6A8 α—甘露糖苷酶表达低下致人鼻咽癌细胞CNE—2L2生长抑制

目的：研究6A8 α-甘露糖苷酶与CNE－2L2肿瘤细胞生长的关系。方法：用腺相关病毒载体将反义6A8 cDNA导入鼻咽癌细胞CNE－2L2。细胞中6A8 α-甘露糖苷酶表达情况用单抗6A8a免疫荧光染色、α－甘露糖苷酶添生及ConA结合试验检测。以野生型细胞、转导了空载体或正义6A8的细胞作对照,以MTT、集落形成及裸鼠实验检测肿瘤细胞生长。结果：转导反义6A8能抑制CNE－2L2细胞6A8 α-甘露糖苷酶表达,6A8 α－甘露糖苷酶表达抑制的CNE－2L2细胞的MTT值、形成集落数及接种裸鼠皮下后所长肿瘤的重量均较对照显著降低可减小（P＜0．001）。结论：6A8 α－甘露糖苷酶表达低下致人鼻咽癌细胞CNE－2L2生长抑制。     

6A8 α-甘露糖苷酶表达抑制致人鼻咽癌细胞CNE-2L2与层粘连蛋白粘附减弱及片状伪足减少

目的探讨6A8α-甘露糖苷酶表达抑制对CNE-2L2细胞与层粘连蛋白的粘附及细胞表面片状伪足的影响。方法Western印迹检测6A8α-甘露糖苷酶的表达。置细胞于层粘连蛋白(laminin)包被的培养板孔中,37℃孵育1h后,用结晶紫染色细胞,用0.1mol/L枸橼酸钠/50%乙醇溶解结合到细胞中的染料。测定540nm处的吸光度值(AT),按R=AT/A100×100%计算粘附率(A100为100%粘附值)。扫描电镜观察细胞表面的片状伪足。结果6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的2个克隆细胞株(AS1和AS2)对层粘连蛋白的相对粘附率分别为0.447±0.096与0.533±0.065,而6A8α-甘露糖苷酶表达正常的对照细胞(W、M和S)的相对粘附率分别为0.78±0.035、0.7±0.05和0.80±0.04。两者的差别有生物学意义(P<0.01)。6A8α-甘露糖苷酶表达正常的细胞表面片状伪足丰富,6A8α-甘露糖苷酶表达抑制的细胞表面的片状伪足基本上消失。结论6A8α-甘露糖苷酶表达抑制可导致人鼻咽癌细胞CNE-2L2与层粘连蛋白粘附减弱及片状伪足减少。     

EGFR反义RNA的转染对人类鼻咽癌CNE-2细胞EGFR的表达下调及恶性表型的抑制

目的利用反义RNA 抑制靶基因表达的策略,下调EGFR的表达而探讨对人类低分化鼻咽癌CNE-2细胞的恶性表型的抑制性效应。方法将人EGFR的N-端1.35kb片段反向构建入逆转录病毒表达载体pLXSN中,并用脂质体介导转染人鼻咽癌CNE-2细胞,G418筛选并分离阳性克隆,将两个EGFR 反义cDNA转染的克隆细胞命名为CNE-2/AS4 和CNE-2/AS8,而空载体转染的细胞命名为CNE-2/pLXSN。125I-EGF配体结合分析细胞膜上EGFR的表达,台盼蓝染色法测定细胞生长的改变,并用软琼脂集落形成实验检测细胞转化,最后,将筛选的各组阳性克隆细胞分别注射入裸鼠皮下,不同时间观察肿瘤生长的抑制改变及肿瘤的转移状况。结果配体结合实验结果显示,两个选择的克隆CNE-2/AS4 和CNE-2/AS8细胞表面EGFR的数量分别较未转染细胞CNE-2下降18%、45%,表明EGFR反义RNA的表达下调了细胞膜上EGFR的表达;同时,EGFR反义RNA表达的CNE-2细胞生长速率和软琼脂生长能力也较对照组细胞明显降低。注射入裸鼠皮下后,EGFR反义RNA表达的阳性克隆细胞表现出肿瘤生长减慢,淋巴结和肺转移能力也明显降低。结论这些实验结果提示EGFR 反义cDNA转染的CNE-2细胞能下调EGFR的过量表达并部分抑制鼻咽癌的恶性表型,这为进一步阐明EGFR在鼻咽癌的发生、演化中的功能作用提供了有用的工具     

EGFR反义RNA的转染对人类鼻咽癌CNE－2细胞EGFR的表达下调及恶性表型的抑制

目的 利用反义RNA抑制靶基因表达的策略，下调EGFR的表达而探讨对人类低分化鼻咽癌CNE-2细胞的恶性表型的抑制性效应。方法 将人EGFR的N-端1．35kb片段反向构建人逆转录病毒表达载体pLXSN中，并用脂质体介导转染人鼻咽癌CNE-2细胞，G418筛选并分离阳性克隆，将两个EGFR反义cDNA转染的克隆细胞命名为CNE-2／AS4和CNE-2／AS8，而空载体转染的细胞命名为CNE-2／pLXSN。125I-EGF配体结合分析细胞膜上EGFR的表达，台盼蓝染色法测定细胞生长的改变，并用软琼脂集落形成实验检测细胞转化，最后，将筛选的各组阳性克隆细胞分别注射人裸鼠皮下，不同时间观察肿瘤生长的抑制改变及肿瘤的转移状况。结果配体结合实验结果显示。两个选择的克隆CNE-2／AS4和CNE-2／AS8细胞表面EGFR的数量分别较未转染细胞CNE-2下降18％、45％，表明EGFR反义RNA的表达下词了细胞膜上EGFR的表达；同时，EGFR反义RNA表达的CNE-2细胞生长速率和软琼脂生长能力也较对照组细胞明显降低。注射入裸鼠皮下后，EGFR反义RNA表达的阳性克隆细胞表现出肿瘤生长减慢。淋巴结和肺转移能力也明显降低。结论这些实验结果提示EGFR反义cDNA转染的CNE-2细胞能下调：EGFR的过量表达并部分抑制鼻咽癌的恶性表型，这为进一步阐明：EGFR在鼻咽癌的发生、演化中的功能作用提供了有用的工具。     

BCSC-1基因异位表达抑制鼻咽癌细胞的恶性生物学行为

目的研究BCSC-1基因异位表达对人鼻咽癌细胞CNE-2L2恶性生物学行为的影响。方法RT-PCR扩增BCSC-1cDNA,分别构建原核重组表达载体pMAL-c2X-BCSC-1和真核重组表达载体pcDNA4/myc-HisA-BCSC-1。在原核细胞表达BCSC-1蛋白。用BCSC-1蛋白免疫新西兰白兔,制备BCSC-1抗血清。采用实时定量RT-PCR与用BCSC-1抗血清免疫荧光染色确认野生型CNE-2L2细胞的BCSC-1基因低表达。藉脂质体把pcDNA4/myc-HisA-BCSC-1转染入野生型CNE-2L2细胞。Westernblot检测BCSC-1基因在野生型CNE-2L2细胞异位表达。用体外培养中的生长曲线和集落生成检测细胞生长。接种细胞于裸鼠,定时测量肿瘤大小。小鼠肺做连续组织切片,观察肿瘤的肺转移。结果制备了BCSC-1抗血清。明确BCSC-1基因在野生型CNE-2L2细胞的表达极低。制备了BCSC-1基因异位表达的CNE-2L2细胞。与对照细胞(野生型CNE-2L2细胞和转染pcDNA4/myc-HisA的CNE-2L2细胞)相比,BCSC-1基因异位表达的CNE-2L2细胞在培养中的生长、集落生成、细胞的成瘤性生长和所长肿瘤的肺转移均明显抑制。结论BCSC-1基因异位表达对CNE-2L2细胞的恶性生物学行为有明显抑制作用。     

腺病毒介导siCD44实验性治疗人CNE-2L2鼻咽癌

目的探讨用siCD44治疗实体瘤的可能性。方法以高表达CD44的人鼻咽癌细胞CNE-2L2为研究对象,用软琼脂集落形成实验和细胞接种裸鼠后成瘤性生长及肿瘤肺转移检测细胞恶性生物学行为。构建Ad5-siCD44,用293细胞包装产生病毒。接种CNE-2L2细胞于裸鼠皮下,待肿瘤长到50～100mm3大小,瘤体内注射Ad5-siCD44,以注射PBS或Ad5-egfp为对照,2周后比较肿瘤的大小和重量。结果CD44表达抑制致细胞的恶性生物学行为明显受抑。瘤体内注射PBS、Ad5-egfp和Ad5-siCD442周后,肿瘤的平均体积分别为(3.139±0.850)、(3.612±0.888)和(1.512±0.742)cm3,实验组与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。3组的平均瘤重分别为(2.28±0.73)、(1.83±0.26)和(1.20±0.64)g,实验组与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。结论瘤体内注射Ad5-siCD44对CD44高表达的鼻咽癌细胞CNE-2L2所生成的肿瘤有一定治疗作用。     

淫羊藿苷激活抑制鼻咽癌CNE-2细胞存活、侵袭、迁移的体内外研究

【目的】探讨淫羊藿苷对鼻咽癌CNE-2细胞存活和侵袭迁移特性的影响。【方法】(1)体外研究:用不同浓度淫羊藿苷处理鼻咽癌CNE-2细胞,采用细胞计数试剂盒8(CCK8)测定细胞增殖能力以选择合适的剂量进行后续实验。采用Transwell实验观察细胞侵袭能力;划痕实验观察细胞迁移能力;蛋白免疫印迹法检测血管内皮生长因子(VEGF)、上皮钙黏附蛋白(E-cadherin)、神经性钙黏附蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)表达情况及信号通路蛋白Ca~(2+)/钙调蛋白依赖性的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化情况。并进一步观察单独或联合JNK抑制剂SP600125对JNK活化程度的影响,采用蛋白免疫印迹法检测细胞JNK磷酸化水平。(2)体内研究:建立鼻咽癌CNE-2荷瘤裸鼠模型,测定裸鼠移植瘤质量、细胞凋亡和移植瘤组织VEGF表达情况、MVD值。【结果】选择低细胞毒性10、20、50μmol/L剂量的淫羊藿苷进行后续实验。与空白对照组(淫羊藿苷0μmol/L)比较,淫羊藿苷10、20、50μmol/L组CNE-2细胞侵袭细胞数、划痕愈合率降低,细胞VEGF、N-cadherin、Vimentin表达水平明显降低(P 0.05),E-cadherin表达水平与CaMKⅡ、JNK的磷酸化水平升高(P 0.05),均呈剂量依赖性。淫羊藿苷(10μmol/L)可减弱JNK抑制剂SP600125对JNK磷酸化的抑制作用。与模型组比较,淫羊藿苷组鼻咽癌裸鼠存活率升高,移植瘤质量减小,移植瘤组织细胞凋亡率升高,VEGF表达水平、MVD值明显下降(P 0.05)。【结论】淫羊藿苷可促进CaMKⅡ/JNK通路激活来抑制鼻咽癌CNE-2细胞的存活、侵袭和迁移能力。     

盐酸千金藤碱抑制肝癌肾脏、睾丸转移及其分子机制

目的 通过裸鼠肝原位移植荧光人肝癌细胞,观察肝癌细胞肾脏、睾丸转移情况,并探讨盐酸千金藤碱抑制肝癌细胞转移及其分子机制.方法 采用慢病毒转染构建稳定表达荧光素酶基因的人肝癌细胞SMCC-7721-Luc.BALB/c裸鼠皮下接种SMCC-7721-Luc细胞,待肿瘤长至100 mm3左右,取皮下瘤植入裸鼠肝脏包膜,建立裸鼠原位肝癌模型.裸鼠腹腔注射盐酸千金藤碱,用小动物活体成像系统观察肝原位肿瘤肾脏、睾丸转移情况.给药21 d后,解剖取肿瘤组织,Western blot检测相关蛋白表达,同时取肝脏、肾脏、睾丸等组织,用10％中性甲醛固定,进行病理分析.结果 构建的SMCC-7721-Luc细胞能稳定表达Luc基因,裸鼠肝原位接种该细胞后产生较强、稳定的荧光.活体成像系统显示盐酸千金藤碱能抑制裸鼠原位肝癌向肾脏、睾丸转移,与其降低MMP-7和N-cadherin蛋白表达,上调E-cadherin蛋白表达有关.结论 盐酸千金藤碱通过调控MMP-7、N-cadherin和E-cadherin蛋白抑制原位肝癌向肾脏、睾丸转移.     

ER α-甘露糖苷酶表达降低引起大鼠肝脏上皮细胞微绒毛减少变短

目的：观察蛋白质糖基化改变对大鼠肝脏上皮细胞WB-F344表面微绒毛及在培养中生长的影响。方法：构建含正义或反义6A8 DNA的重建pAGX( )质粒,用脂质体法将重组质粒或空载质粒转染WB-F344细胞,作G418筛选,以有限稀释法作细胞克隆,进行PCR检测新霉素抗性（neo^H）基因以确定转染DNA在细胞基因组中的整合;用P-nitrophenyl-α-D-mannopyranoside作底物检测细胞匀浆上清中ER α-甘露糖苷酶的活性;采用扫描电镜观察细胞表面的微绒毛,并做生长曲线检测。结果：转染反义6A8的各WB-F344克隆细胞株的匀浆上清中,ER α-甘露糖苷酶活性有不同程度降低,其中以克隆AS1与AS2的降低最明显。克隆AS1与Con A结合增强,表面微绒毛减少、变短,细胞增殖减慢。结论：大鼠肝脏ER α-甘露糖苷酶表达抑制所致的蛋白质糖基化改变,可导致大鼠肝脏上皮细胞WB-F344微绒毛减少、变短,细胞生长速度减慢。     

HepG2细胞系皮下接种与肝原位接种成瘤的比较研究

目的 探讨皮下接种成瘤与原位接种成瘤在内环境不同情况下对肿瘤生长、侵袭转移能力的影响.方法 选取人肝癌细胞系HepG2进行体外培养.将BALB/c裸鼠随机分为皮下瘤接种、肝脏原位细胞接种两组.观察裸鼠成瘤率、裸鼠存活率、肿瘤生长速度、肿瘤病理学特点及远处脏器转移.结果 HepG2细胞体外生长状态良好,增殖活跃.皮下接种成瘤率100%,肿瘤呈结节状膨胀性生长,对周围组织有侵袭,但无转移.肝脏原位细胞接种组成瘤率100%,肿瘤呈结节状膨胀性生长,对周围肝组织和腹壁有侵袭,肝内转移率70%,肺转移50%.结论 HepG2细胞皮下和肝原位接种易成瘤,可用于肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)体内研究的实验模型.如果进行HCC的侵袭转移的机制及药物干预治疗等方面的研究,肝原位接种成瘤更能模拟人类肿瘤生长的条件.     

6A8α-甘露糖苷酶表达减弱和表达正常鼻咽癌细胞间的差异基因表达

目的发现因转导反义6A8 cDNA致恶性生物学行为减弱的人鼻咽癌细胞CNE-2L2(AS)和野生型细胞(W)间的差异表达基因.方法用DNA微列阵方法比较AS细胞和W细胞基因表达的差异.用Northern印迹和RT-PCR验证所得结果的可靠性.结果与W细胞相比,AS细胞有34个基因的表达上调,有42个基因的表达下调.其表达增强可能对肿瘤恶性行为有抑制作用的基因有P130mRNA for 130K protein、TGF-betaⅡR alpha、GABBR1、TGFBR1、TNFAIP1、STANIN、E-CADHERIN、CTNNA 1、CTNNA 2、RFX2及TMPO等,其表达减弱可能对肿瘤恶性行为有抑制作用的基因有CD44、NDRG1、TGFB1、RPS5、LEGUMAI、CBS、CD59及SNRPA1等.Northern印迹和RT-PCR验证了DNA微列阵方法检测的结果.结论与W细胞相比,AS细胞有34个基因表达上调,有42个基因表达下调,某些基因表达的改变可能与AS细胞恶性生物学行为的减弱相关.     

6A8 cDNA编码一种α-甘露糖苷酶

目的 探讨６Ａ８ ｃＤＮＡ编码的蛋白质的性质。方法 依据Ｃｏｎ Ａ的配体是基露糖,而α－甘露糖苷酶的作用是剪细胞糖蛋白聚糖中苷露糖的原理,采用细胞免疫荧光染色法以及激光共聚焦显微镜观察经转染６Ａ８ｃＤＮＡ正义或反义重组表达载体后,细胞结合ＣｏｎＡ的强弱,验证６Ａ８ｃＤＮＡ编码的蛋白质是否为一种α－甘露－糖苷酶。结果 ＣＯＳ－６ 人鼻咽癌细胞株ＣＮＥ－２Ｌ２转染ｐＲｃ／ＣＭＶ－正交６Ａ８ｃＤＮＡ后与     

TGIF,MMP9和VEGF蛋白在胃癌中的表达及临床病理联系

目的：探讨TGIF，MMP9和VEGF蛋白在胃癌中的表达及其临床病理联系。方法：运用连续切片HE染色法观察SGC-7901细胞、PcDNA3．1转染细胞和TGIF转染细胞荷瘤裸鼠瘤组织有无血管浸润和远处转移，同时以免疫组织化学法分析转移相关分子MMP2，MMP9和VEGF在裸鼠瘤组织中的表达变化，并分析TGIF，MMP9和VEGF蛋白在76例胃癌组织中的表达水平及其临床病理联系。结果：3种细胞的荷瘤裸鼠均无远处转移，SGC-7901细胞和PcDNA3．1转染细胞接种组裸鼠瘤组织有癌栓形成，但TGIF组无癌栓形成；对照组MMP9和VEGF均呈强阳性表达，表达水平明显高于TGIF组，但MMP2在3组间的表达无明显差别。胃癌组织中TGIF蛋白表达阳性，阳性率为46．1％（35／76），明显低于断端胃黏膜（78．1％）（P〈0．05），且它的低表达与淋巴结转移有关（P〈0．05）。MMP9表达阳性率为59．2％，明显高于断端胃黏膜（31.3％）（P〈0．05），且其高表达与淋巴结转移有关（P〈0．05）。VEGF蛋白的阳性表达率为56．6％，明显高于断端胃黏膜（31．3％）（P〈0．05），且其表达与淋巴结转移和胃癌的浸润深度密切相关（P〈0．05）。TGIF与VEGF和MMP9蛋白的表达呈负相关（P〈0．05）。结论：TGIF可能通过下调VEGF和MMP9蛋白的表达抑制胃癌的转移。     

白藜芦醇对鼻咽癌转移能力的影响及其分子机制

目的 研究白藜芦醇对鼻咽癌细胞侵袭、迁移能力的影响及其分子机制。方法 （1）不同浓度白藜芦醇处理鼻咽癌CNE2细胞24、36、48 h,CCK8实验检测白藜芦醇对CNE2细胞增殖的抑制作用,确定适宜的浓度和时间以进行后续实验;（2）不同浓度白藜芦处理鼻咽癌CNE2细胞24 h:Transwell实验检测鼻咽癌细胞的侵袭、迁移能力;Western Blot实验检测与鼻咽癌转移相关的蛋白的表达水平;免疫荧光实验检测鼻咽癌细胞中NF-κB/p65的核转位情况;（3）裸鼠足掌皮下注射鼻咽癌CNE2细胞建立鼻咽癌原发灶模型,不同剂量白藜芦醇灌胃,观察腘窝淋巴结肿大情况,HE染色和免疫组织化学染色检测裸鼠腘窝淋巴结的转移情况。结果 （1）CCK8实验发现,白藜芦醇对鼻咽癌CNE2细胞的增殖具有抑制作用,且作用呈浓度和时间依赖性（24,40μmol/L,48 hμmol/L,P <0.01;24,80μmol/L及以上,36,40μmol/L及以上,P <0.001;36 h,20μmol/L,P <0.05,36,40μmol/L及以上P <0.001）;(2)Transw...