615小鼠ES细胞集落的分离及初步鉴定

目的　分离和培养 6 15小鼠的ES细胞集落 ,为建系打下基础。方法　以PMEF为饲养层分离 6 15小鼠的ES细胞集落 ,进行无饲养层培养 ,并对其进行初步鉴定。结果　ES细胞集落的出现率和传代成功率为 2 2 6 %和 0 94 % ,其ALP染色阳性 ,具有稳定的二倍体核型 ,可自发分化为多种类型的细胞。结论　成功分离和培养了6 15小鼠的ES细胞集落     

用饲养层分离胚胎干细胞集落的实验初探

目的 用饲养层分离胚胎干细胞集落。方法 用胚龄为13~14 d的小鼠胚胎分离原代成纤维细胞，制成饲养层，用于囊胚的培养。结果 小鼠原代胚胎成纤维细胞（PMEF）贴壁能力较好，增殖快，易铺层。囊胚和内细胞团（ICM）在饲养层上贴壁生长良好，当培养4~5 d时，其增殖率为16/28（57%）。在ICM离散48 h后，各种胚胎干细胞（ES）集落开始出现。此种集落经碱性磷酸酶染色成阳性。结论 用饲养层分离胚胎干细胞获得初步成功。     

昆明种系小鼠胚胎干细胞的分离培养及特性鉴定

目的 提高昆明小鼠胚胎干细胞（ES细胞）建株的成功率。方法 收集小鼠3．5d的囊胚培养,用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,形成的ES细胞样集落,经两次亚克隆分离培养ES细胞;进行相差显微镜观察、碱性磷酸酶染色和体内外分化能力鉴定。结果 获得两个稳定ES细胞集落,传至第11代。ES细胞呈集落样生长,碱性磷酸酶染色强阳性,体外分化的细胞沿拟胚体外向性生长,形态多样,在体分化可形成来源于3个胚层的组织。结论 两次亚克地获得的细胞具有ES细胞主要的生物学性状,有助于提高昆明小鼠ES细胞建株的能力。     

昆明种小鼠胚胎干细胞的培养及鉴定

目的 从昆明种小鼠的早期胚胎中获取并培养胚胎干细胞.方法 收集小鼠3.5 d的囊胚培养,用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,形成的ES细胞样集落,72 h后分离隆起生长的内细胞团并继续培养,观察集落的生长状态,并通过碱性磷酸酶染色进行鉴定.结果 ES细胞有其典型的形态学特征:集落呈鸟巢状,边缘清楚,表面平滑,结构致密,隆起生长,细胞之间界限不清楚;单个细胞体积小、核大;对ES 细胞碱性磷酸酶进行检测,在AKP底物作用下,未分化的ES 细胞显微镜下为棕褐色,分化的不着色.结论 昆明种小鼠囊胚在小鼠胚胎饲养层细胞上可以发育为胚胎干细胞.     

以间充质干细胞为饲养层分离培养昆明小鼠胚胎干细胞

目的:探讨以间充质干细胞作为饲养层细胞分离培养昆明小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)的方法.方法:以鼠间充质干细胞作为饲养层,收集受孕3.5～4 d昆明小鼠的囊胚和桑椹胚进行培养,筛选纯化细胞集落,使其稳定传代后,采用光镜,碱性磷酸酶染色及Oct-4染色对其形态学和生物学性状进行初步鉴定.结果:以间充质干细胞作为饲养层细胞分离培养的昆明小鼠ES有其典型的形态学特征:集落呈鸟巢状,边缘清楚,表面平滑,结构致密,隆起生长,细胞之间界限不清楚;单个细胞体积小、核大;对ES细胞碱性磷酸酶进行检测,末分化的Es细胞显微镜下为黄褐色,分化的不着色;Oct-4染色阳性.结论:以间充质下细胞作为饲养层细胞分离培养昆明小鼠胚胎干细胞可行,得到的胚胎干细胞能保持特殊的形态和未分化状态.     

两种来源小鼠胚胎干细胞的分离与培养

从小鼠早期胚胎和原始生殖细胞中分离和培养胚胎干细胞(ES细胞).方法:取小鼠3.5天胚龄的囊胚,培养在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,3 ～4天后分离出内细胞团再培养;取13.5天胚龄胚胎的生殖嵴组织,分离出原始生殖细胞,在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养;观察两种来源的细胞集落生长行为,并用AK P染色鉴定细胞集落.结果:两种来源的细胞集落均具有ES细胞鸟巢状典型特征,AKP染色阳性.结论:两种来源的小鼠胚胎干细胞均可分离和培养.     

免疫外科法分离克隆BALB/c小鼠胚胎干细胞

目的　使用免疫外科法分离克隆BALB c小鼠胚胎干细胞 (embryonicstemcells,ES细胞 ) ,为进一步建立BALB c小鼠ES细胞系打下基础。方法　用免疫外科法从 4 5枚BALB c小鼠囊胚中分离得到 2 0枚去除滋养层细胞的ICM ,接种在MEF饲养层上 ,使用DMEM(高糖 ) 15 ?S 0 1mmol Lβ 巯基乙醇 0 0 1mmol L非必需氨基酸 10 0 0IU mlLIF 10 0IU mL青霉素 10 0IU ml链霉素培养液 ,17枚形成典型的ICM集落 (85 0 % ) ,有一枚胚胎传至第 10代。用于全胚培养的BALB c小鼠胚胎共 10 2枚 ,使用与免疫外科相同的培养方法 ,6 6枚形成典型的ICM集落 (6 4 7% ) ,其中一枚胚胎传至第 8代。结果　免疫外科法较全胚培养法有利于小鼠ES细胞的分离与克隆 ;添加LIF(10 0 0IU ml)有利于小鼠ES细胞的分离与传代 (P <0 0 5 ) ;0 0 5 %胰酶 0 0 0 8?TA是较好的ES细胞消化液 ,对细胞综合损伤力小 ,且传代后ES细胞集落形成能力也较高 (P <0 0 5 )。结论　分离得到的ES细胞经形态学观察 ,AKP染色 ,体外分化实验 ,核型分析等证明其具有胚胎干细胞的诸多特性。     

小鼠胚芽干细胞的分离与培养

目的：探讨胚芽干细胞的提取、培养和体外扩增的最佳条件;筛选胚芽干细胞在体外培养中的活力最佳时期。方法：分离受精11d小鼠生殖腺嵴,经消化制备成胚芽干细胞悬液,将细胞分别接种于基础培养液、同种胎鼠成纤维细胞条件培养液、添加LIF的基础培养液、有饲养层的培养基和与胎鼠成纤维细胞共培养5种不同的培养体系中,比较观察在5种培养体系中胚芽干细胞的形态学、碱性磷酸酶染色和体外分化情况。结果：①在含15％胎牛血清的DMEM／F12基础培养液中培养时,胚芽干细胞贴壁明显减少,EGC克隆形成很少,传代率很低;②在基础培养液中添加白血病抑制因子（LIF）或同种胎鼠成纤维细胞条件培养液时,细胞生长情况与基础培养液培养相比无明显差异;③有饲养层存在时,4～6d后出现鸟巢状胚芽千细胞集落。传4代后集落逐渐减少、变小。6～7代后集落消失;④与胎鼠成纤维细胞共培养时,2～4d即可见EGC集落形成。传6代后细胞的集落逐渐减少、变小;⑤在与胎鼠成纤维细胞共培养时,第2、3代细胞的生长曲线基本相同,接种24h后细胞呈对数生长。培养液的更新可以显著影响小鼠胚芽干细胞的生长。第5代的细胞增殖速度减慢。结论：与饲养层细胞或腹壁组织成纤维细胞共培养可较好地培养和扩增胚芽干细胞;第3代细胞的活力最好。     

小鼠胚胎干细胞体外分离培养影响因素的实验研究

目的 为了更高效地分离胚胎干细胞(ES)，对几种影响分离ES细胞的因素进行探讨。方法 通过胚泡Hoechst33342染色及胚泡培养，研究超排卵对胚泡贴壁率及ES细胞分离效率的影响。并从3种不同培养体系中寻找较为理想的ES细胞分离体系。结果 ①超排卵获得的胚泡的细胞数与正常胚泡之间差异无显著性意义。超排卵对胚泡的72h贴壁率及ES细胞克隆率无显著影响。②在ES细胞培养过程中，有饲养层体系优于无饲养层体系。结论 超排卵获得胚泡的方法在小鼠ES细胞分离培养过程中值得采用。人胚胎成纤维细胞饲养层在ES细胞分离过程中具有较好的作用。     

条件培养液改进小鼠胚胎干细胞嵌合体制备效率的观察

目的:探讨如何通过改善小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES)的培养条件来维持其未分化状态,提高嵌合体的制备效率.方法:以普通ES细胞培养液为对照,以TX-WES培养液为ES细胞条件培养液分别对15代以上的未工程化ES细胞和糖皮质激素受体(GR)工程化ES细胞进行培养并筛选,通过囊胚注射制作嵌合体来比较2种不同培养液培养ES细胞后嵌合体制备效率的差别.结果:未工程化ES细胞以普通培养液培养其嵌合率为25.0%,以TX WES培养液培养其嵌合率提高到53.8%(P＜ 0.05);GR工程化ES细胞以普通培养液培养其嵌合率为15.0%,以TX-WES培养液培养其嵌合率提高到52.3%(P＜0.05).结论:应用TX-WES培养液改善小鼠ES细胞的培养条件可提高嵌合体的制备效率,该方法为基因剔除小鼠研究的顺利开展奠定了良好的基础.     

探讨保持胚胎干细胞全能性的体外培养条件

【目的】探讨保持胚胎干细胞 (EScells)全能性的体外培养条件。【方法】将ES D3细胞株培养在SNL饲养层细胞和原代小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上以及在无饲养层的条件下 ,培养基中加入小鼠白血病抑制因子 (mLIF)或用BuffaloRatLiver(BRL)条件培养基进行培养 ,并对培养细胞进行碱性磷酸酶检测和染色体分析。【结果】ES D3在上述培养体系中能形成正常形态的克隆 ,并且经多次传代后碱性磷酸酶检测为阳性 ,而且核型保持稳定。【结论】说明上述各种培养体系均能保持ES D3的高度未分化状态及正常的二倍体核型。     

小鼠胚胎干细胞的培养

ＥＳ细胞的培养应满足促进细胞增殖和抑制细胞分化而保持其高度未分化潜能。我们用胚胎成纤维细胞作为饲养层，培养基ＤＭＥＭ中加白血病抑制因子的方法来培养ＥＳ细胞。培养的ＥＳ细胞呈集落状生长，细胞排列紧密，呈未分化状态。胚胎成纤维细胞作为饲养层是分离培养ＥＳ细胞最普遍使用而且有效的方法。本文还围绕ＥＳ细胞培养中的促进增殖和抑制分化这两个方面的影响因素进行了讨论。     

ICR小鼠胚胎成纤维细胞的培养及饲养层的制作

目的：建立ICR小鼠胚胎成纤维细胞饲养层培养体系，用于胚胎干细胞建系及研究。方法：选取不同胎龄的鼠胚原代细胞分离成纤维细胞，制作饲养层，使用不同浓度丝裂霉素C处理，以细胞形态、生长曲线、囊胚种植情况为饲养层评价指标。结果：ICR小鼠胚胎成纤维细胞可在胎龄12．5～14．5d进行原代细胞分离；12．5d为最佳分离时间；13．5和14．5d分离的细胞需在3代以后使用；6代以前细胞可用于饲养层制作；20mg/L丝裂霉素C作用2．5h可达到较好的处理效果。结论：ICR小鼠可用来分离、培养胚胎成纤维细胞，用于胚胎干细胞饲养层的制作。     

小鼠胚胎干细胞的分离培养与鉴定

目的:培养、分离和鉴定C57BL/ 6小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell ,ESC).方法:收集小鼠3.5 d 的囊胚进行培养,用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层,形成的ESC样集落,经两次亚克隆法分离培养成ESC;进行相差显微镜观察,采用阶段特异性胚胎抗原-1 (stage-spesific embryonic antigen,SSEA-1)对培养的ESC进行免疫组化染色. 结果:获得了稳定的ESC集落,传至第12代.ESC呈集落样生长,SSEA-1免疫组化染色强阳性.结论:两次亚克隆法获得的细胞具有ESC主要的生物学特性.     

用于胚胎干细胞分离培养的饲养层的制作

饲养层对胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES cell)的培养与建系十分重要。实验选择小鼠原代成纤维细胞(Priimary mouse embmy fibroblasts,PMEF)作为饲养层,这种饲养层能够较好地维持ES细胞未分化状态和二倍体核型。除选用经典的14．5d的孕鼠制做原代成纤维细胞外,我们还选了10d、18d、的孕鼠制成饲养层,通过ES-D3的传代培养结果表明：10-18d的PMEE均可作为饲养层用,10代内的饲养层培养细胞均适宜。     

人胚胎干细胞系的初步建立

目的：探讨人受精卵建立人胚胎干细胞系。方法：将体外受精获得的人受精卵发育至胚胎泡期,用机械法去除胚泡透明带后,取出内细胞团,分散后接种在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上,进行传代培养。通过碱性磷酸酶染色、胚胎干细胞特异性表面标志物检测、染色体核型分析和严重联合免疫缺陷（SCD）小鼠体内畸胎瘤形成实验,对连续传代的细胞进行鉴定。结果：9枚受精卵在体外培养5-7d后,5个存活并发育为胚泡,取出的内细胞团经接种培养,3个内细胞团存活,呈克隆性生长,发育为胚胎干细胞,并连续体外传代7个月保持未分化状态,建系成功。3个细胞系分别命名为CHE1、CHE3和CHE3。取3个细胞系第5、15和30代的细胞进行碱性磷酸酶染色,均为阳性。对CHE3第25、30、40代、CHE1和CHE2第21、22、30代的细胞检测人胚胎干细胞表面标志SSEA-4、SSEA-3、TRA-1-60和GCTM-2,结果均为阳性;检测小鼠胚胎干细胞表面标志SSEA-1,结果为阴性。染色体核型分析为二倍体核型。将连续传代5个月后（30代左右）的3个细胞系接种到SCID小鼠体内,6周后均形成畸胎瘤,组织病理学检查显示含有3个胚层的组织结构。结论：使用5个人受精卵来源的胚泡,成功地在体外建立了3个胚胎干细胞系,长期传代后仍保持胚胎干性和多向分化的能力。     

绿色荧光蛋白基因在小鼠胚胎干细胞中表达效率的影响因素分析

目的：研究绿色荧光蛋白（GFP）基因在小鼠胚胎干细胞系R1中表达的影响因素。方法：构建3个不同的GFP真核表达载体。并从转录,蛋白表达水平比较了它们整合于宿主细胞染色体中的表达效率。结果：在GFP蛋白表达水平上,含肽链延长因子（EF）启动子的表达载体和所转染的克隆明显高于含CMV启动子及含双拷贝CMV-GFP表达单元的表达载体;而录水平与蛋白质水平的测定结果相一致。结论：（1）在NIH3T3和R1胚胎干细胞系中,EF启动子引导下的GFP基因表达效率明显高于CMV启动子;（2）外源基因表达单元的拷贝数在染色体中的少量增加,不能明显提高表达效率;（3）获得了在R1胚胎干细胞系中稳定、高效表达GFP的载体,为后续工作奠定了基础。