何首乌ISSR—PCR反应体系的建立与优化

目的 建立和优化ISSR-PCR反应体系.方法 通过单因素实验研究ISSR反应体系中主要成分(模板、Taq DNA聚合酶、Mg2 、引物、dNTPs)以及退火温度对扩增结果的影响.结果 建立了适合何首乌ISSR分析的反应体系和扩增程序,即在25μl反应体系中,内含1×Taq酶配套缓冲液、100ng模板、1.5 U Taq DNA聚合酶、1.5 mmol/L Mg2 、0.6μmol/L引物、0.2 mmol/L dNTPs.扩增程序为94℃预变性5 min;然后是94℃变性45s,(据不同引物的退火温度)复性1 min,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃延伸7 min,4℃保存.结论 这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行何首乌鉴定及种质资源遗传多样性分析提供了一个标准化程序.     

美花石斛RAPD-PCR反应体系的建立

目的建立美花石斛基因组DNA的RAPD-PCR最佳反应体系。方法在提取纯化美花石斛基因组DNA的基础上,利用PCR扩增技术和方法,对Mg2 ,dNTP,模板DNA,引物,Taq聚合酶等反应条件进行优化。结果反应体系的最佳条件是总体积为25μl,其中Mg2 浓度1.2 mmol.L-1,Taq聚合酶1.2U,引物浓度0.3 mmol.L-1,模板DNA 46 ng和dNTPs 160 mmol.L-1;PCR扩增程序为94℃预变性3 min,94℃变性50 s,40℃退火1 min,72℃延伸2 min,循环40次,72℃延伸5 min。结论该反应体系具有经济,简便以及扩增条带较清晰而稳定等特点。     

党参ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的：建立党参的ISSR-PCR反应体系,为今后利用ISSR标记技术进行党参鉴定及种质遗传多样性分析提供一个标准化程序。方法：采用试剂盒法提取党参基因组DNA为模板,通过单因素实验分析了ISSR-PCR反应体系中MgCl2、dNTPs、引物浓度、TaqDNA聚合酶、模板DNA用量及退火温度对ISSR-PCR扩增的影响。结果：建立了重复性好,分辨率高的ISSR-PCR反应体系,即在25μL反应体系中,含有10×PCR Buffer缓冲液2.5 μL,MgCl2 2.0 mmol·L-1,dNTPs 0.5 mmol·L-1,引物0.4 μmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA为30 ng;扩增程序为：94 ℃预变性5 min,然后94 ℃变性30 s,51.7 ℃退火1 min,72 ℃延伸1.5 min,共计35个循环,循环结束后在72 ℃延伸7 min,4 ℃保存。结论：建立了适用于党参的ISSR-PCR反应体系,为应用ISSR技术鉴定党参种质资源、分子标记辅助选择育种及其遗传多样性研究奠定了基础。     

瓜蒌ISSR-PCR最佳反应体系的研究

为了得到适合研究瓜蒌农家品种的ISSR-PCR反应条件,本研究采用单因素实验和正交实验,对瓜蒌ISSR反应体系进行了优化,确立了适合瓜蒌的ISSR反应体系:20μL反应体系,含0.5μmol/L引物、2×Master Mix(Taq DNA Polymerase)10μL、35 ng模板DNA。通过性状差异较大样品的单因素试验,确定了能够适合尽量多样品的ISSR最佳反应程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,退火1 min,72℃延伸45 s,35个循环;72℃延伸7min,4℃保存。不同的引物所需要的退火温度不尽一致。     

不同产地猫豆遗传多样性的ISSR分析

目的:从DNA分子水平分析不同产地猫豆的遗传多样性,探索其相互之间的亲缘关系。方法:采用简单重复序列区间(ISSR)分子标记技术对11份不同产地猫豆进行聚类分析,ISSR-聚合酶链式反应(PCR)扩增程序为94℃预变性4min,94℃变性45s,48~54℃退火1min,72℃延伸90s,40个循环,72℃延伸7min,10℃保存。在单因素试验基础上,通过L16(45)正交试验考察ISSR-PCR的5个主要因素(Mg2+,引物,dNTPs,模板DNA及Taq聚合酶)。运用Ntsys-pc软件和Popgene软件对11份样品进行分析。结果:ISSR-PCR反应最佳体系为模板DNA20ng,0.3μmol·L-1引物,0.15mmol·L-1的dNTPs,2.4mmol·L-1MgCl2,1UTaqDNA聚合酶(5U·μL-1),PCR缓冲液2μL,加入灭菌水至20μL。从40条ISSR引物中筛选出10条扩增条带清晰且重复性良好的引物,共扩增出97个条带,其中多态性条带25条,多态性位点比率25.8%。11份猫豆资源间的遗传相似系数0.866~0.9691,聚类分为3个大类群。结论:猫豆遗传差异与地理分布有一定关系,但整体遗传变异小,遗传稳定性强。     

地龙ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的 建立和优化地龙ISSR-PCR反应体系.方法 以地龙药材为实验试材,采用异丙醇沉淀法提取了地龙总DNA模板,对地龙ISSR-PCR反应体系中各个主要影响因子进行了优化和筛选.结果 建立了标记位点清晰、稳定、重复性好,可用于地龙ISSR分析的最佳反应体系,50 μl体系中含有:1×Taq酶配套缓冲液,DNA模板50 ng,2.5U Taq DNA聚合酶,2 mmol/L MgCl2,0.8 μmol/L引物,0.2 mmol/L dNTPs.扩增程序为:94℃预变性5 min;94℃变性30 s,(据不同引物的退火温度)复性30 s,72℃延伸1.5 min,共35个循环;72℃延伸5 min,反应结束后,4℃保存.结论 这一优化体系的建立为今后利用ISSR标记技术进行地龙类药用动物鉴定及种质资源遗传多样性分析奠定了基础.     

野生白及SRAP-PCR反应体系的优化

采用浓度梯度设计法研究适合白及的SRAP-PCR反应体系。对影响SRAP-PCR的DNA模板、引物、dNTP、Mg2+、Taq酶、退火温度等6个因素进行优化。最终确定白及的SRAP-PCR优化体系:在20μL体系中,DNA模板30 ng、Mg2+2.5 mmol/L、dNTPs 0.25μmol/L、引物20μmol/L、Taq酶2.0U,扩增体系为:94℃预变性5 min;5个循环的94℃变性1 min,36℃退火1 min,72℃延伸1 min;之后35个循环:94℃变性1 min,48℃退火1 min,72℃延伸1 min;72℃最后延伸5 min。该体系的建立为野生白及种质资源遗传多样性的进一步相关遗传分析奠定了基础。     

金线莲ISSR反应体系的建立与优化

目的针对台湾金线莲ISSR反应的特点,建立一个稳定性高、重现性好,适合金线莲ISSR遗传差异分析的反应体系。方法确立金线莲ISSR初始反应体系并对引物进行初筛;设定反应体系中各因子的不同浓度并进行PCR扩增,依据稳定性高、重现性好的原则,对该反应体系进行调整与优化,最终建立稳定可靠的ISSR反应体系。结果首次建立了金线莲ISSR反应的最适体系(25μL):1×PCR buffer,2 mmol/L MgCl2,200μmol/L dNTP Mixture,0.2μmol/L引物,1 U Taq酶,DNA模板约20 ng;扩增程序:94℃充分变性7 min,94℃变性30 s,52℃退火45 s,72℃延伸2 min,45个循环后,最后72℃延伸10 min。结论所建立的金线莲ISSR反应体系具有稳定性高、重现性好、标记位点清晰、检测多态性能力强等特点,可以较好地应用于野生金线莲的居群差异研究及经长期组培繁殖后金线莲无菌苗的遗传变异研究。     

三角叶黄连ISSR反应体系的建立与优化

目的 针对三角叶黄连ISSR的反应特点,建立稳定可靠的ISSR-PCR分子标记反应体系,为进一步研究三角叶黄连的种质资源遗传多样性奠定基础.方法 通过筛选引物并设定影响三角叶黄连ISSR-PCR反应诸因子的不同梯度,检测其不同反应体系的扩增效果,分析非特异性条带的产生原因并进行条件优化,建立三角叶黄连ISSR-PCR稳定可靠的反应体系.结果 建立了可用于三角叶黄连ISSR-PCR分析的最适宜的反应体系:25 μLPCR反应体系中,内含10×PCR Buffer 2.5 μL,1.5 mmol/L Mg~(2+),200 μmol/L dNTP,0.3 μmol/L 引物,40 ng模板,1.0 U Taq DNA聚合酶.扩增程序为94℃预变性5 min,然后进行35个循环:94℃变性30 s,(据不同引物的退火温度)复性60 s,72℃延伸90 s,循环结束后72℃延伸7 min,4℃保存.结论 所建立的三角叶黄连ISSR反应体系具有标记位点清晰、反应系统稳定、检测多态性能力强、重复性好等特点,可以较好地应用于三角叶黄连的种质资源遗传多样性及居群鉴别的研究.     

杜仲SSR-PCR反应体系的优化

目的:建立杜仲简单重复序列-聚合酶链式反应(SSR-PCR)的优化反应体系,为杜仲种质间的遗传差异及亲缘关系分析提供参考。方法:选择Taq DNA聚合酶,模板DNA,Mg2+,引物及d NTP浓度为考察因素,利用单因素试验和L16(45)正交试验优选杜仲的SSR-PCR反应体系,运用SPSS软件对试验结果进行分析。结果:各因素水平变化对反应体系影响顺序依次为Mg2+Taq DNA聚合酶引物d NTP模板DNA。优化的PCR反应体系为10×PCR缓冲液2μL,Taq DNA聚合酶0.5U,Mg2+浓度1.25 mmol·L-1,d NTP浓度0.2 mmol·L-1,引物浓度0.3μmol·L-1,模板DNA用量60 ng,定容至20μL。结论:利用该体系进行扩增,所得谱带明亮清晰,稳定性和重复性良好,适用于杜仲不同居群间亲缘关系和遗传多样性分析。     

天门冬ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的建立并优化天门冬ISSR-PCR反应体系和扩增程序,为探讨天门冬种质间遗传多样性提供依据。方法采用单因子试验和正交设计法,研究Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、延伸时间及循环次数对PCR扩增的影响。结果天门冬ISSR-PCR的最佳反应体系为25μL的反应体系中含模板DNA 40 ng、Mg2+1.25 mmol/L、dNTP 320μmol/L、引物1.2μmol/L、Taq DNA聚合酶1.5 U。在此基础上,从50条引物中筛选出13条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度。结论建立的天门冬ISSR-PCR反应体系,经过17份天门冬种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于天门冬遗传分析。     

水母雪莲ISSR-PCR反应体系优化及引物筛选

目的优化并建立适合于水母雪莲的ISSR-PCR反应体系并筛选出稳定的ISSR引物。方法采用L16(45)正交设计方法,以Taq DNA聚合酶浓度、d NTP浓度、模板DNA浓度、引物浓度、Mg~(2+)浓度5种因素4个水平对水母雪莲ISSRPCR反应体系进行优化;并对反应体系进行验证。采用优化后的反应体系筛选出条带清晰且稳定的ISSR引物,通过退火温度梯度试验确定最佳退火温度。结果最终确立了水母雪莲20μl ISSR-PCR最佳反应体系,即包含Taq DNA聚合酶0.7U、d NTP 0.125mmol/L、引物0.3μmol/L、模板DNA 40ng、Mg~(2+)1.5mmol/L。在此基础上,从84条ISSR引物中筛选出条带清晰且稳定的8条引物,并通过梯度PCR反应确定最佳退火温度。结论经过11份水母雪莲种质验证,证明所建立的体系稳定可靠,可用于后续水母雪莲遗传多样性分析和种质资源鉴定。     

青天葵ISSR-PCR体系优化及引物筛选

目的:建立适合青天葵遗传差异分析的简单重复序列区间(ISSR)-聚合酶链式(PCR)反应体系。方法:采用正交试验设计对影响青天葵ISSR-PCR反应体系的5种因素(dNTP、模板DNA、引物、Mg2+和Taq DNA聚合酶)4个水平进行优化,并结合新复极差法,对试验中各单因素进行分析。结果:确立了青天葵最佳反应体系,即在20μL的总反应体积中含有10×PCR buffer 2μL,dNTP 225μmol·L-1,Mg2+2.5 mmol·L-1,引物0.4μmol·L-1,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA60 ng;从100条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。结论:建立的青天葵ISSR-PCR反应体系,经过24份青天葵样品检验,得出该体系稳定可靠,可用于青天葵遗传差异分析。     

濒危药用植物三叶青ISSR分子标记的建立

目的对三叶青的简单重复序列-聚合酶链式反应(ISSR-PCR)体系和扩增程序进行优化,并将其应用于野生三叶青种质资源的遗传分子标记。方法采用单因素试验,对三叶青ISSR-PCR反应条件中的Mg2+、d NTP、引物、模板DNA、Taq DNA聚合酶浓度和退火温度等因素进行筛选,之后结合正交试验来选择多态性高、重复性好的ISSR引物。结果建立了ISSR-PCR最佳反应体系,为25μL反应体系中含有2.5 mmol/L Mg2+、0.2μmol/L引物、0.25mmol/L d NTP、50 ng DNA模板、0.5U Taq DNA聚合酶,并利用U810等16条引物,初步构建了15份三叶青种质资源的ISSR指纹图谱,平均多态条带百分率达57.0%。结论该反应体系的稳定性和多态性良好,可满足对三叶青野生资源的遗传变异水平和结构分析的研究考察。     

阳春砂ISSR-PCR反应体系的建立和优化

目的 建立起适合阳春砂的ISSR-PCR反应体系.方法 综合运用单因素实验和L9(34)正交实验两种方法,对DNA模板、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶等因素进行优化,以及采用温度梯度筛选引物的退火温度.结果 最终获得的阳春砂的最优ISSR-PCR体系为:总体积为20 μl,其中包括10×Ex Taq Buffer(含15 mmol·L-1 Mg2+)2 μl,25 ng DNA模板,0.50 μmol·L-1引物,0.75 mmol·L-1 dNTPs和1.0 U Ex Taq酶.通过温度梯度筛选出引物UBC808的最佳退火温度为52.0 ℃.结论 这一优化体系为阳春砂的ISSR分析奠定了基础.     

辽细辛和北马兜铃ISSR-PCR的引物筛选及反应体系的建立与正交优化

目的探寻适合细辛和马兜铃品种鉴定的ISSR引物。方法利用一个品种对全部100条ISSR引物设置退火温度进行梯度实验,筛选出重复性好、条带清晰的引物5条,从理论上讲,这些筛选的引物可以实现对现有辽细辛和北马兜铃品种的鉴定。马兜铃属ISSR-PCR的引物筛选,利用正交试验设计的方法,从Taq DNA聚合酶浓度、Mg~(2+)浓度、dNTP浓度、引物浓度,这4种因素3个水平,对马兜铃属ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对模板DNA浓度、PCR反应过程中的退火温度进行梯度检测。结果从样品中筛选出优选引物,细辛UBC815、UBC826、UBC862、UBC868、UBC888;马兜铃UBC825、UBC827、UBC836、UBC846、UBC848。反应体系的稳定性进行检测结果均稳定可靠。结论得到马兜铃的最佳组合,即20μL ISSR-PCR反应体系中含0.25 Lmol/L引物、1.5 mmol/L Mg~(2+)、1×PCR buffer、150 Lmol/L dNTP和0.5 UTaqDNA聚合酶。PCR反应条件为94℃预变性5 min,以30个循环94℃变性30 s,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,最后以72℃延伸10 min。得到细辛的最佳组合,20μL ISSR-PCR反应体系中含0.50 Lmol/L引物、1.5 mmol/L Mg~(2+)、2×PCR buffer、250 Lmol/L dNTP和2.0 UTaqDNA聚合酶;同时得到最佳模板DNA浓度为10 ng,最佳退火温度为50℃。     

夏枯草ISSR分子标记技术的建立与体系优化

目的 建立并优化夏枯草ISSR-PCR反应体系和扩增程序.为探讨夏枯草种质问遗传多样性奠定基础.方法 采用单因子试验和正交设计方法,研究.Mg2+、dNTP、引物、Taq DNA聚合酶、模板DNA、退火温度及循环次数对PCR扩增的影响.结果 夏枯草ISSR-PCR的最佳反应体系为:在20 μL的反应体系中含模板DNA 30ng,Mg2+ 2.2 mmol/L、dNTP 175 μmol/L、引物0.75μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U.在此基础上,从92条引物中筛选出18条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物.并通过梯度PCR试验.确定引物最佳退火温度.结论 采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过24份夏枯草种质检验,证明该体系稳定可靠,可用于夏枯草遗传分析.     

云南沉香ISSR-PCR反应体系的建立与优化

目的建立并优化出清晰稳定的云南沉香ISSR-PCR反应体系和扩增程序,并筛选出适合的引物。方法利用正交设计试验,对云南沉香ISSR-PCR反应体系中的5个主要因素进行优化,并设置温度梯度检测最佳退火温度。结果首次建立了云南沉香ISSR-PCR的最佳反应体系,即在20μl反应体系中,各个因素的浓度分别为:模板DNA 10 ng/20μl、Mg2+3mmol/L、Taq DNA聚合酶2.4 U/20μl、d NTP 0.6mmol/L、引物0.2μmol/L;引物UBC811的最佳退火温度为53.0℃。并且,从100条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物。结论优化确立的云南沉香ISSR-PCR反应体系稳定可靠,可为后续云南沉香的遗传多样性分析研究奠定基础。     

青天葵总DNA的提取与随机扩增多态性DNA反应条件的建立

目的 建立并优化青天葵样品总DNA提取方法及随机扩增多态性DNA(RAPD)反应.方法 采用改进的高盐低pH法提取青天葵鲜叶和药材样品,通过正交设计和均匀设计,改变反应体系和扩增程序优化随机扩增多态性DNA.结果 使用高盐低pH值法可较好地提取新鲜叶片的DNA,药材叶片含杂质较多,但都能用于RAPD.反应体系为:缓冲液2.0 μ1,0.5 μl dNTP(各2.5 mmol·L-1),0.8 μl Mg2+(25 mmol·L-1),0.5 μl引物(20 pmol·μl-1),0.2 μl Taq酶(5U·μ1-1),1 μl DNA(50 ng),1μl BSA(20 mg·ml-1),加双倍蒸馏水至20 μl.扩增程序为:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s,40 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,40个循环;72℃延伸5 min.结论 建立并优化了的青天葵样品总DNA提取方法及RAPD反应体系.     

蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序的建立与优化

目的:优化蒲公英ISSR-PCR反应体系及扩增程序;筛选适合的引物,并确定最佳退火温度.方法:采用CTAB法提取蒲公英叶片的DNA,利用正交试验设计,从Taq酶MIX、模板DNA、引物3种因素2个水平,对蒲公英ISSR-PCR反应体系进行考察;采用单因素实验对其扩增程序进行优化.结果:确立了适合于蒲公英的最佳ISSR-PCR反应方法,即在25 μL反应体系中,内含Taq酶MIX 15 μL(1.25 UTaq DNA聚合酶,1.8 mmol·L-1 Mg2+,dNTPs各0.24 mmol·L-1),0.3 μmol·L-1引物,5 ng模板.在此基础上,从50条引物中筛选出16条扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度.结论:采用单因子试验和正交设计方法可以快速建立ISSR-PCR反应体系,经过验证,证明该体系稳定可靠,可用于蒲公英遗传分析.