TRAIL协同紫衫醇诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的 研究TRAIL和紫杉醇联合应用对骨肉瘤细胞的抑制作用,寻找骨肉瘤临床治疗的新方案.方法 将TRAIL与紫杉醇单独或联合应用于体外培养的骨肉瘤OS-732细胞,采用MTT法测定其对OS-732细胞的抑制率,并于相差显微镜、荧光显微镜下观察细胞形态的改变.结果 50 ng/mL的TRAIL与10μg/mL紫杉醇联合作用于OS-732细胞24 h后,抑制率为47.49％,明显高于单用TRAIL(50 ng/mL)时的9.85％及单用紫杉醇(10μg/mL)时的20.37％(P ＜0.01).细胞形态结构均出现凋亡的特征性变化.结论 TRAIL与紫杉醇联合应用可高效杀伤骨肉瘤细胞,这种杀伤效应是通过促进OS732细胞的凋亡来实现的.     

γ干扰素上调Fas表达诱导骨肉瘤细胞凋亡的研究

目的探讨γ干扰素(IFN-γ)对骨肉瘤细胞的诱导凋亡作用及其相关机制。方法将IFN-γ应用于体外培养的骨肉瘤OS732细胞,采用MTT法检测细胞毒性作用,流式细胞仪定量分析凋亡细胞所占比例,倒置相差显微镜、荧光显微镜下观察凋亡细胞形态改变。并采用免疫细胞化学及RT-PCR方法检测不同浓度IFN-γ作用下OS732细胞的Fas表达。结果IFN-γ对OS732有显著抑制作用,细胞形态观察及凋亡率测定也显示,IFN-γ可诱导骨肉瘤细胞凋亡;IFN-γ可上调OS732细胞的Fas表达,且调节作用呈浓度依赖性(P<0.01)。结论IFN-γ可诱导OS732细胞凋亡,这可能与其上调OS732细胞的Fas表达有关。     

锰型超氧化物歧化酶基因转染对人骨肉瘤细胞的诱导凋亡作用

目的探讨锰型超氧化物歧化酶(MnSOD)基因转染对人骨肉瘤细胞的诱导凋亡作用。方法采用电穿孔方法将反义和正义MnSOD cDNA表达载体稳定转染OS-732骨肉瘤细胞,应用四唑蓝(MTT)比色法、流式细胞技术、DNA梯度实验观察MnSOD转染对OS-732细胞的诱导凋亡作用。结果转染了pHβA-SOD ( )载体的OS-732细胞(MnSOD-732)较对照空载细胞(Vector-732)生长明显受到抑制,生长曲线呈下降趋势(P＜0．05),说明细胞凋亡或死亡。转染了pHβA-SOD(-)载体的OS-732细胞(MnSOD AS-732)生长曲线呈上升趋势(P＜0．05),说明MnSOD低表达可促进骨肉瘤细胞生长。Vector-732和MnSOD AS-732培养24h后未出现Ap峰,MnSOD-732培养24h后G_1峰前出现Ap峰,肿瘤细胞凋亡率为13．26%。细胞周期分析显示, MnSOD-732较Vector-732或MnSOD AS-732的S期比例明显增加,G2～M期比例明显减少。MnSOD-732可见DNA梯度条带,Vector-732和MnSOD AS-732均未见明显梯状条带。结论转染正义MnSOD质粒可诱导OS-732细胞凋亡,MnSOD有望成为新的骨肉瘤细胞抑制剂。     

中低温度热疗诱导骨肉瘤细胞株凋亡

目的:研究加热诱导成骨肉瘤细胞株(OS-9901)凋亡,为中低温度热疗辅助成骨肉瘤综合治疗提供理论依据. 方法:成骨肉瘤OS-9901细胞株分别经不同温度的热疗作用1 h,用TUNEL法染色及计数、透射电子显微镜观察其对骨肉瘤细胞株的诱导凋亡作用. 同时通过免疫组织化学染色,观察43℃ 1 h热疗对成骨肉瘤细胞株OS-9901的Bcl-2蛋白表达的影响. 结果:43℃作用1 h的成骨肉瘤细胞株继续培养6 h后出现大量异常细胞,透射电镜观察可见有典型的细胞凋亡特征性形态改变. TUNEL法染色后通过计数可见有42%的细胞凋亡比例. 免疫组织化学显示,43℃作用1 h的成骨肉瘤细胞株6 h后Bcl-2蛋白的表达明显减少. 结论:43℃作用1 h可以诱导成骨肉瘤细胞株OS-9901凋亡. 加热后成骨肉瘤细胞Bcl-2表达减少,从而进一步诱导发生细胞凋亡,为热疗诱导肿瘤细胞凋亡的机制提供了部分理论依据.     

TRAIL联合化疗药物诱导神经母细胞瘤细胞凋亡的研究

目的：探讨肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）联合化疗药物治疗神经母细胞瘤（NB）的作用及其可能机制。方法：不同浓度的TRAIL、化疗药物或TRAIL和化疗药物联合处理NB细胞株SMS-KCNR，应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）法检测细胞毒作用，应用流式细胞仪（FCM）检测细胞凋亡率，透射电镜对凋亡细胞进行形态学观察。结果：KCNR细胞对TRAIL不敏感，对化疗药物相对敏感，存在剂量依赖性细胞毒效应；TRAIL与亚毒性浓度的化疗药物联用对细胞的杀伤作用显著增强：透射电镜可见到典型的细胞凋亡特征。结论：KCNR对TRAIL不敏感，但TRAIL与亚毒性浓度化疗药物联用可增强杀伤效应，这种细胞毒作用主要由凋亡介导。     

低剂量吡柔比星协同TRAIL高效诱导人骨肉瘤细胞MG-63凋亡的实验研究

目的探讨肿瘤坏死因子相关诱导凋亡配体（TRAIL）与化疗药物吡柔比星（THP）联合应用是否存在协同诱导人骨肉瘤细胞MG-63凋亡的作用,并初步分析其可能存在的分子机制。方法将不同浓度的TRAIL与THP单独或者联合应用于常规培养的MG-63细胞系,24h后采用M1Tr法测定细胞抑制率,于倒置相差显微镜下观察细胞的形态学改变,流式细胞术检测细胞凋亡比例,RT—PCR检测药物作用后相关基因的表达水平。结果（1）TRAIL与THP均能抑制MG-63细胞增殖,但MG-63细胞对TRAIL不敏感,IC50〉10μg／mL;对THP相对敏感,IC50〈10μg／mL;（2）亚毒性浓度THP与不同浓度TRAIL联合,均呈现出高效协同作用（P〈0．05）,协同因子均大于1;（3）倒置相差显微镜及流式细胞术检测证实协同性杀伤作用主要通过诱导细胞凋亡实现;（4）RT—PCR显示两种药物联用后死亡受体DR4及DR5表达水平得到明显的增高。结论亚毒性浓度THP与TRAIL联用表现出高效诱导人骨肉瘤MG-63细胞凋亡的作用,死亡受体DR4及DR5在药物作用前后表达水平的改变可能参与了这一凋亡过程。     

Caspase 8在TRAIL诱导神经母细胞瘤细胞凋亡中的作用

目的探讨Caspase8在TRAIL（肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）诱导神经母细胞瘤细胞株CHP212细胞凋亡中的作用及机制。方法应用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法及流式细胞仪（FCM）检测TRAIL、Caspase8抑制剂（zIETD—FMK）＋TRAIL对CHP212细胞生长及凋亡的影响；应用比色法测定caspase8相对活性；应用透射电镜对凋亡细胞进行形态学观察。结果CHP212细胞对TRAIL的诱导凋亡作用敏感，存在时间和剂量依赖性；随TRAIL作用时间的延长，Caspase8活性逐步升高。于作用16h达高峰。zIETD-FMK能阻断Caspase8的活化而抑制TRAIL对CHP212细胞的诱导凋亡作用。透射电镜可见到典型的细胞凋亡特征。结论TRAIL通过Caspase8信号传导通路诱导CHP212细胞凋亡并伴随Caspase8活性增高。     

Caspases在TRAIL诱导MG-63骨肉瘤细胞株凋亡中的作用

目的 :初步观察并探讨人重组可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体 (TNF relatedapoptosis inducinglig and ,TRAIL)蛋白诱导MG 6 3骨肉瘤细胞凋亡的作用机制。方法 :用RT PCR检测TRAIL受体在MG 6 3骨肉瘤细胞上的表达 ;用MTT试验检测TRAIL对MG 6 3细胞的抑制率及加入Caspase抑制剂后TRAIL对MG 6 3骨肉瘤细胞株抑制率的变化。初步分析TRAIL诱导MG 6 3骨肉瘤细胞株凋亡的作用机理。结果 :当TRAIL单独作用于MG 6 3骨肉瘤细胞株时 ,可产生明显的抑制效果 ;而当TRAIL分别加入广谱的Caspase抑制剂zVAD FMK、Caspase 8的抑制剂zIETD FMK、Caspase 3的抑制剂zDEVD FMK与细胞株MG 6 3共同孵育时 ,TRAIL的抑制作用均被阻断。结论 :TRAIL可能是通过与细胞膜表面的死亡受体结合 ,然后激发细胞内Caspase级联反应从而诱导肿瘤细胞凋亡的。     

艾迪协同依托泊苷诱导骨肉瘤细胞凋亡的实验研究

目的 研究中药制剂艾迪对骨肉瘤化疗的增效作用及其相关机制.方法 将艾迪与依托泊苷单独及联合应用于骨肉瘤OS732细胞,用MTT法检测细胞抑制率,流式细胞仪定量分析凋亡细胞所占比例,倒置相差显微镜及荧光显微镜下观察凋亡细胞形态改变,免疫细胞化学技术分析凋亡相关蛋白Fas表达.结果 艾迪与依托泊苷对骨肉瘤细胞都有剂量依赖性杀伤作用,艾迪浓度达到25μ 1/mL时,细胞抑制率为38.47％,再增加艾迪浓度抑制率不再明显改变,但如与1μg/mL依托泊苷合用将使细胞抑制率进一步提升为51.62％(P＜0.01).细胞超微结构观察及凋亡率测定也显示,艾迪与依托泊苷联用可诱导更多骨肉瘤细胞凋亡,且联用时骨肉瘤Fas表达明显提升(P＜0.01).结论 艾迪与小剂量依托泊苷合用与单用依托泊苷相比可更高效杀伤骨肉瘤细胞,此作用与上调Fas表达诱导骨肉瘤细胞凋亡有关.     

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体和顺铂对Hela细胞的诱导凋亡作用

目的 观察不同浓度的肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)和顺铂对Hela细胞的诱导凋亡作用.方法 采用不同浓度的TRAIL作用于Hela细胞24 h,TRAIL 100 ng/mL、顺铂10 μmol/L及两者联合作用于细胞24 h,应用ELISA方法检测细胞凋亡率.结果 不同浓度的TRAIL作用于细胞后,细胞凋...     

Induction of apoptosis in osteogenic sarcoma cells by combination of tumor necrosis factor-related apoptosis inducing ligand and chemotherapeutic agents

Background Osteosarcoma is one of the most common primary malignant tumors of bone with poor prognosis. TNF-related apoptosis inducing ligand (TRAIL) is a member of the tumor necrosis factor (TNF) cytokine family. TRAIL induces apoptosis in various tumor cell lines but is not found to be cytotoxic to many normal cell types in vitro. We investigated the cytotoxic activity of TRAIL and chemotherapeutic agents, including methotrexate (MTX), doxorubicin (DOX) and cisplatin (CDDP), on established osteosarcoma cell line—OS-732.Methods OS-732 cells were incubated with chemotherapeutic agents MTX,DOX and CDDP at various peak plasma concentrations(PPC), 0.1PPC,1PPC and 10PPC, alone or with 100 ng/ml of TRAIL for 24 hours or 48 hours. MTT was used to evaluate the cytotoxic activity of different agents on OS-732. The apoptosis proportion was assayed by flow cytometry. Cellular morphologic changes were observed by phase contrast microscope, scan electron microscope, and transmission electron microscope.Results The inhibitory rate was (24.438±3.414)% with TRAIL of 100 ng/ml for 24 hours. The cells were responsive to DOX and CDDP with a dose-effect relationship (P&lt;0.05). In OS-732 cells, DOX and CDDP cooperated synergistically with TRAIL when incubated the cells with them for 24 hours (the combined inhibitory rate is (58.360±2.146)% and (54.101±2.721)%, respectively). TRAIL alone or drugs alone induced the apoptosis rate was less than 25% (P&lt;0.05). However, the combination of TRAIL and MTX did not present synergistic effects on OS-732 cells (P&gt;0.05, compared with TRAIL alone). Conclusions Osteosarcoma OS-732 cells were not responsive to TRAIL-induced apoptosis. DOX and CDDP sensitize osteosarcoma OS-732 cells to TRAIL-induced apoptosis. The combination of TRAIL and MTX presented no synergistic effects on killing OS-732 cells.     

人骨肉瘤细胞系OS—732诱导微血管生成的解剖显微结构及超微结构观察

目的 观察人骨肉瘤细胞系OS-732诱导微血管生成的解剖显微结构及超微结构特点。方法 应用鸡胚绒毛尿囊膜模型。通过解剖显微镜，光镜及透射电镜观察该细胞系诱导生成微血管的解剖显微结构及超微结构特点。结果 OS-732细胞系具有较强的诱导血管生成能力，解剖显微镜下可见血管辐辏现象。透射电镜下可见新生血管壁由单层内皮细胞构成，内皮细胞裂隙增宽，基底膜不完整，缺乏平滑肌成分。结论 肿瘤诱导的新生血管在病理，生理及形态功能方面都具有特征性，以血管为靶点治疗骨肉瘤对改善预后可能具有重要意义。     

顺铂热化疗对骨肉瘤细胞株细胞毒性的实验研究

目的：研究顺铂热化疗对骨肉瘤细胞株(OS-732)细胞毒性的影响，探讨热疗在骨肉瘤顺铂化疗中增效作用的机理。方法：OS-732细胞株分别经不同温度的热疗、不同浓度顺铂化疗、43℃热疗 顺铂联合作用各1h，采用体外细胞毒性试验(MTT法)、流式细胞仪(FCM)分析及电子显微镜观察其对细胞毒性和细胞周期的影响，以及诱导细胞凋亡的情况。结果：41℃、43℃、45℃热疗对OS-732细胞株有明显的细胞毒性作用。在37℃恒温条件下，细胞株单独与不同浓度的顺铂作用1h，随着顺铂浓度的升高，其细胞毒性作用明显增加。43℃热疗 顺铂共同作用1h，其细胞毒性作用进一步增加，细胞毒性指数最高达72．37％；FCM分析显示对细胞周期有明显的影响，S期细胞比例明显增加，G2与M期细胞比例明显减少。43℃热疗、43℃热疗 顺铂联合作用各1h均出现凋亡细胞峰(亚G1峰)，细胞凋亡比例最高达56．47％；透射电镜观察有典型的细胞凋亡特征性变化。结论：顺铂热化疗有明显的增强OS-732细胞株的细胞毒性作用。43℃热疗、43℃热疗 顺铂均可诱导骨肉瘤细胞凋亡。43℃热疗诱导骨肉瘤细胞凋亡可能是热疗在骨肉瘤顺铂化疗中增效作用的潜在机制之一。     

康莱特联合顺铂高效杀伤骨肉瘤细胞

目的 研究康莱特联合顺铂对骨肉瘤细胞的杀伤作用及其相关机制，探寻骨肉瘤的中西医结合化疗方案。方法 免疫组化及RT—PCR方法检测不同浓度康莱特作用下骨肉瘤OS732细胞的Fas表达，并将康莱特与顺铂单独及联合应用于OS732细胞，采用MTT法检测细胞毒性作用，流式细胞仪定量分析凋亡细胞所占比例，相差显微镜及荧光显微镜下观察凋亡细胞形态改变。结果 康莱特可上调OS732细胞的Fas表达并诱导凋亡，10μL／mL康莱特与1μg／mL顺铂合用于OS732细胞的抑制率与各自单用时相比明显提升（P〈0．01）。细胞形态观察及凋亡率测定也显示，康莱特与顺铂联用可诱导更多OS732细胞凋亡。结论 康莱特可协同顺铂高效杀伤骨肉瘤细胞，这可能与康莱特上调Fas表达诱导骨肉瘤细胞凋亡有关。     

重组野生型p53基因转染人骨肉瘤细胞株体外实验模型的建立

目的：将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株中，为进一步研究野生型ｐ５３蛋白诱导骨肉瘤细胞凋亡提供体外实验模型。方法：用ＤＮＡ转染技术将ＰＭ４７质粒，它是一种含激素诱导启动的鼠乳腺肿瘤病毒启动子和生化选择标志基因Ｅｃｏｇｐｔ的重组野生型ｐ５３ｃＤＮＡ质粒导入人骨肉瘤细胞株ＯＳ－７３２中，用ｇｐｔ选择培养基筛选阳性细胞克隆。结果：成功地将外源性野生型ｐ５３ｃＤＮＡ重组质粒导入人骨肉瘤细胞株ＯＳ－７３２细胞中，在ｇｐｔ选择培养基中培养２周后生长出阳性细胞克隆，命名为ＯＳ－７３２－Ｐ。结论：利用基因转染技术能将外源性野生型ｐ５３基因导入人骨肉瘤细胞株中，并能在选择培养基中生长     

不同浓度酒精灭活后的国人成骨肉瘤细胞超微结构的变化

目的 :探讨两种不同浓度的酒精灭活骨肉瘤细胞 (OS- 732 )后细胞内部结构变化和临床应用价值。方法 :75%和 95%酒精灭活骨肉瘤细胞 ,光镜和电镜下观察细胞形态 ,MTT法检测细胞活性。结果 :灭活后的细胞内部结构发生明显改变 ,形成不可逆性损伤。 MTT法检测证明处理后的肿瘤细胞已无生存能力。结论 :两种浓度的酒精对骨肉瘤细胞的灭活是有效的 ,为临床上骨肉瘤的保肢治疗提供良好的选择。     

抗VEGF抗体对骨肉瘤OS-732细胞血管生成及其肿瘤细胞增殖、凋亡的影响

目的：探讨阻断血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor,VEGF)的血管生成作用对骨肉瘤OS-732细胞及血管内皮细胞增殖、凋亡的影响。方法：应用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型,通过解剖显微镜血管计数,光镜HE染色,原位末端标记及PC-NA免疫组化检测观察VEGF抗体对骨肉瘤血管生成及肿瘤增殖,凋亡状态的影响。结果：VEGF抗体组肿瘤区血管数目及瘤细胞数显著低于PBS对照组,肿瘤细胞凋亡指数显著高于PBS对照组,增殖指数两组差异不明显,同时VEGF抗体组凋亡的微血管内皮细胞增多,增殖期微血管内皮细胞少见。结论：VEGF抗体能显著抑制骨肉瘤OS-732血管生成,抑制内皮细胞增殖,促进内皮细胞凋亡,可能是VEGF抗体发挥抗血管生成作用的途径之一,并可能通过抑制血管形成而促进肿瘤细胞凋亡,最终达到抑制瘤细胞生长的作用。     

骨肉瘤VEGF表达及VEGF抗体抑制血管生成的实验研究

目的研究血管内皮生长因子（VEGF）表达与骨肉瘤血管生成和预后的关系,以及VEGF抗体抑制骨肉瘤细胞OS-732诱导血管生成的作用和可能机制,为以VEGF为靶点治疗骨肉瘤提供实验依据。方法应用免疫组化和形态计量方法,检测80例骨肉瘤VEGF表达、肿瘤微血管密度（MVD）,以及OS-732血管生成相关因子的表达。进一步应用鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）模型观察VEGF抗体对OS-732诱导血管生成及肿瘤细胞生长的抑制作用。结果（1）骨肉瘤VEGF表达与肿瘤微血管密度（MVD）及预后密切相关。（2）OS-732表达VEGF和BFGF,而且VEGF表达强度明显高于BFGF,OS-732具有很强的诱导血管生成能力。（3）VEGF抗体干预实验结果显示VEGF抗体组肿瘤区血管密度明显低于PBS对照组,细胞凋亡指数显著高于PBS对照组,而增殖指数两组差异无统计学意义。同时,VEGF抗体组凋亡的微血管内皮细胞增多,增殖期内皮细胞少见。结论VEGF是骨肉瘤重要的血管生成因子,其表达可能是评估骨肉瘤预后的一项有价值的指标。VEGF抗体能够抑制内皮细胞增殖,促进内皮细胞凋亡,显著抑制骨肉瘤OS-732血管形成,并可能通过抑制血管形成而促进肿瘤细胞凋亡,达到抑制瘤细胞生长的作用。该结果提示VEGF可以作为骨肉瘤抗血管生成治疗的潜在靶分子。     

快中子及混合线照射人成骨肉瘤 OS-732 细胞系的实验观察

目的：观察快中子及光子对人成骨肉瘤细胞系OS-732的杀伤作用。方法：用快中子、光子及混合射线照射OS-732细胞系，检测各组细胞受照射后的集落形成率。结果：单次照射后第10天，混合线组对该细胞系集落形成的抑制作用明显弱于单中子及单光子组。结论：单次照射后第10天，单纯快中子及单纯光子对该细胞系集落形成的抑制作用明显强于混合线组，对临床上应用快中子治疗骨肉瘤有一定指导意义。