仙台病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

目的利用原核表达系统表达仙台病毒(Sendai Virus,SV)核衣壳蛋白。方法根据GenBank上发表的仙台病毒(Sendai Virus,SV)核衣壳蛋白基因序列,设计并合成一对引物,通过RT-PCR扩增出核衣壳蛋白全长cDNA序列,将其克隆至原核表达载体pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS,于37℃1mmol/LIPTG条件下诱导表达,大肠杆菌裂解物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约60×103处出现一新蛋白带,与预期目的蛋白分子量相符。结果Western blot检测表明,表达产物能与兔抗SV阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带,表明其具有免疫原性。结论为建立以重组NP蛋白为诊断抗原检测SV奠定基础。     

犬瘟热病毒当前研究进展

犬瘟热（Canine Distemper）是由犬瘟热病毒（Canine Distemper Virus，CDV）引起的多种动物共患的传染病。在自然条件下，CDV能够感染犬科、鼬科、浣熊科、大熊猫科、猫科等多种动物，对我国养犬业、经济动物养殖业、动物园观赏业、野生动物保护业以及实验动物等危害极大。近几年来，在患Paget’s疾病的病人组织中检出了CDV核酸，因此，其潜在的公共卫生学意义也已受到广大国内外学者的关注，开展的研究涉及病毒的病理学、免疫学、分子流行病学、检测等方面。     

人巨细胞病毒p52蛋白基因的克隆及表达

制备人巨细胞病毒Ｐ５２蛋白特异性抗原。方法用ＰＣＲ技术扩增ＨＣＭＶＰ５２蛋白ＩｇＭ抗原决定簇编码区ＤＮＡ片段，克隆表达载体ＰＢＶ２２０中，转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５ａ株，用氨苄青霉素抗性和质粒酶切图谱分析法筛选阳性克隆，经温控诱导基表达。     

丙型肝炎病毒包膜蛋白基因片段的克隆与表达

应用ＲＴ－ＰＣＲ和基因重组技术，从湖南地区丙型肝炎病毒（ＨＣＶ）感染者血清中克隆了ＨＣＶ包膜蛋白基因片段（Ｅ１，Ｅ２／ＮＳ１）经与已知基因型的ＨＣＶ－１，ＨＣＶ－Ｊ，ＨＣＶ－Ｊ６和ＨＣＶ－Ｊ８进行核苷酸序列的比较分析，这些基因片段属１ｂ型ＨＣＶ基因。将克隆基因重组于表达质粒ＰＭＡＬ－ＣＲＩ中，在大肠杆菌内进行高效表达，获得了融合蛋白ＭＢＰ－Ｅ１，ＭＢＰ－Ｅ２／ＮＳ１，经ＷｅｓｔｅｍＢｌｏｔ分析证实     

生殖支原体粘附蛋白基因片段的克隆和表达

生殖支原体粘附蛋白基因片段的克隆和表达张秀英孔繁荣朱学骏陈洪生殖支原体细胞膜有顶端结构表面覆有绒毛样物质，可能是致病的主要原因，具有粘附功能的粘附蛋白位于细胞膜的顶端结构中［１］。我们根据粘附蛋白的已知基因序列设计了一对引物，扩增得到了编码为生殖支原...     

人乳头瘤病毒16型主要衣壳蛋白L1基因的克隆和序列分析

目的 从已感染人乳头瘤病毒（HPV）的新鲜宫颈癌组织中获得HPV16型晚期表达基因L1，为HPV感染的检测和治疗奠定基础。方法 根据引物设计原则设计一对特异引物，并用PCR方法从宫颈癌组织中获得L1基因，用pGEM-T作为克隆物体，构建重组质粒并以双脱氧法双向测定插入片段序列，拼接出L1基因序列，自动测序验证并分析序列。结果 从西安地区1例宫颈癌临床标本克隆到的1株HPV16型L1蛋白编码序列经BLAST2．0分析与既往报道序列存在高度同蛋白编码序列经BLAST2．0分析与既往报道序列存在高度同源性。结论 构建的重组质粒为进一步研究L1蛋白的表达及其免疫学创造了条件。     

副流感病毒核衣壳蛋白的基因克隆、原核表达与多克隆抗体制备

目的 表达Ⅱ型副流感病毒核衣壳蛋白,为制备抗体作前期工作.方法 从分离培养的Ⅱ型副流感病毒标本中RT-PCR扩增出核衣壳蛋白基因,Nde Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切PCR产物,定向连接到原核表达载体pQE2中,得到重组表达质粒pQEHpI2NP,重组表达质粒进行DNA测序鉴定,转化大肠杆菌BL21(DE3).IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测目的 蛋白的表达.利用Ni-NTA agarose纯化带6个组氨酸标记的重组蛋白,重组蛋白免疫小鼠,制备抗Hpl2NP多抗,Hep-2细胞培养的Ⅱ型副流感病毒制备可溶性抗原.Western-blot分析.结果 构建了表达重组质粒pQE2_Hpl2NP,测序鉴定了克隆序列的准确性,在大肠杆菌中成功地表达并纯化得到重组核衣壳蛋白.经Western-blot证实,重组蛋白免疫的小鼠血清与细胞培养的Ⅱ型副流感病毒核衣壳蛋白有特异性反应.结论 成功表达了Ⅱ型副流感病毒核衣壳蛋白,并制备了抗Hpl2NP多抗.     

人乳头瘤病毒11型主要衣壳蛋白L1基因的克隆及序列分析

目的 从临床尖锐湿疣标本克隆人乳头瘤病毒（HPV）11型主要衣壳蛋白L1基因,进行序列测定及序列分析比较,以为研究该临床病毒株的免疫原性及流赞美同学奠定基础。方法 以临床尖锐湿疣标本总DNA为模板,用L1基因保守区简并引物以PCR方法分段扩增衣壳蛋白L1基因在部,重组入pGEM-3zf(-)质粒载体,以双脱氧法双向测定插入片段序列,拼接出L1基因序列,通过BLAST2.0与已报道序列进行比较。结果 从西安地区一尖锐湿疣临床标本克隆到的一株HPV11型L1蛋白编码序列与一文献报道大部分相同,但有些位点有点突变,结论 构建的pGEM-3zf(-)重组质粒为进一步通过杂交、体内分段表达等手段研究研究该株病毒L1蛋白的免疫学和流行病学性质创造了条件。     

HPV58E6基因的克隆及体外表达

目的：克隆并体外表达HPV58E6，为E6致癌作用和疫苗的研究奠定基础。方法：通过PCR方法从HPV58全基因克隆中扩增出HPV58E6基因片段，利用基因重组技术，将其克隆至真核表达质粒pcDNA3的T7启动子下游，体外转录成mRNA后，在源自网织红细胞的翻译缓冲液中表达生物素标记的HPV58E6蛋白，化学发光法检测，X光胶片曙光显影鉴定，结果：酶切电泳证实质粒构建正确，SDS-PAGE电泳显示在相当于HPV58E6分子量约18.8kD的位置出现条带，X光胶片亦在相应位置出现印迹条带。结论：成功表达了含有生物素标记的HPV58E6蛋白，为其致癌作用和治疗的研究奠定基础。     

人巨细胞病毒p52蛋白基因的克隆及表达

目的制备人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）ｐ５２蛋白特异性抗原。②方法用ＰＣＲ技术扩增ＨＣＭＶｐ５２蛋白ＩｇＭ抗原决定簇编码区ＤＮＡ片段，克隆到表达载体ｐＢＶ２２０中，转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α株，用氨苄青霉素抗性和质粒酶切图谱分析法筛选阳性克隆，经温控诱导其表达。③结果重组克隆能有效表达天然蛋白ｐ５２，ＥＬＩＳＡ检测重组ｐ５２蛋白具良好的抗原特异性。④结论通过基因工程制备的重组ｐ５２蛋白可作为ＨＣＭＶ血清学诊断的良好抗原。     

水貂犬瘟热动物模型的建立

目的建立水貂犬瘟热动物模型,并利用水貂犬瘟热模型评价不同犬瘟热强毒株的毒力,为水貂犬瘟热病毒疫苗的研究奠定基础。方法从猴、藏獒、犬的病料中分离犬瘟热病毒,测定犬瘟热病毒的毒力,并进行传代培养。利用犬的犬瘟热动物模型筛选稳定的犬瘟热强毒株,进行水貂犬瘟热动物模型的建立及其毒力评估。结果筛选出了稳定的犬瘟热强毒株并进行了家犬动物实验,同时表现出了强烈的临床症状,并利用不同的代次毒进行了犬瘟热动物模型的建立。结论成功建立了犬瘟热动物模型并对不同来源的犬瘟热病毒毒力进行了评估。     

灵长类动物感染犬瘟热

通过介绍犬瘟热流行病学特点,结合犬瘟热病毒在灵长类动物的感染情况,对犬瘟热的危害及公共卫生意义进行了分析。指出犬瘟热病毒存在大范围流行风险从而对进出口猴场形成新的威胁,并根据工作实际提出了疫病疫情预防控制和检验检疫监督管理的着重点。     

假单胞菌海因酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：构建海因酶基因工程菌,以便实现对羟在苯甘氨酸的工业化生产。方法：利用PCR技术从恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida)9801中扩增得到海因酶基因,将该基因插入pMD18-T质粒,转化大肠杆菌（Bscherichia coli)通过地高辛标记原位杂交和海因酶活力测定两种方法,筛选出具有海因酶活力的阳性转化子。结果：工程菌E.coliBL21/pMD-dht的海因酶活力达到1700U/L,比野生菌恶臭假单胞9801菌的酶活力提高8倍。SDS-PAGE显示海因酶的单体分子量纸醉金迷为53KDa,海因酶的表达量约占菌体总可溶性蛋白的20%。结论：构建的海因酶基因工程菌已初步具有工业化应用价值。     

犬瘟热病毒RT-LAMP检测方法的建立和初步应用

目的利用环介导等温扩增(LAMP)技术建立一种检测犬瘟热病毒感染的新方法。方法根据GenBank中NP基因序列,设计4条LAMP特异性引物,对反应条件、特异性、可视化效果和应用效果进行研究。结果在60℃等温的条件下、1 h内可完成RT-LAMP扩增过程;特异性和可视效果良好;对63份临床标本进行检测,阳性检出率为71.4%(45/63),检出率高于RT-PCR的63.5%(40/63)。结论建立的RT-LAMP检测方法,显示了较高的特异性和敏感性,而且兼具高效、快捷、可视化的优势,为临床检测犬瘟热病毒感染提供了一种快速简便的新途径。     

禽脑脊髓炎病毒VP3基因的克隆与序列测定

目的 对VP3进行克隆和测序，为禽脑脊髓炎病毒（AEV）的分子诊断以及更深一层次的分子和基因工程研究打下基础。方法利用RT-PCR技术，从AEVVR株感染的SPF鸡胚脑及内脏器官组织中提取病毒RNA并扩增出VP3目的基因，而后克隆到pMD18-T载体中，鉴定后进行序列测定。结果AEV VR株VP3基因全长735bp，共编码245个氨基酸，与AEV-1143标准毒株相应片段的核苷酸和氨基酸同源性分别为93％和97％；并将其与其他小RNA病毒进行了比较。结论本研究通过RT-PCR技术从体外成功扩增AEVVan-Roekel株VP3蛋白基因，并对其进行克隆、测序。     

乙肝病毒e抗原基因在大肠杆茵中高表达

取pZD 8703质粒DNA(本室构建的高表达乙肝核心抗原基因质粒)用Ava Ⅰ酶切开,Bal 31酶消化,加四种核甘酸dNTP、DNA聚合酶大片段酶补平后,用T_4 DNA连接酶连接,再用EcoRI酶消化,回收EcoRI小片段连接到pJLA 503的EcoRI位点,转化受体菌JM103,获得在P_RP_L启动子控制下,由温度调节CIts 857开启和关闭的高表达乙肝e抗原(HBeAg)的重组体。用抗HBe-β)单克隆酶标抗体配套的ELISA双抗体夹心法测定经超声波处理的细菌原液,HBeAg的终效价在1:10240以上,只含少量HBeAg。可以代替血清HBeAg用作配套检测试剂。     

乙肝病毒e抗原基因在大肠杆茵中高表达

取pZD 8703质粒DNA(本室构建的高表达乙肝核心抗原基因质粒)用Ava Ⅰ酶切开,Bal 31酶消化,加四种核甘酸dNTP、DNA聚合酶大片段酶补平后,用T_4 DNA连接酶连接,再用EcoRI酶消化,回收EcoRI小片段连接到pJLA 503的EcoRI位点,转化受体菌JM103,获得在P_RP_L启动子控制下,由温度调节CIts 857开启和关闭的高表达乙肝e抗原(HBeAg)的重组体。用抗HBe-β)单克隆酶标抗体配套的ELISA双抗体夹心法测定经超声波处理的细菌原液,HBeAg的终效价在1:10240以上,只含少量HBeAg。可以代替血清HBeAg用作配套检测试剂。     

乙肝病毒核心抗原基因在大肠杆菌中的高表达

乙肝核心抗原在大肠杆菌表达由Michael Nassal完成,国内马贤凯等人成功地使乙肝核心抗原在Lac启动子控制下高表达。本文使乙肝核心抗原基因在P_LP_R启动子控制下,用温敏法诱导产生HBcAg,该菌株能稳定地高表达。可以代替肝提取的HBcAg,菌     

HPV16L1E7的基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：研究人乳头瘤病毒(HPV)的主要衣壳蛋白L1和主要的转化蛋白E7的融合基因在原核细胞中的表达，为研制HPVl6L1E7疫苗和诊断试剂盒提供依据。方法：采用聚合酶链反应(PCR)以重组质粒pUCl9UE7为模板扩增HPVl6L1E7基因片段，克隆至载体pMDl8-T中，并用限制性内切酶将HPVl6L1E7基因切下，克隆至原核表达质粒pQE30中，经IPTG诱导表达，再使用SDS-PAGE和蛋白印迹检测其抗原性和表达水平。结果：HPVl6L1E7融合蛋白能被抗HPVl6L1抗体识别，分子量为66KD，经IPTG诱导4h后，表达的HPVl6L1E7融合蛋白占菌体总蛋白量的25％以上。结论：成功构建的表达载体pOE30-L1E7可在原核表达细胞中高效表达，且表达出的HPVl6L1E7融合蛋白具有反应活性，可与HPVl6抗体发生反应。     

霍乱毒素ctxA基因的克隆及原核表达

目的 构建霍乱毒素A亚基基因（ctxA）的融合表达载体。并在原核细胞中表达,为霍乱弧菌肠毒素A亚基（CTA）免疫原性的研究及其作为免疫佐剂的研究提供基础。方法 以霍乱弧菌DNA为模板．PCR扩增获得霍乱弧菌ctxA基因,与带有硫氧还蛋白（Trx）基因的高效原核表达质粒pET32a（＋）定向重组,构建重组质粒．转化大肠杆菌BL21（DE3）,并经限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析后,以IPTG诱导表达Trx—CTA融合蛋白,用SDS—PAGE及Western blot进行鉴定。结果 限制性核酸内切酶酶切鉴定、PCR和核酸序列分析表明,我们扩增出了霍乱弧菌787bp的ctxA基因,成功构建了重组质粒pET—ctxA,经SDS—PAGE及Western blot分析显示重组质粒pET—ctxA在原核细胞中得到了高效融合表达。结论 霍乱弧菌ctxA基因在大肠杆菌中得到了高效表达。