人脐血内皮祖细胞体内促进血管重建的实验研究

目的：通过观察人脐血内皮祖细胞（EPC）在裸鼠体内缺氧状态下分化成内皮细胞的现象，初步研究其促进血管重建的作用。方法：根据EPC表面标记CD133，采用免疫磁珠法分离培养EPC。设计EPC裸鼠成瘤实验，观察瘤体内血管增生情况；将荧光标记的EPC注射于裸鼠腹部皮瓣中，观察EPC参与皮瓣血管重建情况；将EPC接种于聚羟基乙酸（PGA）中，移植于裸鼠皮下，观察EPC参与血管重建。结果：原代EPC贴壁后呈梭形，从第7天开始数量明显增加，呈克隆状生长。透射电镜观察到成熟内皮细胞最具特征性的细胞器——weibel-Palade小体。裸鼠成瘤实验：抗人vWF免疫荧光显示大量EPC参与肿瘤血管生成；裸鼠皮瓣实验：荧光标记EPC参与裸鼠皮瓣血管生成；PGA移植实验：抗人vWF免疫酶组织化学染色显示EPC参与血管生成。结论：EPC参与血管重建，具有促进血管新生，加速缺血组织血管化的作用。     

人脐血细胞体外扩增的实验研究和意义

目的：了解脐血造血干细胞在体外扩增培养过程中的生长分化特点,探讨脐血干细胞与体外扩增后的祖细胞混合移植的可行性以及合适的移植时机。方法：按种脐血单个核细胞（MNC）于含体积浓度为20％胎牛血清（FCS）的IMDM悬浮培养体系中,加入干细胞因子（SCF）、Flt-3配基（FL）、粒－单细胞集落刺激因子（GM－CSF）、白细胞介素－3（IL－3）、白细胞介素－6（IL－6） ,培养21d,每周半量换液,同时进行细胞计数,涂片形态学观察,粒－单系祖细胞（CFU－GM）、红细祖细胞（BFU－E）集落培养,细胞表面CD34^ 、CD33^ 、CD3^＋、CD19^＋标记和细胞增周期的动态观察。结果 培养7d时的脐血细胞,CFU－GM、BFU－E集落形成最多,之后逐渐减少,21d时已低于培养前水平。CD34^ 细胞比例在培养后7d达高峰,14d开始下降;CD33^＋细胞比例在培养后7－14d达高峰,21d时开始下降;CD3^ 、C CD19^ 细胞比例均在培养第7d时显著下降,并持续低水平至21d。培养7d后G0期细胞比例明显减少,S期细胞快速增高,至21d时仍有较高比例。培养第21d的细胞涂片见少量中、晚幼粒细胞。结论：理论上脐血干细胞与扩增后的祖细胞混合移植用于成人具有可行性,体外扩增培养7d左右是混合移植的最佳时机。     

血管内皮生长因子和雌二醇促进血管内皮祖细胞分化生成血管的对比研究

目的：对比研究常规剂量下血管内皮生长因子（VEGF）和雌二醇对血管内皮祖细胞（EPCs）分化生成血管的促进作用。方法：分离培养人外周血EPCs,与基质胶混匀后注射到9只裸鼠双侧下腹部,另设2只注射等体积培养液与基质胶的混合液。将9只注射细胞的裸鼠随机分为3组,每组分别定期局部注射VEGF、雌二醇,生理盐水,定期观察记录血管组织块的生长状况。移植6周后取材,测量计算血管组织块的体积、HE染色观察血管组织块的血管增殖状况,各组之间进行对比。结果：给药组血管组织块体积与注射生理盐水组相比,具有显著性差异,体积明显偏大,而给药组之间体积未见显著性差异。HE染色观察可见各组的血管组织块内血管增殖明显,血管排列紊乱的,管腔大小不一。给药组血管密度明显大于注射生理盐水组,而给药组之间的血管密度差异较小。结论：VEGF和雌二醇组具有促进EPCs分裂增殖形成血管的能力,常规剂量下两者促进EPCs分裂增殖生成血管的能力无显著性差异。     

大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞的体外培养和鉴定

目的探索大鼠骨髓来源的血管内皮祖细胞（EPCs）的体外培养、诱导分化及鉴定方法。方法采用密度梯度离心法从Wistar大鼠骨髓中分离出骨髓单个核细胞,并在诱导培养基（EGM-2MV）中培养,贴壁筛选法分离,诱导分化为EPCs;观察EPCs的生长分化过程,对其形态、表型、功能加以鉴定。结果培养3 d,细胞贴壁较为完全,第4天换液后,细胞呈现克隆样生长,第7～8天形成类似成熟血管内皮细胞形态,呈现典型的"铺路石"样外观;诱导培养第7、10天的贴壁细胞CD34、Flk-1及CDl33染色均呈阳性;荧光显微镜下观察,DIL-ac-LDL和FITC-UEA-1双荧光染色的细胞数占贴壁细胞数的75%以上。结论采用密度梯度离心法获得骨髓单个核细胞,在培养液中贴壁培养,可以扩增出具有典型特征的EPCs。     

同时携带人血管内皮生长因子和血管生成素基因的内皮祖细胞血管再生研究

目的用腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）载体将人血管内皮生长因子165 （vascular endothelial growth factors,VEGF165）和血管生成素-1（angiopoietin-1,Angl）基因同时转入骨髓源性内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）中,观察外源基因的表达并评价其促血管再生的能力。方法用同时携带人VEGF165和Angl基因的AAV载体AAV2-hAngl/VEGF165转染体外培养的兔骨髓源EPCs,用RT-PCR和细胞免疫化学法检测外源基因的表达。实验用新西兰大白兔24只,制作成右下肢缺血模型,随机分成3组：PBS、EPC和EPC/AV组。造模后第10天,向缺血肌组织中分别注射PBS、EPCs和AAV2-hAngl/VEGF165转染的EPCs,用免疫组织化学法评价其血管再生效应。结果EPCs可高效地被AAV2-hAngl/VEGF165转染而表达Angl和VEGF165。细胞移植4周后,EPC/AV组存活的EPCs密度（283±137）/mm^-2明显高于EPC组（191±88）/mm^-2;EPC/AV组的毛细血管密度（856±212）/mm^-2明显高于EPC组（564±177/mm^-2）和PBS组（308±112）/mm^-2;α-SMA阳性血管密度（6.9±3.0）/mm^-2明显高于PBS组（3.6±1.8）/mm^-2,P〈0.05。结论AAV载体可同时将人VEGF165和Angl基因转入EPCs中,转染后的EPCs具有更强的促血管再生能力。     

血管内皮生长因子基因转染血管内皮祖细胞治疗肢体缺血的实验研究

目的利用血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF-165）基因转染体外诱导的血管内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）,并移植到下肢缺血的新西兰兔体内,观测其促进血管新生,改善肢体缺血的效果。方法（1）梯度离心法分离兔骨髓单个核细胞,然后用含有VEGF、bFGF、IGF-1的M199培养液诱导培养EPCs。并以免疫荧光、透射电镜等方法进行鉴定。（2）用携带VEGF165基因的腺病毒质粒（Adv-GFP-VEGF165）转染所培养的细胞,ELISA法检测上清液中VEGF蛋白的表达。（3）制作兔下肢缺血模型,并将其随机分为A、B、C 3组,分别移植EPCs、VEGF165基因转染后的EPCs、M199培养基,多种方法检测移植效果及局部整合情况。结果（1）自兔骨髓诱导出梭形贴壁细胞,免疫荧光及电镜检测证实为EPCs。（2）Adv-GFP-VEGF165成功转染EPCs,ELISA法检测转染VEGF165后的EPCs其上清液中VEGF蛋白浓度明显升高。（3）Brdu示踪显示移植细胞整合到缺血局部,CTA及免疫组化检查显示VEGF-165基因转染后的EPCs移植后其改善肢体缺血效果优于其他两组。结论VEGF基因转染EPCs后能改进EPCs质量,移植后促血管新生能力增强,其效果优于未转染组。     

VEGF基因转染血管内皮祖细胞的实验研究

目的:探讨血管内皮生长因子（VEGF）基因转染血管内皮祖细胞（EPCs）的方法及效果。方法:取生长活跃的EPCs,分别转染不同浓度的携带VEGF-165基因的腺病毒质粒（Adv-GFP-VEGF165）（转染组）及空质粒（Adv-GFP）（空质粒组）,并设空白对照组。荧光显微镜下观察转染效果,MTT法检测不同病毒滴度时细胞增殖情况;ABC-ELISA法检测上清液中VEGF蛋白表达情况。结果:转染组镜下观察到大部分细胞呈现绿色荧光。病毒滴度为1∶100的转染会导致细胞生长停滞,并造成细胞损害; 1∶50的转染后对细胞增殖无明显影响。ELISA检测证实转染组上清液中VEGF蛋白浓度明显高于空质粒组及空白对照组（P<0.01）。结论:以腺病毒为载体的VEGF基因转染EPCs是可行的,1∶0是合适的转染比率,转染后上清液中VEGF蛋白表达明显增加。     

内皮祖细胞体外侵袭肝癌及成管能力的研究

目的 探讨小鼠骨髓源性血管内皮祖细胞(EPCs)体外形成管腔样结构和侵袭H22肝癌细胞的可能性和条件.方法 密度梯度离心法获取小鼠骨髓中单个核细胞,利用序列差速贴壁方法(依次在培养1 h和24h后提取上清液中细胞)诱导培养,噻唑蓝(MTY)比色法检测在1、3、7、10、13、16、20d的细胞增殖能力,从细胞形态、免疫荧光、细胞免疫表型对培养细胞进行鉴定并观察培养1周后细胞的体外形成管腔结构及侵袭肝癌细胞的能力.结果 EPCs在1周内呈集落样生长,1周后"鹅卵石"样结构;能吞噬低密度脂蛋白和膜连接荆豆凝集素,双染阳性率(96.46±1.74)%;EPCs表达CD34(91.23±3.76)%、血管内皮生长因子受体(VEGFR)-2(92.85±2.12)%,但CD133(61.54±13.71)%;EPCs在能够形成管腔样结构(26.6±13.4)/高倍镜(×100);并向肿瘤细胞富集.结论 小鼠骨髓中富含EPCs,利用序列差速贴壁方法得到较高纯度EPCs,并表现成血管倾向、侵袭肿瘤组织的能力.

Abstract：

Objective To investigate the possibilities and terms of endothelial progenitor cells (EPCs) derived from mouse bone marrow forming the tube and invading the hepatocellular carcinoma cells H22 Clusters. Methods Bone marrow mononuclear cells were gained by density-gradient centrifugation.After culture for 1 h and 24 h, the nonadherent cells were extracted with the method of sequence of differential adhesion and then were induced by EGM-2 medium. Cell multiplication was tested by methyl thiazol tetrazolium (MTT) chromatometry at 1, 3, 7, 10, 13, 16, 20 days. The cells were identified by cell morphology, immunofluorescence and flow cytometry analysis, and the abilities of forming the tube and invading the hepatocellular carcinoma cells were observed after culture for 1 week. Results The EPCs grew as colony-forming units within 1 week and as cobblestones after 1 week. The cells could phagocytize the lowdensity lipoprotein and membrane binded Ulex Europaeus agglutinin with double-positive percentage (96. 46 ± 1.74)%. The positive expression rate of CD34 and vascular endothelial growth factor receptor (VEGFR)-2 was (91.23 ±3.76)% and (92. 85 ±2. 12)% respectively, and that of CD133 was (61.54 ± 13.71)%. EPCs could form tubes and recruit to the tumor cells. Conclusion EPCs were rich in mouse marrow and could be obtained by means of sequence of differential adhesion. The EPCs can form tubes and invade the malignant cell cluster.     

人脐血来源内皮祖细胞促进裸鼠皮瓣存活的实验研究

目的将内皮祖细胞（endothelial progenitor cell，EPC）引入皮瓣缺血组织中，初步研究其生物学特性及在皮瓣缺血组织中促血管发生的作用。方法采用免疫磁珠法从人脐血中分离培养CD133＋内皮祖细胞，将体外扩增的EPC局部注射于裸鼠超长皮瓣模型中，观察EPC转归及参与皮瓣血管重建的情况；通过观察皮瓣坏死面积及微血管增生情况，评价EPC在皮瓣缺血组织中再血管化能力。结果EPC组皮瓣坏死面积明显小于空白组（P〈0．05）、真皮下层组织灌流量大于对照组（P〈0．05）；荧光示踪及免疫组织化学染色证实EPC参与皮瓣血管重建。结论EPC参与血管重建，具有促进血管新生，加速缺血组织血管化的作用。     

人外周血内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定

目的:研究人外周血内皮祖细胞的分离、培养、扩增和鉴定方法.方法:采用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,用EGM-2培养基在多聚赖氨酸包被的培养板中进行诱导培养,动态地观察贴壁细胞的生长状况,免疫组织化学技术检测培养细胞表面标志物的表达.结果:人外周血单个核细胞经体外培养至第2天,呈贴壁生长,细胞形态为大小相近的圆球体；第4天一些细胞开始出现尾状物,形态呈蝌蚪样改变,部分细胞聚集形成细胞簇；至第7天细胞形态变长,呈梭形改变,细胞间相互围绕呈环形,并有集落出现,免疫组织化学染色CD133、CD34、VEGFR-2和Ⅷ因子表达均呈阳性.结论:运用本实验方法可以成功实现人外周血内皮祖细胞的分离、培养和扩增.     

鼠外周血内皮祖细胞体外培养鉴定与诱导分化

目的探讨鼠外周血来源的血管内皮祖细胞（EPCs）体外培养鉴定及诱导分化的方法。方法从鼠外周血中分离获取EPCs,进行体外培养扩增,并在培养液中添加VEGF及bFGF,采用免疫组织化学技术和流式细胞仪进行EPCs的细胞表面标志物检测。结果培养3-4d,可观察到梭形贴壁细胞,14d左右贴壁细胞呈条索状结构,贴壁细胞是表达血管内皮细胞的特异性标志。结论鼠外周血中含有EPCs,在一定条件下,可分化成血管内皮细胞。     

鼠外周血内皮祖细胞体外培养鉴定与诱导分化

目的探讨鼠外周血来源的血管内皮祖细胞(EPCs)体外培养鉴定及诱导分化的方法。方法从鼠外周血中分离获取EPCs,进行体外培养扩增,并在培养液中添加VEGF及bFGF,采用免疫组织化学技术和流式细胞仪进行EPCs的细胞表面标志物检测。结果培养3~4d,可观察到梭形贴壁细胞,14d左右贴壁细胞呈条索状结构,贴壁细胞是表达血管内皮细胞的特异性标志。结论鼠外周血中含有EPCs,在一定条件下,可分化成血管内皮细胞。     

人脐血来源内皮祖细胞的纯化鉴定及定向分化的研究

目的 检测CD133^＋血管内皮祖细胞（EPC）的细胞表面标志物，鉴定其生物学特性。方法 采用免疫磁珠法分离人脐血EPC，用EGM-2MV培养基[含表皮生长因子（EGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、成纤维细胞生长因子（FGF）2等具有诱导分化作用的细胞因子]进行体外培养。应用流式细胞术、免疫组织化学等方法检测CD133^＋细胞的比例、原代EPC的生长曲线及生长特性。透射电镜查找Weibel-Palade小体。同时设计EPC裸鼠成瘤实验，观察瘤体生长及血管增生情况，以鉴定EPC的生物学特性。结果 CD133^＋细胞在免疫磁珠分离前后的比例各为0．91％及85．52％。EPC原代培养时细胞形态正常、密度均匀，前3d为相对抑制期，此后快速增殖，10d后达80％～90％融合。EPC生长曲线显示，接种后5d内细胞数量无明显变化，从第7天开始明显增加，第17天达高峰。光学显微镜下可见，原代EPC贴壁后呈梭形，接种后7d数量明显增加，呈克隆状生长。透射电镜观察到，细胞膜伸出许多伪足丝，基底膜呈多层；细胞质内可见一种短棒状小体，含平行管状的内部结构，即Weibel-Palade小体，确定其为EPC。裸鼠成瘤实验可见EPC组肿瘤瘕体及血管数量大于或多于对照组；抗人血管性假血友病因子（vWF）免疫荧光染色显示，大量EPC参与肿瘤血管生成。结论本实验分离培养的CD133^＋细胞具有分化为成熟血管内皮细胞的能力，即为EPC。裸鼠成瘤实验初步证明EPC参与血管重建，具有促进血管新生、加速缺血组织血管化的作用。     

人脐血CD133+血管内皮祖细胞的培养、鉴定与分化研究

目的探讨从人脐血中分离、体外培养CD133^＋血管内皮祖细胞（EPCs）的方法及其生长特性和鉴定。方法采用密度梯度离心法结合MACS分选法提取人脐血中CD133^＋细胞,进行流式细胞仪检测纯度,予EBM-2培养液接种培养,观察其生长特性;利用Dil-LDL及FITC-Lectin摄取实验、细胞免疫组织化学等进行鉴定。结果经流式细胞仪检测CD133^＋细胞平均占单核细胞的（1．13±0．10）％,磁珠分选所得CD133^＋细胞平均纯度为（91．45±1．04）％;CD133^＋细胞贴壁生长,可分化为梭形血管内皮细胞及形成集落;CD133^＋细胞培养过程中Dil-LDL及FITC-Lectin摄取阳性,双染阳性率为（95．83±1．72）％;CD133^＋细胞培养1周后经免疫组织化学检测CD34、Ⅷ因子阳性率分别为（95．83±2．23）％和（95．92±1．43）％,与人脐静脉内皮细胞比较差异无统计学意义;CD133^＋细胞体外培养4d、1周可形成小血管结构。结论免疫磁珠分选法可获取较高纯度CD133^＋血管内皮祖细胞,在生长因子作用下诱导其分化为成熟血管内皮细胞。     

Functional endothelial progenitor cells from cryopreserved umbilical cord blood

Umbilical cord blood (UCB) is recognized as an enriched source of endothelial progenitor cells (EPCs) with potential therapeutic value. Because cryopreservation is the only reliable method for long-term storage of UCB cells, the clinical application of EPCs depends on our ability to acquire them from cryopreserved samples; however, the feasibility of doing so remains unclear. In this study we demonstrate that EPCs can be isolated from cryopreserved UCB-derived mononuclear cells (MNCs). The number of outgrowth EPC colonies that emerged in culture from cryopreserved samples was similar to that obtained from fresh UCB. Furthermore, EPCs obtained from cryopreserved MNCs were phenotypically and functionally indistinguishable from freshly isolated ones, including the ability to form blood vessels in vivo. Our results eliminate the necessity of performing cell isolation procedures ahead of future clinical needs and suggest that EPCs derived from cryopreserved UCB may be suitable for EPC-related therapies.     

人脐血间充质干/祖细胞诱导为心肌样细胞的实验研究

目的　了解脐血间充质干 /祖细胞用于心肌细胞再生的可行性 ,并探讨其最佳的诱导培养条件。方法　将脐血单个核细胞置于低血清 (2 % )DMEM培养基中生成贴壁细胞层 ,依传代方法 ,用相同培养条件进行扩增 ,扩增后的贴壁细胞置入心肌诱导培养液中 ,并添加 5 氮杂胞苷进行诱导分化、采用心肌特异性收缩蛋白 肌钙蛋白T染色鉴定被诱生的心肌样细胞。结果　脐血间充质干 /祖细胞克隆在脐血单个核细胞中出现频率为 0 .5× 10 -6,在传 2 0代时 ,可有效扩增 1.3× 10 7倍 ,诱导后 ,70 %的脐血间充质干 /祖细胞分化为心肌样细胞。结论　采用上述扩增与诱导条件 ,脐血间充质干 /祖细胞可得到有效扩增 ,并可高效向心肌样细胞分化。     

Differentiation and proliferation of endothelial progenitor cells from canine peripheral blood mononuclear cells

BACKGROUND: The isolation, differentiation, and expansion of endothelial progenitor cells (EPCs) from peripheral blood have potential applicability in areas of therapeutic neovascularization, vascular repair, and tissue engineering. The purpose of the current study was to elucidate a simple method of isolation and differentiation of EPCs by defining the endothelial morphology, surface marker expression, and proliferative capacity of EPC outgrowth from canine peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). MATERIALS AND METHODS: PBMCs were isolated from fresh canine blood and cultured in fibronectin-coated plates in which EPCs were identified from cell morphology and outgrowth characteristics. Cell surface markers were determined with flow cytometry analysis to identify differentiation of cultured and subcultured colonies. A hematologic counter with phase contrast microscopy was used to study cell growth curves of EPCs as compared with mature human coronary artery endothelial cells. RESULTS: During the first week of canine PBMC culture, cells were morphologically round and varied in size, but in the course of the second and third week of culture, the cells, respectively, became spindle-shaped and displayed an endothelium-like cobblestone morphology with outgrowth. CD34 was significantly decreased at 21 days as compared with 7 days culture (36.04% to 21.37%), whereas vWF (from 77.26% to 96.37%) and eNOS (from 0% to 14.97%) were significantly increased. VEGFR-2 was slightly increased, and P1H12 (CD146) was unchanged. Subcultured canine EPCs displayed a higher proliferation rate as compared to mature human coronary artery endothelial cells in the same culture conditions. CONCLUSIONS: These data demonstrate that canine EPCs can be isolated and cultured from the canine PBMC fraction. These outgrowth cells displayed characteristics of endothelial morphology with endothelial cell-specific surface markers. Furthermore, it was revealed that canine EPCs have a greater growth potential as compared to mature endothelial cells. This study suggests that PBMCs could be used as a source of EPCs for potential applications in tissue engineering and vascular therapy.     

EphrinA1在肝细胞癌患者内皮祖细胞中的表达及其临床意义

目的了解肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）患者外周血中手术前后内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）的数量及其内包含的EphrinA1 mRNA的表达变化情况和临床意义。方法应用流式细胞术（FCM）检测手术前组、手术后组和健康对照组外周血中EPCs的含量,同时分离培养三组研究对象外周血中的EPCs,用RT—PCR检测EPCs上EphrinAl的表达情况,进行统计学分析。结果肝癌患者手术前组外周血中EPCs的数量明显高于手术后组和健康对照组（P〈0．05）,EphrinA1在肝癌患者手术前组外周血EPCs中存在表达,明显高于手术后组和健康埘照组（P〈0．05）,而在手术后组和健康组问差异无统计学意义。结论肝癌患者外周血中的EPCs明显增加,同时其内的EphfinA1表达增高,提示EphrinA1可能在EPCs的增殖动员中起到重要作用．     

人脐血内皮祖细胞治疗裸鼠心肌梗死

目的 探讨人脐血内皮祖细胞(EPCs)移植治疗裸鼠心肌梗死的可行性.方法 采用淋巴细胞分离液提取人脐血单个核细胞(MNCs),应用添加诱导因子的培养基于体外诱导分化并于培养7 d后进行鉴定.采用20只裸鼠建立心肌梗死模型后,将体外诱导分化7 d并摄取CM-Dil的内皮祖细胞通过尾静脉注射进行细胞移植到实验组,对照组注射培养基.2周后计数心梗区域新生毛细m管密度及心梗面积并于荧光显微镜下观察新生血管的荧光.结果 体外诱导7 d后贴壁细胞CD34阳性率达(50.48±5.17)%,CDl33阳性率达(19.12±4.37)%.实验组平均梗死面积为(8.27±1.64)%,对照组为(14.30±2.84)%(t=-4.78,P<0.05);实验组每高倍视野平均新生血管密度为14.29±1.38,对照组为10.17±1.72(t=4.71,P<0.01);行荧光显微镜下观察实验组新生血管有红色荧光.讨论人脐血单个核细胞在体外诱导分化为内皮祖细胞,进行细胞移植到建立心梗模型的裸鼠后可在心梗区域形成新生血管,从而并改善梗死部位心脏功能.