猪内源性逆转录病毒基因在版纳微型猪近交系骨髓间充质干细胞永生细胞系的整合和表达研究

目的 检测猪内源性逆转录病毒（PERV）在猪细胞长期传代过程中的基因整合和表达。方法 通过提取已建立的版纳微型猪近交系（BMI）骨髓问充质干细胞（MSCs）永生细胞系的DNA及细胞总RNA,用PCR、RT—PCR方法检测PERV前病毒gag、pol和env基因的整合和表达,并对PERV的亚型进行鉴定。结果 从原代BMI—MSCs至连续传代到150、180代的BMI—MSCs细胞基因组中都检测到了PERV前病毒DNA的整合及其mRNA的表达．PERV亚型为PERV—A、B型。结论 PERV在BMI近交过程中及猪细胞体外长期传代过程中均未消扔,PFRV基因已经整合入其天然宿主的基因组内并能稳定表达。     

应用PCR和RT-PCR检测猪内源性逆转录病毒及其意义

目的 观察猪内源性逆转录病毒（Porcine endogenous retrovirus,PERV)在中国实验小型猪的感染情况。方法 针对PREV gag区的序列，选用特异性引物，采用PCR方法检测猪肝脏、皮肤前病毒序列；以及RT－PCR方法检测血清中PERV－RNA序列。结果 该法在猪肝脏组织中可检测出PERV前病毒序列；此外，在猪血清标本亦检测出病毒序列，而其它2份HBV、HCV阳性血清及2份其它动物血清（大鼠、兔）检测结果均为阴性，说明该方法特异性较高。结论 中国实验小型猪均携带该病毒，并可以释放到血清中；采用该法具有特异、简便的特点，为进一步研究PERV感染及生物安全性奠定了基础。     

湖南大围子猪内源性逆转录病毒的研究

目的：研究湖南大围子猪携带的内源性逆转录病毒（porcine endogenous retrovirus，PERV），为评价从猪到人异种移植的生物安全性提供依据。方法：从湖南大围子猪的保种群内随机采集42头个体的耳样组织，应用PCR和RT-PCR技术分别检测这些组织中PERV前病毒DNA和mRNA，并对PCR扩增的灵敏性进行评估。扩增、测序大围子猪的PERV env基因，结果用美国生物信息中心（National Center for Biotechnology Information）的BLAST软件进行分析。结果：所检测的42头大围子猪均带有PERV前病毒DNA，耳样组织中均有PERV mRNA表达，所有个体携带env-A，env-B和env-C3种囊膜蛋白基因。测序结果表明，大围子猪env-A和env-C与GenBank登录其他猪种序列（AY288779，AY534304）相比分别存在1和8个碱基的差异，而env-B基因没有碱基差异。结论：大围子猪种群携带PERV，而且均具有转录活性，亚型主要为PERV-ABC；大围子猪的PERVenv-A，env-C存在基因多态性，从生物安全性方面考虑，该猪种不宜作为异种移植供体。     

中国两头乌猪品种内源性逆转录病毒基因研究

目的 对5个中国两头乌猪品种（通城猪、东山猪、沙子岭猪、赣西两头乌猪和金华猪）及3个国外品种（大白猪、长白猪和杜洛克猪）猪内源性逆转录病毒(PERV)的核心蛋白(gag) 基因、多聚酶(pol) 基因、囊膜(env) 基因的三个亚型A、B、C，分别从DNA和RNA水平上进行研究，以发现中国两头乌猪品种在异种器官移植中的资源优势。方法 利用PCR方法在DNA水平上对PERV基因的3个亚型进行鉴定，并通过半定量PCR方法在RNA水平上检测通城猪和大白猪PERV各亚型在心、肝、脾、肺、肾、肌肉、脂肪、淋巴和脑组织中的表达谱。结果 4个华中两头乌猪种中env-AB型为主要PERV亚型，分别占被测总数的92%～100%。在这4个品种中均没有检测到C亚型，金华猪以及3个国外猪种中均检测到了C亚型，病毒亚型种类也更丰富。半定量PCR实验结果显示gag、pol基因在两个品种9个组织中广泛表达，env-A在通城猪的心、肝、肺、脂肪和淋巴组织中表达量较低，env-B在通城猪的心脏和淋巴组织中表达量较低，而env-B在大白猪的肾脏中表达很低，其他所测8个组织中表达量都较高。结论 通城猪、东山猪、赣西两头乌猪和沙子岭猪可以做为较佳的异种移植候选供体，具有良好的应用前景。     

广西巴马小型猪PERV-env基因克隆及其组织表达谱分析

目的克隆广西巴马小型猪PERV-env部分基因,并研究其在不同组织中的表达差异。方法利用RT-PCR方法从巴马小型猪外周血白细胞中扩增PERV-env基因,并与部分国内外已发表的PERV-env基因序列进行同源性及遗传进化分析。以扩增获得的广西巴马小型猪PERV-env基因为模板设计引物,利用半定量RT-PCR的方法对广西巴马小型猪不同组织中PERV mRNA表达情况进行分析。结果在所检测的9个组织样品中PERV mRNA相对表达水平存在差异,肾及外周血淋巴细胞中PERV mRNA丰度最高,肺、心、肝、脾、胸腺、卵巢次之,且表达丰度差异不显著(P0.05),胰腺PERV mRNA表达丰度最低。结论以巴马小型猪胰岛细胞进行异种移植发生PERV感染的潜在危险性可能要低于其它器官,但仍需进一步研究证实。     

新型生物人工肝系统治疗急性肝衰竭犬后猪内源性逆转录病毒传播的实验研究

目的:探讨猪肝细胞为基础的新型生物人工肝(BAL)系统体外灌流后及治疗急性肝衰竭(ALF)犬后猪内源性逆转录病毒(PERV)的传播。方法:构建新型BAL,应用BAL进行体外灌流6h。采用门腔分流及胆总管结扎切断术建立犬ALF模型,应用BAL治疗ALF犬6h。采用PCR检测灌流前猪细胞中PERV原病毒DNA和猪mtDNA,采用RT-PCR检测灌流前后中空纤维管内腔循环液和治疗前后犬血清PERV RNA。结果:猪细胞可检测到PERV原病毒DNA和猪mtDNA,灌流前后中空纤维管内腔循环液和犬血清PERV RNA均为阴性。结论:猪肝细胞为基础的新型BAL体外灌流和用于ALF犬治疗6h后未发现PERV传播。     

版纳微型猪近交系基因组中内源性逆转录病毒序列拷贝数分析

目的:检测分析版纳微型猪近交系基因组中内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)序列的拷贝数,从而为猪源移植物的异种移植筛选理想供者.方法:用PERV的pol,env各亚型基因及envA/C重组体的特异性引物,对4个近交系亚系共50头以及5头欧洲大白猪的外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)的基因组DNA进行了实时定量/半定量PCR检测及普通PCR检测.结果:所有版纳猪基因组中可特异扩增出pol,envA,envB片段,其平均拷贝数分别为(24.2±9.4),(13.1±8.4)和(16.4±9.8)个,但近交系不同亚系之间各片段扩增产物量比较差异具有统计学意义(P＜0.01).所有样品中无法扩增出envC片段以及envA/C重组体.结论:版纳微型猪近交系基因组内,PERV的envA、envB和pol序列拷贝数在近交系不同亚系间比较差异有统计学意义,不存在envC和envA/C重组体序列.     

猪内源性反转录病毒感染HEK293细胞模型的建立

目的　建立猪内源性反转录病毒感染HEK2 93细胞的模型 ,验证PERV在体外对人源细胞的感染性 ,并进一步研究PERV的生物学特性。方法　将G4 18抗性的HEK2 93细胞与猪源PK 15细胞共培养 ,6周后 ,用含有6 0 0 μg mlG4 18的选择性培养基对共培养细胞进行加压筛选 ,用以除去共培养体系中的PK 15细胞 ;然后应用PCR及RT PCR的方法对所制备的感染细胞模型进行系统鉴定。结果　经 6周共培养及 3周加压筛选后 ,细胞的形态、生长速度及折光性均未见明显变化 ;PCR及RT PCR鉴定表明 ,筛选后的共培养体系中已没有PK 15细胞的存在 ;PERV特异性检测方法检测显示 ,该细胞模型的DNA中已有PERV的整合且有PERV特异性mRNA的表达。结论　本实验成功建立了PERV感染HEK2 93细胞的模型 ,证实了PERV在体外对人源细胞具有感染性 ;为PERV生物学特性的研究奠定了基础     

异种移植的病毒安全性研究进展

猪-人异种移植有望解决人源器官短缺的严重问题.然而,以前病毒(provirus)形式整合入猪基因组中的猪内源性反转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)难以去除,PERV有可能通过异种移植传播给人类,甚至产生新的病毒性疾病.本文回顾了PERV与异种移植病毒安全性及我国特有小型猪中PERV的相关研究.     

中国两种地方猪种内源性逆转录病毒的亚型分析

目的 对两种中国地方猪种（五指山猪和版纳微型猪近交系）的86头个体进行猪内源性逆转录病毒（PERV）亚型分析。方法 取引物Env A,EnvB和EnvC分别用于鉴定PERV的A,B和C亚型,并对86头个体进行PCR法分析。结果 在所有被检测个体中,77．9％的个体的基因组中 时有PERV的A、B两种亚型,另外22．1％的个体的基因组中则只有PERV的A或B亚型;所有个体的外周血白细胞中均未检测到PERV的C亚型。结论 PERV在中国五指山猪和版纳微型猪近交系的外周血白细胞中只有A、B两种亚型,并且以AB的混合亚型为主。     

我国实验用小型猪三个种群微生物感染状况调查

目的 为开展实验用小型猪SPF净化工作，对北京五指山小型猪、广西巴马小型猪和贵州香猪进行微生物、寄生虫检测，以了解3个种群小型猪的微生物感染状况。方法 采集3个种群小型猪的血清和皮肤样本，用血清学和显微镜观察方法对其进行17项微生物和寄生虫学指标的检测。结果 3个种群的小型猪微生物感染状况均不相同。结论 建议从异地引猪时应选择感染率低的小型猪，经剖腹净化、微生物检测合格后在新场进行饲养。     

异种移植微囊化新生猪胰岛细胞受体感染PERV潜在风险分析

目的:研究新生猪胰岛细胞(neonatal pig islets,NPIs)经微囊化后异种移植到狗体内,受体感染猪内源性逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)的风险.方法:将10只狗随机分成实验组和对照组,分别移植微囊化猪胰岛细胞和未被微囊化猪胰岛细胞.应用放射免疫的方法检测狗体内血清特异性猪C-肽以判断胰岛移植物活性;采用免疫组织化学技术检测28 d后肝移植部位是否有微囊化猪胰岛细胞;PCR和RT-PCR技术分别检测不同时间点狗外周血中PERV及猪mt DNA.结果:移植微囊化猪胰岛细胞2周后,给受体注射葡萄糖,15～30 min狗的外周血中猪C-肽表达明显升高,而对照组检测不到猪C-肽;免疫组化结果表明,狗肝脏移植部位周围可检测到少量微囊化猪胰岛细胞,肝组织无明显异常;PCR和RT-PCR结果表明,移植微囊化猪胰岛细胞在不同时间点狗外周血内均未检测到猪mt DNA及PERV表达,而对照组于移植后4 d内检测到猪mt DNA及PERV呈微弱表达,10 d后均未见表达.结论:微囊化猪胰岛细胞能够在受体肝脏内存活并发挥作用,受体内不存在PERV的感染,提示海藻酸钠微囊可以有效地防止猪mt DNA及PERV的穿越,可能在异种移植中具有较好的应用前景.     

改良去细胞方法对猪源性逆转录病毒的影响

目的观察改良的去细胞方法对猪主动脉瓣膜的猪源性逆转录病毒的影响。方法用0．1％胰酶消化猪主动脉瓣后,再用TritonX-100-DNA酶／RNA酶洗脱消化,结合溶液渗透压改变等去除细胞;取新鲜猪瓣、猪外周血标本和去细胞猪瓣各20只,降主动脉内移植去细胞猪瓣后的犬外周血10例,以PK15细胞系为对照,采用PCR和RT-PCR法检测猪源性逆转录病毒。结果经去细胞处理后猪瓣内的细胞成分完全去除,纤维支架和力学性能保持良好;新鲜猪瓣及猪外周血标本均检测到219bp的扩增条带,与Medline公布的猪源性逆转录病毒有90％～95％同源性;去细胞猪瓣及移植了去细胞猪瓣犬的外周血,均未测到该病毒。结论改良的去细胞方法可以去除猪心瓣膜的猪源性逆转录病毒,能够有效预防该病毒物种间的交叉感染。