脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞共同培养建立血脑屏障模型

目的：建立能够模拟在体血脑屏障的体外模型。方法：培养大鼠脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞，用免疫组织化学染色的方法鉴定细胞，分别接种两种细胞于多聚酯多孔膜的两面，相关显微镜及HE染色观察细胞在多聚酯膜上的生长情况。结果：培养的脑微血管内皮细胞多数为梭形铺路石样外观，而星形胶质细胞呈具有多个突起的典型形态，免疫组织化学染色鉴定细胞的纯度分别在90％和95％以上，两种细胞能够以单层细胞的形式生长于多聚酯多孔膜的两面。结论：通过脑微血管内皮细胞和星形胶质细胞共同培养能够形成与在体血脑屏蔽类似的结构，是一种建立血脑屏障模型的可行方法。     

血脑屏障体外模型的建立与评价

血脑屏障由脑微血管内皮细胞、星形胶质细胞（astrocyte,As）足突、基底膜及周皮细胞组成.脑微血管内皮细胞是BBB主要结构基础,As对维持BBB的完整性起重要作用].本研究采用人脐静脉内皮细胞（HUVEC）与小鼠As共培养构建BBB体外模型,并对其形态及屏障功能进行鉴定,以期成为体外研究物质（包括药物）经BBB通透的一种简便而可靠的工具.     

血脑屏障结构功能及体外模型的研究进展

<正>血管与脑、脊髓细胞外液之间存在的一个调节界面,即脑屏障。由血脑屏障(BBB)、血一脑脊液屏障(BCSFB)和脑脊液一脑屏障共同组成。脑屏障仅允许必需的代谢物质进入,阻止和移除不需要的代谢产物或毒性物质^([1]),使中枢神经系统能够在脑外环境不断动态变化的情况下,保持神经组织的正常活动及内环境的稳定([1]),使中枢神经系统能够在脑外环境不断动态变化的情况下,保持神经组织的正常活动及内环境的稳定^([2])。3个屏障中,BBB最为重要。BBB是血液和CNS之间物质交换的基础并具有精密的解剖结构,其完整性无论是在生理还是病理情况下都是极其重要的。BBB具有诸多重要作用,包括为脑部必需营养物质提供运输通道,调节代谢产物的流出,限制离子和液体在血液与脑之间的运输等。     

体外血脑屏障模型的建立及发展

1885年德国人Paul Ehrlich第一次证明了脑血管的通透性与非神经性血管不同,其后的研究者们相继认识到血和脑之间有屏障存在,并称之为血-脑屏障(blood-brain barrier,BBB).血脑屏障是一个以脑微血管内皮细胞(brain micro-vascular endothelial cell,BMEC)、星形胶质细胞(Astrocyte)和周细胞(Pericyte)共同构成的结构的和功能的屏障,它调节分子进出大脑以维持神经的微环境.脑微血管内皮细胞以细胞间的紧密连接(tight junction,TJ)为主要特征、缺少窗口结构、低胞饮作用、无Weible-Palade小体,这些其他血管内皮细胞所不具备的特征,使其成为BBB的主要结构基础,也是BBB的功能基础,可以保护大脑不被血液内的微生物和毒素的伤害.     

大鼠脑皮质星形胶质细胞体外培养方法的改进

目的改进大鼠脑皮质星形胶质细胞体外培养方法,获得纯度较高的大鼠脑皮质星形胶质细胞。方法取出生后1d内SD大鼠大脑皮质,用机械吹打法使细胞分散制成初细胞悬液,10μm尼龙膜过滤除去成纤维细胞后接种。待7d细胞铺满瓶底后,"十"字形震荡培养液5min后传代接种。传代2次后行GFAP免疫组化染色鉴定。结果通过微孔尼龙膜过滤和传代前"十"字形震荡培养液等操作可以得到形态典型、纯度较高的星形胶质细胞。通过纯度计算可得离体培养的星形胶质细胞的纯度平均值为95.49%(n=6)。结论改进的星形胶质细胞体外培养方法,降低了实验操作难度,方法稳定有效,得到的星形胶质细胞纯度较高。     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的:探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础.方法:用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养;用光镜、电镜及免疫组化检测进行鉴定.结果:分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养一周左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,透射电镜可见Weibel-Palade小体.第Ⅷ因子相关抗原免疫组化测定阳性.结论:该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞.     

大鼠脑微血管内皮细胞的培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞体外培养方法,为血管内皮细胞的研究打下基础。方法用胶原酶消化大鼠脑皮质制成细胞悬液再进行培养,用光镜及免疫组织化学检测进行鉴定。结果分离的大鼠脑微血管内皮细胞体外培养5～7d左右可长成单层,光镜下为多角形或扁平梭形,呈"铺路石样"排列,第Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学测定阳性。结论该分离细胞培养法可培养出大鼠的脑微血管内皮细胞。     

体外血脑屏障模型的建立

目的:利用自发转化的人脐静脉内皮细胞系ECV304和分离纯化的大鼠星形胶质细胞共培养试图建立一种具有重复性好、细胞纯度高、培养操作简便、接近在体状态的体外血脑屏障模型。方法:分3步:(1)分离纯化培养大鼠星形胶质细胞;(2)建立体外血脑屏障BBB模型(内皮细胞系/星形胶质细胞非接触共培养);(3)模型鉴定。结果:利用ECV304与原代培养的星形胶质细胞共培养建立的血脑屏障模型无论是在形态学、屏障功能上还是内皮细胞的特异性标志物的表达水平上都与在体血脑屏障的特性相似。结论:可以利用ECV304与原代培养的星形胶质细胞共培养建立体外血脑屏障模型。     

大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法建立及鉴定

目的：纯化和鉴定体外培养的大鼠大脑皮层星形胶质细胞.方法：取1~3天新生大鼠大脑皮层细胞进行体外培养,通过差速贴壁和传代去除成纤维细胞和神经元等,采用免疫组化法检测星形胶质细胞特异性蛋白—胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein,GFAP）鉴定星形胶质细胞.结果：培养的细胞具有典型的星形胶质细胞形态且生长旺盛,第3代95%以上为星形胶质细胞,特异性抗原GFAP表达阳性.结论：该方法操作简单,可靠,是一种有效的新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞体外培养方法.     

大鼠原代脑微血管内皮细胞体外分离与培养的实验研究

目的 探讨获取大鼠脑微血管内皮细胞(BMEC)的简单、有效方法,为构建体外血肿瘤屏障(BTB)模型提供材料.方法 采集出生3～5 d的Wistar胎鼠大脑皮质,应用酶消化法及葡聚糖离心法获得脑微血管段后,接种于培养皿中进行原代培养,采用倒置显微镜对所培养的细胞进行形态学观察;以Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色法鉴定细胞;将BMEC与C6脑胶质瘤细胞共培养,构建体外BTB模型,并采用免疫组化法和免疫荧光法检测BMEC间紧密连接相关蛋白occludin的表达.结果 体外培养2h时脑微血管段贴壁,12～48 h见圆形生发中心形成,2～3d单层内皮细胞自生发中心长出,4～5 d见较大单层内皮细胞团,5～7 d可见融合成片的内皮细胞单层,外观呈“铺路石”样;第Ⅷ因子免疫组化结果显示“铺路石”样细胞胞质呈棕黄色染色;紧密连接相关蛋白occludin的免疫组化和荧光结果证明共培养的BMEC间表达BTB的特性.结论 本方法能成功地进行大鼠原代BMEC培养,构建大鼠体外BTB模型,进而应用于BTB的生理、生化及药理学研究.     

洛美利嗪对大鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白功能的影响

目的：研究洛美利嗪对大鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白功能的影响。方法：使用荧光分光光度计和流式细胞术分析大鼠脑微血管内皮细胞内P-糖蛋白底物-罗丹明123的荧光强度。结果：环孢素A和洛美利嗪与大鼠脑微血管内皮细胞孵育后能明显提高胞内罗丹明123的荧光强度。人脐静脉内皮细胞内荧光强度则不受环孢素A和洛美利嗪的影响。结论：洛美利嗪能显著地抑制大鼠脑微血管内皮细胞上P-糖蛋白的活性,提高P-糖蛋白底物的胞内浓度。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养与鉴定

目的探讨大鼠脑微血管内皮细胞培养方法。方法 5～7 d龄SD大鼠脑皮质用胶原酶消化得到脑微血管段后,接种于培养瓶进行原代培养。培养的细胞采用倒置显微镜进行形态学观察,免疫荧光法鉴定Ⅷ因子相关抗原,MTT法测定细胞活力。结果倒置显微镜下细胞呈单层＂铺路石样＂排列的典型特征;Ⅷ因子相关抗原免疫荧光检测得阳性细胞率达95%;MTT法测定结果显示第120 h细胞活力最强。结论该培养方法能成功地分离并培养出纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞,对更深入地研究脑微血管内皮细胞的生物学特性及功能具有重要意义。     

建立体外血脑脊液屏障模型方法学研究

目的：采用原代分离培养Sprague-Dawley（SD）大鼠脑微血管内皮细胞（brain microvascular endothelial cells,BMECs）和星形胶质细胞（astrocyte,As）建立相对简单可靠、重复性好、接近在体状态的体外血脑脊液屏障（blood-cerebrospinal fluid barrier,blood-CSF barrier）模型。方法：原代分离、纯化和培养BMECs 和As,通过细胞形态学和免疫细胞化学染色方法鉴定原代培养的细胞;通过培养在具有特殊质材和孔径的Transwell 小室上建立体外血脑脊液屏障实验模型,采用倒置显微镜观察细胞形态结构,经跨内皮电阻值（trans endothelialelectrical resistance,TEER）、4 h 液面试漏实验、两种特征性酶检测、荧光素钠通透性（sodium fluorescent,Na-FLU）评价模型的屏障功能。结果：原代培养的BMECs 具有典型的“铺路石”样外观,Ⅷ因子鉴定细胞纯度在95% 以上;As 有细长突触,胞质较浅,胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic portein,GFAP）鉴定细胞纯度在95% 以上。通过测定TEER 值共培养模型组显示高电阻值（378.97±11.38） Ω·cm2;4 h 液面试漏试验阳性;γ- 谷氨酰转肽酶（γ-glutamyltranspeptidase,γ-GT）和碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）表达分别为（30.88±2.87） μmol·min-1·mL-1 和（2.51±0.88）金氏单位·100 mL-1;Na-FLU 跨膜渗透系数（2.228±0.85）×106 cm·s-1。结论：建立的体外血脑脊液屏障模型在形态学、电阻和通透性方面具备了血脑脊液屏障的基本特性。     

星形胶质细胞机械性损伤后内皮性脂酶的表达

目的研究星形胶质细胞划痕损伤后内皮性脂酶（EL）的表达情况。方法取新生大鼠脑皮质,体外分离培养、纯化星形胶质细胞,对其进行划痕损伤,取损伤后不同时间点0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h及正常对照,用Western blot和免疫组化标记检测EL的表达变化及其与凋亡促进因子caspase-3的关系。结果与正常对照组比较,胶质细胞在损伤后6 h EL的表达增高十分明显（P〈0.01）,在损伤后1h出现caspase-3的表达增高（P〈0.01）。结论星形胶质细胞机械性损伤后1 h出现caspase-3表达增高,随后出现EL表达增高,提示星形胶质细胞于损伤后早期即出现凋亡现象,EL在中枢神经系统损伤后修复与再生过程中起重要作用。     

大鼠脑微血管内皮细胞的原代培养

目的分离、培养原代脑微血管内皮细胞,建立体外血脑屏障模型。同时探索高纯度、活性好的脑微血管内皮细胞的分离培养方法。方法取3周大鼠大脑,分离皮质,经过匀浆、葡聚糖离心以及消化后,取纯度较高的脑微血管段种植于胶原蛋白包被过的塑料培养瓶中进行培养。显微镜观察及检测Ⅷ因子相关抗原。结果镜下细胞呈长梭形,7d左右细胞可融合,Ⅷ因子相关抗原免疫组化检测为阳性,且阳性细胞占绝大部分。结论本实验成功分离大鼠脑微血管内皮细胞,并进行原代培养,为脑微血管内皮细胞的进一步研究提供了模型,也为构建更高级的大鼠体外血脑屏障奠定基础。     

体外分离、培养大鼠脑微血管内皮细胞的若干问题

目的 建立一种程序简便、经济、获得细胞纯度较高的体外分离、培养大鼠脑微血管内皮细胞(BMECs)的方法。方法 以SD大鼠为实验材料，采用两步滤过法获得微血管段，胶原酶消化，低分子右旋糖苷密度离心获得BMECs，接种后4h换液使获得的细胞纯化。倒置显微镜下观察细胞的形态，细胞Ⅷ因子相关抗原(ⅦF-Ag)免疫细胞化学法鉴定细胞及其纯度，通过碱性磷酸酶(AKP)的表达来分析BMECs被微动脉和微静脉污染的程度，通过测定BMECs分泌ET-1的量，鉴定培养的BMECs活力。结果 经分离培养获得的BMECs在倒置显微镜下呈多角形或“铺路石”形，单层贴壁生长。培养的细胞Ⅷ因子相关抗原免疫组化试验阳性，细胞纯度为90％。AKP染色阳性细胞百分比为93％，总积分112。原代培养内皮细胞的ET-1含量为388．03pg／ml，传代后为591．75pg／ml。结论 采用两步滤过法获得脑微血管段，胶原酶消化，低分子量右旋糖苷密度离心可分离和培养大鼠BMECs。该方法较其他方法程序简单，获得细胞纯度高。     

大鼠脑微血管内皮细胞体外缺血再灌注模型的建立及他汀的保护作用

目的 建立大鼠脑微血管内皮细胞体外缺血再灌注模型,并观察辛伐他汀、洛伐他汀的保护作用.方法 原代分离培养SD大鼠脑微血管内皮细胞,以无糖Krebs溶液再复氧复糖模拟体外缺血再灌注损伤,并实施辛伐他汀、洛伐他汀预处理干预.观察各组细胞形态,测定各组细胞上清中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性,利用CCK-8检测各组细胞增殖活性.结果 氧糖剥夺(Krebs液) 缺氧12h再复氧复糖4h模型可成功模拟大鼠脑微血管内皮细胞缺血再灌注损伤.辛伐他汀、洛伐他汀预处理后,脑微血管内皮细胞eNOS活性增强、iNOS活性降低,细胞增殖活性提高.结论 辛伐他汀、洛伐他汀具有显著的脑缺血再灌注损伤保护作用.     

白藜芦醇对纤维蛋白上调大鼠脑血管内皮细胞基质金属蛋白酶9表达的影响

目的 观察白藜芦醇(resveratrol,Res)对纤维蛋白诱导的体外大鼠脑血管内皮细胞基质金属蛋白酶 9(ma-trix metalloproteinases9,MMP9)高表达的影响.方法 将大鼠脑血管内皮细胞分离后培养,培养液中加入1.0 mg/ml纤维蛋白和不同浓度的白藜芦醇,通过 RT-PCR 检测脑血管内皮细胞中 MMP9 转录水平,应用明胶酶谱法(gelatin zy-mography)定量检测培养液中的 MMP9 水平.结果 加入不同浓度(0、1、5、10、25和50μmol/L)的白藜芦醇 24 h后,25μmol/L和50μtmol/L 白藜芦醇组的培养液中 MMP9 水平显著降低(P<0.01);RT-PCR 结果显示,25μmol/L 和 50/μmol/L 白藜芦醇组的大鼠脑血管内皮细胞中的 MMP9 显著下调(P0.01).结论 白藜芦醇通过降低纤维蛋白导致的大鼠脑血管内皮细胞中 MMP9 的表达,在神经系统炎性病变中发挥抑制性保护作用.