反义人端粒酶RNA亚基对胆囊癌端粒酶活性及细胞生长的抑制作用

目的探讨反义RNA技术对胆囊癌细胞端粒酶活性的影响及对胆囊癌细胞生长增殖的作用。方法根据测定的胆囊癌人端粒酶RNA亚基(hTR)基因的序列结果，并根据真核表达载体多克隆酶切位点的物理图谱，体外合成反义RNA及正义RNA的基因序列，并构建入pTriEx-4真核表达载体，酶切鉴定正确后，采用脂质转染法导入胆囊癌细胞。TRAP法检测端粒酶活性。流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况，电镜观察细胞微观形态变化。结果实验组胆囊癌细胞的端粒酶活性较对照组明显减低，正义组、转染空载体及单纯脂质体转染的细胞端粒酶活性与未转染细胞比较则变化不明显。反义RNA基因作用后，G0／G1期细胞比例明显增高，S期细胞比例明显降低。细胞的分裂、增殖受到明显抑制。反义RNA基因转化后，10d凋亡率为11．10％。13d后凋亡率为29．02％。电镜下可见明显凋亡细胞。结论反义RNA技术对胆囊癌细胞端粒酶活性有明显的抑制作用；并抑制胆囊癌细胞的生长，促进细胞的凋亡；且克服了反义寡核苷酸作用时间短的缺点。     

核酶切割技术对胆囊癌细胞端粒酶活性抑制作用的研究

目的探讨锤头状核酶切割技术对胆囊癌细胞端粒酶活性的影响及对胆囊癌细胞生长增殖的作用。方法根据拟要切割的胆囊癌端粒酶RNA亚基模板两翼区的序列，体外合成锤头状核酶的基因序列，并构建入pTriEx-4真核表达载体。酶切及测序鉴定正确后，采用脂质转染法导入胆囊癌细胞，观察其对胆囊癌细胞端粒酶活性的影响及对细胞生长、增殖的作用，并设空载体转染组和单纯脂质体转染组作为对照。结果与对照组比较，实验组胆囊癌细胞的端粒酶活性明显减低；核酶基因作用后，G0／G1期细胞比例明显增高，S期细胞比例明显降低；细胞的分裂、增殖受到明显抑制。核酶作用后10d凋亡率为17、10％，13d后凋亡率为31．01％。结论核酶切割技术对胆囊癌细胞端粒酶活性有明显的抑制作用，并能抑制胆囊癌细胞的生长，促进细胞凋亡。     

抑制端粒酶活性诱导膀胱癌细胞凋亡的研究

目的 探讨抑制端粒酶粒酶活性各市县导膀胱癌细胞凋亡的可能性。方法 采用具有5′-d(TTAGGG)-3′序列的硫代磷酸反义寡核苷酸（PS-ODN）与膀胱癌EJ细胞共培养,观察细胞内端粒酶活性变化。细胞生长状态及细胞凋亡形态学变化。结果 经PS-ODN处理的膀胱癌细胞内端粒酶活性下降或消失,细胞生长状态受到明显抑制,并出现细胞凋亡特有的形态变化。结论 具有5′-d(TTAGGG)-3′序列的PS-ODN能够抑制膀胱癌细胞内的端粒酶活性,抑制膀胱癌细胞生长,诱导膀胱癌细胞凋亡。     

端粒酶反义寡核苷酸对乳腺癌端粒酶活性及细胞生长的影响

目的　探讨端粒酶反义寡核苷酸对人乳腺癌细胞端粒酶活性的影响及抑制端粒酶活性以控制乳腺癌细胞生长的可能性。方法　采用 10 μmol/L与端粒酶催化亚基 (hTRT )mRNA互补的反义寡核苷酸处理乳腺癌细胞 ;于处理后 2 4、72h用端粒重复序列扩增及酶联免疫吸附方法检测细胞端粒酶活性 ;于处理后 72h以流式细胞术测定细胞周期 ;于处理后 12 0h采用原位末端标记法检测细胞凋亡。结果　经hTRT反义寡核苷酸作用后 ,细胞端粒酶活性明显受到抑制 ,至作用后 72h ,端粒酶活性较对照组降低 65 .6% (P <0 .0 5 ) ;细胞生长明显受到抑制 ;细胞周期发生显著变化 :G0 /G1期细胞数增多 ,S期及G2 /M期细胞数则减少 ;细胞增殖指数由 0 .46降低至 0 .2 5 ;并可观察到凋亡细胞的出现 ,凋亡发生率为 12 .5 % ;而无义组及空白对照组以上各指标均无明显变化 (P >0 .0 5 )。结论　端粒酶反义寡核苷酸可明显抑制乳腺癌细胞端粒酶活性 ,抑制细胞生长和增殖 ,诱导细胞凋亡 ;表明应用反义技术抑制端粒酶活性治疗乳腺癌具有广阔的前景。     

脂质体介导增殖细胞核抗原反义寡核苷酸抑制人肝癌细胞增殖的实验研究

目的 观察脂质体介导增殖细胞核抗原（PCNA）对肝癌细胞增殖的影响。方法：根据PCNA cDNA序列设计合成与PCNAmRNA AUG起始密码子后的18位碱基序列互补的PCN反义寡核苷酸，脂质体介导转染人肝癌细胞析，通过细胞生长曲线测定，MTT比色法检测PCNA反义寡核苷酸对人肝癌细胞的生长抑制率，比较阳离子脂质体介导转染法与直接转染法的区别。结果 PCNA反义寡核苷酸作用后的肝癌细胞、生长明显受到抑制。应用阳离子脂质体介导转染能显著提高PCNA反义寡核苷酸的抑增殖效应。结论 利用阳离子脂质体介导转染PCNA反义寡核苷酸能显著提高对人肝癌细胞增殖的抑制效应。     

PCNA反义寡核苷酸抑制人肝癌细胞体外增殖的研究

目的 观察增殖细胞核抗原（PCNA）反义寡核苷酸对人肝癌细胞株体外增殖的影响及生物学特性的改变，方法 MTT法，集落形成试验观察PCNA反义寡核苷酸对人肝癌细胞的生长抑制，免疫组化技术检测PCNA的蛋白表达，流式细胞仪分析细胞周期变化。结果 PCNA反义核酸作用后的肝癌细胞生长明显受到抑制，抑制效应于作用后48h最为明显，并于72h后逐渐减弱，集落形成率明显下降，PCNA蛋白表达明显下降，细胞周期中S期细胞数明显减少。结论 PCNA反义寡核苷酸能显著抑制人肝癌细胞的生长。     

干扰素α-2b对瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡及端粒酶活性的影响

目的 观察干扰素α-2b（IFNα-2b）对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长增殖、端粒酶活性及凋亡的影响，探讨其在瘢痕疙瘩治疗中的作用机制。方法 进行成纤维细胞原代培养，细胞分别来自8例瘢痕疙瘩标本和8例正常皮肤标本。第3到4代的细胞用于实验。以干扰素α-2b作用于体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞，噻唑蓝（MTF）法检测成纤维细胞生长增殖情况，聚合酶链反应-酶联免疫吸附法（PCR-ELISA法）检测不同时间成纤维细胞端粒酶活性，应用流式细胞仪观察处理后成纤维细胞凋亡。结果 IFNα-2b对瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞有生长抑制作用，可明显下调成纤维细胞端粒酶活性，和对照组比较差异有统计学意义（P〈0．05），并呈现出明显的时间-效应关系。体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞经10000U／ml IFNα-2b处理后，能诱导成纤维细胞凋亡发生，与对照组比较差异有统计学意义（P〈0．01），且具有明显的时间依赖性。结论 作为一个负性调节因子，IFNα-2b能抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长增殖并诱导成纤维细胞发生凋亡，降低成纤维细胞端粒酶活性是其作用机制之一。     

Smad3反义寡核苷酸对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长增殖的影响

目的：了解Smad3反义寡核苷酸对瘢痕疙瘩成纤维细胞生长增殖的影响。方法：将Smad反交寡核苷酸（antisense-Smad3）作用于体外培养的瘢痕疙瘩成纤维细胞，测定^3H-TdR掺入量、TMM反应A值及Smad3蛋白表达（Western blot法）。结果：1μM、5μM antisense-Smad3均能使瘢痕疙瘩成纤维细胞^3H-TdR掺入量及MTT反应A值降低（P＜0．01），并下调Smad3蛋白表达。结论：Smad3反义寡核苷酸通过抑制Smad3蛋白的合成，阻断Smad蛋白的信号转导过程，从而抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长增殖。     

脂质体介导的端粒酶反义寡核苷酸体外转染率及对人膀胱癌EJ细胞的影响

目的通过以脂质体为载体介导端粒酶反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,asODN)转染人膀胱癌EJ细胞,促进反义寡核苷酸对膀胱癌EJ细胞的生长抑制。方法利用脂质体为载体将针对端粒酶RNA模板区的asODN转染膀胱癌EJ细胞;荧光显微镜观察细胞转染率;PCR-ELISA法测定端粒酶活性;MTT法检测反义寡核苷酸对膀胱癌细胞的抑制。结果脂质体介导的asODN在膀胱癌EJ细胞中的转染率1/2h、4h、8h分别为15%、56%、80%,并且细胞的端粒酶活性和细胞生长明显被抑制,与对照组比较,具有显著性差异(p(0.05)。结论脂质体介导的端粒酶asODN能够有效抑制膀胱癌EJ细胞端粒酶活性和生长,可应用于实验性肿瘤基因治疗研究和端粒酶与膀胱癌关系的进一步研究。     

端粒酶反义寡核苷酸对肾癌细胞端粒酶活性及其体外增殖的影响

目的　探讨端粒酶反义核酸对肾癌细胞端粒酶活性和体外增殖的影响。　方法　以端粒酶RNA模板区为靶点 ,序列为TAGGGTTAGACAA的硫代磷酸修饰的反义寡核苷酸 (ASON )与肾癌细胞株RCZ细胞共同孵育 ,计 1～ 2 8天细胞数 ,MTT比色法测细胞生长抑制率 ,PCR ELISA法检测端粒酶活性。　结果　ASON实验组与随机引物及空白对照组比较 ,端粒酶活性明显降低 (P<0 .0 0 1) ,细胞增殖数目显著减少 (P <0 .0 1) ,抑制率显著增加 (P <0 .0 0 1) ,抑制效果显示剂量依赖性 (P <0 .0 5 ) ,具有序列选择的特异性。　结论　以端粒酶RNA模板区为靶点的反义寡核苷酸抑制肾癌RCZ细胞的端粒酶活性和体外增殖 ,可能对肿瘤治疗有潜在的意义。     

反义寡聚核苷酸抑制人膀胱癌T24细胞系端粒酶活性的研究

目的研究反义寡聚核苷酸(asONs)能否抑制人膀胱肿瘤T24细胞系端粒酶活性和增殖活性。方法设计并合成2条针对端粒酶RNA模板区的asONs片段,在其作用于T24细胞第5天时,用7复孔法用聚合酶链反应-酶标法(PCR-ELISA)检测其对端粒酶活性的影响;分别在实验的第1、3、5、7天,用7复孔四唑盐比色试验(MTT)法检测其对细胞增殖活性的影响。结果经不同浓度(0、5、10μmol/L)处理5d后T24细胞端粒酶活性受到抑制,吸光度(A)值分别为0.79±0.10、0.24±0.14;经10μmol/L处理1、3、5、7d,T24细胞的增殖活性逐渐下降,A值分别为0.59±0.11、0.39±0.09、0.21±0.02、0.19±0.07,各组分别比较差异有非常显著性(P＜0.001)。结论asONs能够同时抑制人膀胱肿瘤T24细胞系端粒酶及细胞增殖活性,提示asONs可能通过抑制端粒酶活性达到抑制人膀胱肿瘤T24细胞系的增殖。     

超微载体介导反义端粒酶RNA抑制胶质瘤细胞生长的研究

目的　研究用体内可降解的聚乳酸 (PLA)和o 梭甲基壳聚糖 (CMC)制成的超微载体介导端粒酶RNA(hTR)反义寡核苷酸在体外对TJ90 5人脑胶质瘤细胞的作用。方法　用PLA和CMC制成超微载体 ,并用其介导hTR反义寡核苷酸在体外转染TJ90 5细胞 ,通过噻唑兰比色法(MTT)、改良端粒重复序列扩增法 (TRAP)、逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)对细胞转染情况作检测。结果　超微载体在体外能有效转染hTR反义寡核苷酸 ,48h后细胞存活率为 46.84% ,hTR、端粒酶催化亚基mRNA和端粒酶的活性水平分别为 0 .3 16、0 .0 2 4、5 1.40 0 ,明显受到抑制。结论　hTR可作为胶质瘤基因治疗靶点 ,超微载体能有效转染基因药物 ,可替代病毒载体。     

反义人类端粒酶 RNA逆转录病毒载体构建及其对结直肠癌细胞的抑制作用

目的 研究反义人类端粒酶RNA逆转录病毒载体对结直肠癌HT29细胞端粒酶活性及细胞生长的抑制作用。探讨以端粒酶为酸点的结直肠癌基因治疗的可能性。方法 将端粒酶hTR的cDNA反向插入逆转录病毒载体pLXRN中，转染包装细胞PT67后获得反义重组病毒，感染结直肠癌HT29细胞，采用RT-PCR检测hTR表达。端粒酶重复扩增法（telomerase repeat amplification protocol,TRAP)检测端粒酶活性，绘制生长曲线了解细胞生长状态，倒置显微镜观察和DNA片段电泳检测细胞凋亡。结果 反义hTR作用后的结直肠癌细胞hTR表达下降，端粒酶活性和细胞生长受到明显抑制，细胞出现凋亡。结论 反义hTR对结直肠癌HT29细胞的生长和端粒酶活性具有明显的抑制人舰艇可能以hTR为靶点对结直肠癌进行基因治疗。     

反义抑制大鼠精原细胞端粒酶活性及其对细胞因子反应性的研究

目的 :探讨精原细胞在封闭其端粒酶RNA(mTR)后的变化情况 ,及其对细胞因子 (SCF、TGF β1 )的反应性。　方法 :以脂质体为载体将端粒酶RNA的反义寡核苷酸 (PS ASON)导入体外增殖的精原细胞后 ,加入SCF或TGF β1 ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)比色法检测抑制前后细胞增殖情况 ,端粒重复扩增法 (TRAP)检测端粒酶活性变化。　结果 :1μmol L终浓度的PS ASON明显下调精原细胞端粒酶活性 ,抑制细胞增殖 ,而抑制结束后 ,端粒酶活性有一定程度的恢复 (P <0 .0 1)。细胞因子对抑制后的精原细胞有调控作用 ,SCF提高端粒酶活性 ,并促进细胞增殖。相反 ,TGF β1 则抑制端粒酶活性的恢复。　结论 :反义抑制精原细胞端粒酶活性能有效抑制细胞增殖 ,抑制结束后有较好的可逆性 ,并受细胞因子的调控 ,可望为男性节育提供一新型有效的方法     

mTR反义寡核苷酸在体外培养的A型精原细胞中的分布特点及稳定性研究

目的：探讨鼠端粒酶RNA(mouse telomerase RNA，mTR)基因的反义寡核苷酸(antisense oligode-oxynucleotide，ASODN)在体外培养的A型精原细胞中的分布特点及稳定性。方法：以脂质体LipofectAMINE2000(LF2000)介导或直接将硫代磷酸修饰的端粒酶mTR—ASODN转染体外分离纯化的Sprague-dawley(SD)鼠A型精原细胞，在荧光显微镜下对各实验组进行连续观察、摄片、分析。结果：在脂质体介导下，荧光细胞数目显著增加，lh后绝大多数细胞迅速荧光积聚于细胞核，l～4h后，细胞核内荧光强度进一步增强，4h后细胞内荧光减弱直至消失。而非修饰型mTR—ASODN在直接转染或脂质体介导下均发现荧光在3h后减弱甚至消失。结论：LF2000可增加mTR—ASODN转染A型精原细胞的数量，同时使其在细胞核内分布聚集明显。硫代修饰型mTR—ASODN在精原细胞内具有更好的稳定性。     

The experimental study on antisense TGF-beta 1 in inhibiting scar formation in III degree burn wound]

OBJECTIVE: To investigate the effect of antisense TGF-beta 1 in inhibiting scar formation during wound healing. METHODS: SD rats were divided into three groups after skin burn: group one was treated with antisense TGF-beta 1 oligonucleotide; group two was treated with antisense TGF-beta 1 recombinant plasmid and the control group. In different time, RT-PCR and immunohistochemistry were used to verify the expression of TGB beta 1 mRNA and protein. Type I Collagen mRNA expression was determined by hybridization in situ. Inflammatory reaction and collagen distribution were observed pathologically. RESULTS: In the groups received antisense ODN and recombinant plasmid, the expression of TGF-beta 1 mRNA and protein reduced during 14 days after burn. In the control group, type I collagen mRNA began to express at the second week and reached a peak at the fourth week, while the antisense groups kept low expression. The antisense group also showed mild inflammatory reaction and less synthesis of collagen. CONCLUSION: Antisense TGF-beta 1 could prevent the scar formation during wound healing.