－324（mP1)则轻微磷酰化,丝氨酸－329（mP3)则微弱磷酰化,而其它丝氨酸／苏氨酸残基没被发现磷酰化。佛波醇－12－肉豆蔻酸酯－13－乙酸盐（PMA）诱导表达野生型TPα的HEK 293细胞磷酰化。然而不能显示触发表达丝氨酸331丙氨酸诱变受体的HEK 293受体磷酰化。用PMA预处理表达野生型受体的HEK 293细胞能抑制I－BOP诱导Ca^2 释放。然而用PMA预处理表达诱变受体的细胞不能中止I－BOP抑制Ca^2 释放。结论：丝氨酸331是TPα磷酰化和脱敏的主要和关键部位。     

酪氨酸激酶参与α_(1A)肾上腺素受体介导的人胚胎肾细胞浆游离钙浓度升高(英文)

目的:研究酪氨酸激酶是否参与α_(1A)肾上腺素受体介导的人胚胎肾细胞(HEK293)浆游离钙浓度调节。方法:用Fura-2/AM荧光法测定细胞游离钙浓度,底物反应法测定酪氨酸激酶活性。结果:去甲肾上腺素(NE)可引起的HEK293细胞内游离钙浓度升高至(371±31)nmol·L~(-1),酪氨酸激酶抑制剂檞皮素和tyrphostin可抑制NE引起的细胞内游离钙浓度升高,但不抑制NE引起磷酸肌醇的生成,NE可引起HEK293细胞浆酪氨酸激酶升高1.73±0.72倍,这种作用可被PKC的抑制剂calphostin C和细胞内钙耗竭所抑制。结论:酪氨酸激酶参与α_1A肾上腺素受体介导的人胚胎肾细胞内游离钙浓度升高。     

α_1-肾上腺素受体三种亚型介导的HEK293细胞中环腺苷一磷酸蓄积的特点(英文)

目的:研究α_1-肾上腺素受体各亚型介导的HEK293细胞中环腺苷一磷酸蓄积反应的特点。方法:(1)用磷酸钙沉淀法将编码三种亚型α_1-肾上腺素受体的全长cDNA分别转染到HEK293细胞中。(2)采用放射配基结合实验测定各亚型α_1-肾上腺素受体在HEK293细胞的表达量。(3)用[~3H]腺嘌呤掺入法测定环腺苷一磷酸蓄积率。结果:(1)各亚型激活后均使HEK293细胞中环腺苷一磷酸蓄积率呈浓度依赖性增加,并被α_1-受体选择性拮抗剂哌唑嗪阻断。(2)比较各亚型的药理学特性发现,在三种亚型中,α_(1A)-肾上腺素受体介导的效应最强,而α_1-肾上腺素受体各亚型对去甲肾上腺素的敏感性最高。结论:三种亚型α_1-肾上腺素受体均能介导HEK293细胞中环腺苷一磷酸的生成,并且在介导的效应和敏感性的高低等方面存在差异。     

α_(1A)-和α_(1B)-肾上腺素受体介导HEK293细胞增殖和Ca~(2 )-钙调蛋白依赖性蛋白激酶激活(英文)

目的:研究α_1-AR三种亚型对细胞增殖和Ca~(2 )-钙调蛋白依赖性蛋白激酶(CCDPK)的作用。方法:采用磷酸钙沉淀法进行转染,用放射配基结合实验测定α_1-AR表达量。用[~3H]胸腺嘧啶参入量测定细胞增殖,用免疫沉淀和髓鞘蛋白底物法测定CCDPK的活性。结果:三株表达α_(1A)-,α_(1B)-和α_(1D)-AR的细胞株表达受体密度约为0.6 nmol·g~(-1)。在普萘洛尔存在下,去甲肾上腺素(NE)作用24 h可浓度依赖地刺激HEK293/α_(1A)-AR和HEK293/α_(1B)-AR细胞DNA合成。NE 10 μmol·L~(-1)可促进HEK293/α_(1A)-AR和HEK293/α_(1B)-AR细胞DNA合成增加,刺激CCDPK活性的升高。NE不引起HEK293/α_(1D)-AR细胞DNA合成和CCDPK活性的显著改变。结论:在转染α_1-AR亚型的HEK293细胞中激动α_(1A)-或α_(1B)-AR可引起细胞增殖,激动α_(1D)-AR则无显著改变。     

黑斑息肉病(Peutz-Jeghers综合征)恶变一例报告

Ca2+调节蛋白依赖激酶Ⅳ(CaMKⅣ)是一种可以被胞内的Ca2+激活的丝氨酸-苏氨酸激酶.通过磷酸化调节丝氨酸残基,CaMKⅣ可以激活环一磷酸腺苷(cAMP)反应元件结合蛋白(CREB),这是已知的参与许多基因表达的转录因子.     

ABCB1(G1199A)基因稳定转染HEK293细胞株的建立

目的:将ABCB1(G1199A)突变型和野生型基因分别转入HEK293细胞,建立P-糖蛋白稳定表达细胞株。方法:以野生型ABCB1基因的cDNA为模板质粒,采用PCR点突变的方法合成突变的ABCB1(1199A)基因;在慢病毒的介导下,将实验室构建的pLVX-ABCB1-PGK-Puro和pLVX-ABCB1-mut-PGK-Puro重组质粒转染HEK293细胞,经嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞;通过流式细胞术检测P-糖蛋白的表达、RT-PCR检测ABCB1基因的转录水平、CCK-8方法测定外源基因对HEK293细胞增殖的影响。结果:流式细胞术证实P-糖蛋白在HEK193细胞中稳定过表达,RT-PCR确定转染细胞中存在ABCB1(G1199A)基因mRNA的过表达,成果获得ABCB1(G1199A)野生型和突变型基因的稳定表达细胞株。结论:成功建立两种ABCB1(G1199A)稳定表达的HEK293细胞株,为该酶的功能研究奠定了基础。     

野生型犬尿氨酸酶表达载体的构建及酶活性检测

目的构建野生型犬尿氨酸酶(KYNU)的真核表达载体,并分析其在HEK293细胞中的表达及其酶活性。方法抽提人肝脏细胞的总RNA,通过反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法获得KYNU基因全长cDNA,将野生型KYNU基因克隆到pcDNA载体质粒中,获得野生型pcDNA-KYNU重组表达质粒,经酶切鉴定和测序验证后转染HEK293细胞,用蛋白质印迹法技术检测野生型KYNU在细胞中的表达,用高效液相色谱法(HPLC)检测HEK293细胞表达的野生型KYNU酶蛋白的活性。结果通过测序及酶切鉴定野生型pcDNAKYNU重组表达质粒扩增后的PCR产物电泳结果显示构建成功,蛋白质印迹法结果显示转染有重组野生型cDNA-KYNU质粒的HEK293细胞能表达KYNU蛋白,HPLC结果显示野生型KYNU酶存在活性。结论成功构建野生型pcDNA-KYNU的真核表达载体,野生型重组质粒在HEK293细胞中能够表达KYNU并具有一定的酶活性。     

WNK4激酶通过激酶依赖途径抑制大电导钙激活钾通道的活性

WNK（with no lysine（k））激酶是一类新型丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶亚型。WNK家族的两种突变型会导致以高血压、高血钾、代谢性酸中毒为临床特征的Ⅱ型假性低醛固酮血症（PHAⅡ）。这些临床症状表明WNK对肾脏远曲小管主要的钾离子转运体包括肾外部髓质钾通道（ROMK）和钙激活钾通道（MaxiKorBK）可能有调节作用。最新研究表明,WNK4激酶不仅抑制ROMK通道功能,并且PHAⅡ型突变的WNK4激酶能够增强对非洲爪蟾卵的ROMK通道功能的抑制。目标：为确定WNK激酶是否会影响MaxiK通道功能,我们研究稳定表达MaxiK通道α亚基的HEK293细胞（HEK293-MaxiK）中的WNK4激酶对MaxiK通道功能的影响。方法：用CD4、WNK4野生型或者WNK4激酶失活变异体型D321A分别转染HEK293-MaxiK,2至4天后用细胞粘附式膜片钳记录单离子通道的活动。     

胰岛素样生长因子-1受体和胰岛素受体双重抑制剂类抗癌药Linsitinib

胰岛素样生长因子-1(IGF-Ⅰ)受体是一种跨膜受体酪氨酸激酶,与许多人类肿瘤的发生发展密切相关,由胞外α亚单位和含跨膜及胞内区部分的β亚单位构成,其中α亚单位负责与IGF-Ⅰ和-Ⅱ等可溶性IGF-Ⅰ受体配体结合,而β亚单位则发挥胞内受体酪氨酸激酶作用.与配体结合后,IGF-Ⅰ受体的同源二聚体和IGF-Ⅰ受体-受体酪氨酸激酶的异源二聚体便自身磷酸化,并激活下游PI3K/Akt/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶雷帕霉素靶蛋白(mTOR)和Ras/有丝分裂原活化蛋白激酶(MAPK)等信号通路,最终抑制细胞凋亡,促进细胞生长和迁移,导致肿瘤的生长和转移.     

蛋白激酶C参与内源性大麻素1型受体对心肌L型钙电流的抑制作用

目的研究激活心肌内源性大麻素1型(CB1)受体是否通过改变蛋白激酶C(PKC)活性从而抑制L型钙电流,探讨激活CB1受体导致PKC活性变化的信号途径。方法利用酶解法制备大鼠心室肌细胞,分别单独应用CB1受体特异性激动剂2-氯乙胺花生四烯酸(ACEA)100 nmol·L-1、CB1受体阻断剂AM251 100 nmol·L-1或PKC非特异性激动剂十四烷酸乙酸大戟二萜醇酯(PMA)500 nmol·L-1孵育细胞10 min;此外提前应用AM251或PMA孵育细胞5 min后,再用ACEA孵育细胞10 min。应用全细胞膜片钳技术记录单个心肌细胞的L型钙电流;应用Pep Tag非放射性蛋白激酶C检测系统检测细胞PKC活性;ELISA试剂盒测定细胞中二酰甘油(DAG)的含量;Western蛋白印迹法测定磷脂酶Cβ(PLCβ)和磷酸化磷脂酶Cβ(p-PLCβ)表达。结果给予ACEA激动大鼠心肌细胞的CB1受体,可显著抑制L型钙电流,最大峰值电流密度由11.4±0.8降至(6.4±1.5)p A·p F-1;预先给予AM251或PMA可以完全阻断此抑制效应。检测心肌细胞PKC活性发现,与正常对照组(1.59±0.50)μmol·min-1·L-1相比,ACEA组心肌细胞PKC活性为(0.69±0.48)μmol·min-1·L-1,明显降低;同样预先给予AM251或PMA完全阻断ACEA对PKC活性的抑制效应。而给予ACEA没有影响心肌细胞DAG含量和PLCβ的磷酸化。结论激活心肌细胞CB1受体后抑制细胞PKC的活性,从而抑制L型钙电流,此过程没有PLCβ-DAG途径参与。     

生物技术文摘

B46-6微生物谷氨酰胺转移酶广泛的酰基受体底物专一性Gundersen MT等[Appl Microbiol Biotechnol,2014,98:219]微生物谷氨酰转移酶(MTG)催化侧链的谷氨酸和赖氨酸反应形成二级结构的酰胺键。长链烷基胺携带多种化学结构单体,可以替代赖氨酸作为酰基受体底物,与目标肽或蛋白质分子连接。本研究考察了短链且化学结构不同的酰基受体底物,证实了很短的烷基类氨基酸(如甘氨酸)可以作为受体底物。除了异亮氨酸,其他酯化的α-氨基酸如苏氨酸、丝氨酸、半     

G蛋白偶联受体激酶活性调控及其在恶性肿瘤中的作用

G蛋白偶联受体(GPCR),是一类重要的细胞表面受体。G蛋白偶联受体激酶(GRK)属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族,其亚型广泛存在与各种组织,能够特异性地使活化的GPCR发生磷酸化及脱敏,从而终止GPCR介导的信号转导通路。新的研究还发现,GRK不仅作用于GPCR,也可以通过使非GPCR磷酸化或通过非磷酸化作用参与信号转导。GRK不仅能够调节GPCR和非GPCR,其自身活性也可受到多种因素的调节。本文结合GRK的多种功能作用和GRK活性调控,对GRK在脑、内分泌、生殖系统、消化系统及黑色素肿瘤中的作用做简要综述。     

G蛋白偶联受体激酶活性调控与细胞炎性损伤

G蛋白偶联受体激酶 (Gprotein coupledreceptorki nases,GRKs)不仅调节G蛋白偶联受体 (GPCR)磷酸化、介导受体脱敏 ,使信号效应降低或消失 ,而且也调节G蛋白和靶细胞骨架 ,同时它还受到蛋白激酶A(PKA)、蛋白激酶C(PKC)、肌动蛋白和细胞内第二信使钙离子等调节。组织细胞表面存在多种GPCR如血小板活化因子 (PAF)受体、组胺受体、凝血酶受体等 ,介导炎性介质所致细胞损伤的信号转导作用。GRKs磷酸化GPCR ,在炎症诱导细胞损伤过程中起一定调控作用     

线粒体功能障碍与2型糖尿病的相关性及在脂肪组织的表现

近些年,一系列的研究成果显示线粒体功能障碍在2型糖尿病的起病过程中发挥十分重要的作用[1].由于线粒体数量的减少及其功能缺陷,脂肪酸的氧化磷酸化作用下降,导致细胞内脂肪酸聚集,胰岛素受体底物(IRS)-1丝/苏氨酸磷酸化,而IRS-1丝/苏氨酸的磷酸化抑制胰岛素受体底物(IRS)-1酪氨酸的磷酸化,使得IRS-1不能激活磷酸肌醇-3激酶(PI-3K),胰岛素刺激的糖摄人减少,胰岛素信号通路障碍,出现胰岛素抵抗,并随着胰岛素抵抗的进一步发展,最终导致2型糖尿病[2].     

人源去甲肾上腺素转运蛋白稳定表达细胞系的构建及其功能鉴定

目的构建人源去甲肾上腺素转运蛋白(h NET)稳定表达细胞系,并对细胞系h NET的结合和重摄取功能进行研究。方法采用脂质体转染法将h NET转染于母细胞-人胚肾(HEK)293细胞(HEK293-h NET);采用RT-PCR和Western蛋白质印迹法在基因和蛋白水平对HEK293-h NET细胞系进行鉴定和稳定性验证;采用放射性配基结合实验检测HEK293-h NET的结合和重摄取功能。并采用三环类抗抑郁药地昔帕明(DIM)和5-羟色胺/去甲肾上腺素双重重摄取抑制剂度洛西汀(DLX),在0~1×10-4mol·L-1浓度梯度范围绘制药物与h NET的结合与重摄取抑制曲线,进一步验证HEK293-h NET细胞系的结合和重摄取功能。结果 RT-PCR和Western蛋白质印迹实验结果表明,所建立的HEK293-h NET细胞系在15代内均稳定表达h NET;放射性配基结合实验表明,HEK293-h NET细胞具有内源性h NET的结合和重摄取功能。并且,DIM和DLX与HEK293-h NET细胞中h NET具有明显的特异性结合(Ki值分别为2.45和3.40 nmol·L-1),并可显著抑制h NET对去甲肾上腺素的重摄取作用(IC50分别为5.78和10.23 nmol·L-1)。结论成功建立的可稳定表达h NET的HEK293-h NET细胞系具有内源性h NET的结合和重摄取功能,可用于h NET靶标药物研究。     

蛋白激酶C在H IV复制中的作用与药物发现

蛋白激酶C(PKC)是一类磷脂依赖的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,PKC在中枢神经系统疾病及心血管紊乱等多种人类疾病中都发挥了重要作用。研究发现,PKC可以通过多种途径刺激H IV病毒的活化,并磷酸化病毒复制周期中的多种蛋白,如P17gag、Nef、Rev和V if等,这些蛋白的磷酸化在病毒复制周期中起到了不可忽视的作用。了解PKC与H IV及细胞间的复杂关系,开发抑制PKC蛋白激酶的药物从而达到抑制H IV复制的目的,或激活PKC从而减少或消除体内潜伏的H IV病毒库是对PKC在抗H IV研究中应用提出的两个主要方向,对于开发新型抗H IV药物有重要意义。     

丙泊酚对胎儿型和α7烟碱型乙酰胆碱受体的作用

目的:通过重组受体,观察丙泊酚对胎儿型乙酰胆碱受体和神经型α7乙酰胆碱受体的作用.方法:通过脂质体转染法在HEK293细胞表达胎儿型或α7乙酰胆碱受体.应用全细胞电压-膜片钳技术研究不同浓度(0.1μmol/L-3mmol/L)丙泊酚对2种受体亚型的影响.结果:临床相关浓度丙泊酚对100μmol/L乙酰胆碱激发胎儿型和α7乙酰胆碱受体的电流均有抑制作用.不同浓度丙泊酚对胎儿型或α7乙酰胆碱受体电流抑制作用比较差异无统计学意义(P>0.05).相同浓度丙泊酚对胎儿型乙酰胆碱受体抑制大于对α7乙酰胆碱受体的抑制(P<0.05).结论:丙泊酚对γ-nAChR和a7-nAChR都有抑制作用,抑制程度与丙泊酚的浓度无关.     

血栓素A2受体与心血管疾病的关系

血栓素A2受体又叫TP受体,属于G蛋白耦联受体,具有七次跨膜特征,内生配体为血栓素A2和前列腺素H2(PGH2).人类的TP受体有两种亚型:TPαt和TPβ,分别由343个和407个氨基酸组成,虽然TPα和TPβ在结构上仅是C端尾部存在不同,但有一些研究表明,两者在功能上也存在一些不同,如现在已经证实是TPB,而非TαP在抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的迁移和血管生成中起作用[1].TP受体在鼠的体内分布广泛,亦有可能在鼠的生理或病理生理过程中发挥重要的作用.用RNA印迹分析鼠的不同组织可见,TP mRNA在胸腺和脾脏表达极高,在肺、肾、子宫、心脏、脑表达较高,而在肝、胃、回肠和睾丸表达很低,并且很多类型的细胞表达TP受体.     

ABCC2基因过表达细胞株的建立及鉴定

目的 构建携带ABCC2基因的慢病毒载体,转染HEK293细胞,筛选出稳定过表达ABCC2基因的细胞株并进行鉴定,为体外实验确定与多药耐药相关蛋白2(MRP2)外排转运相关的底物药物及其转运机制提供细胞模型。方法 根据GenBank提供的ABCC2基因cDNA序列设计引物,PCR扩增该基因并将其连接至慢病毒载体PZE-LV105,包装病毒并感染HEK293细胞。用嘌呤霉素进行筛选得到过表达ABCC2基因的稳转细胞株,通过基因测序、实时荧光定量PCR(RTQ-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)对稳转细胞进行鉴定。结果 测序结果证明重组慢病毒过表达载体所携带的ABCC2基因序列与GenBank提供的ABCC2序列一致;RTQ-PCR分析结果显示转染了ABCC2基因的HEK293细胞中MRP2 的mRNA相对表达比正常HEK293细胞和空白载体对照HEK293细胞高出约320倍;蛋白免疫印迹试验显示,转染了ABCC2基因的HEK293细胞中MRP2蛋白表达水平比正常HEK293细胞和空白载体对照HEK293细胞高出约150倍。结论 该实验成功构建了稳定过表达ABCC2基因的细胞株,该细胞株可用于初步筛选确定MRP2的特异性外排转运底物及其转运机制。     

半边旗提取物6F抑制HL-6 0细胞蛋白激酶C活性(英文)

目的　探讨半边旗提取物 6F的细胞毒作用及诱导DNA片段化与蛋白激酶C(PKC)信号转导途径的关系 ,检测 6F对PKC活性的影响。方法　受试对象为HL 6 0细胞 ,超速离心法获得的胞液 (可溶部分 )及颗粒 (不可溶部分 ,包括细胞膜系统及胞核 )部分用作PKC活性测定。经 0 .4g·L- 1磷脂酰丝氨酸 ,0 .0 4g·L- 1甘油二油酸酯激动剂作用酶粗提物后 ,用液体闪烁计数仪计数 [γ 32 P]ATP参入外源底物的量以测定PKC活性。MTT法测定HL 6 0细胞的活力 ,二苯胺法测定 6F诱导DNA片段化程度。结果　在所测试的浓度范围内 (0 .5～ 312 μmol·L- 1) ,化合物 6F显著抑制胞液及颗粒部分PKC活性 ,最大抑制率达 88.6 % ,呈浓度依赖关系 (胞液部分r =0 .781,P <0 .0 5 ,颗粒部分r =0 .931,P <0 .0 1)。 6F诱导HL 6 0细胞DNA片段化及对细胞的毒性作用可被具有致癌作用的PKC激活剂肉豆蔻酸酯 (PMA ,浓度为 6 5nmol·L- 1)拮抗 ,抑制率分别是 30 %和 4 4% (P <0 .0 1)。PMA单独用使HL 6 0细胞线粒体将MTT还原为甲月赞的能力增强 14 % (P <0 .0 1) ,即增强细胞活力。结论化合物 6F是PKC的抑制剂。 6F对HL 6 0细胞DNA片段化的诱导作用及其细胞毒作用至少可部分归因于其对PKC活性的抑制作用