精子孵育时间及培养液成分对小鼠体外受精和胚胎发育的影响

目的探讨精子孵育时间及培养液成分对小鼠体外受精和胚胎发育的影响,为人类辅助生殖技术完善质量控制体系创建可靠的平台。方法将精子获能时间分为3组,分别为0.5、1和2h,用HTF＋10%SSS和HTF＋10%FCS两种获能受精液,ICR雄鼠附睾尾的精子与成熟卵母细胞进行体外受精（IVF）。受精卵分别用IVC-ONE＋10%SSS、IVC-ONE＋10%FCS、HTF＋10%FCS和HTF＋10%SSS4种培养液对体外受精胚胎进行培养。结果结果获能时间为0.5h时,卵母细胞的受精率显著高于其他组,差异有高度统计学意义（P〈0.01）;获能时间若超过1h,受精率明显下降。胚胎用IVC-ONE＋10%FCS培养液进行培养时囊胚率和囊胚孵出率（89%和40%）显著高于IVC-ONE＋10%SSS（51%和29%）、HTF＋10%FCS（11%和2%）和HTF＋10%SSS（11%和0%）,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论小鼠体外受精时,宜选用HTF受精液,并获能0．5h;小鼠体外受精卵进行培养,以含10％FCS的IVC＋ONE为胚胎培养液,可获得较高的囊胚率,葡萄糖并不是小鼠胚胎形成囊胚所必需的;在含磷酸盐的培养液中EDTA不能有效克服ICR2-cell的体外发育阻滞现象。     

小鼠生殖泡期卵母细胞体外培养成熟、受精和胚胎发育的研究

为研究性成熟小鼠生殖泡期(GV)卵母细胞的体外成熟,同时比较体外成熟(IVM)和体内成熟组卵子的受精、胚胎发育情况,机械法分离性成熟小鼠卵巢中的GV期卵母细胞及刺激后的成熟卵母细胞,直接培养于[α-MEM+1 mg/ml Fetuin+10％FCS+1.5 IU/ml rHCG±5 ng/mlrEGF]中,16 h后移入f-HTF+10％FCS体外受精4 h,再在M16+10％FCS中培养72 h。记录其成熟、受精和胚胎发育情况,并与体内成熟的卵子比较。结果:GV期卵母细胞在含HCG培养液中成熟率为89.68％,培养液中添加EGF后,卵子成熟率无显著上升,但受精率、卵裂率均有显著提高(P<0.05)。体内成熟卵子的受精率可达62.83％,卵裂率60.18％;IVM组受精率仅48.92％,卵裂率36.69％,明显低于前者(P<0.01)。结论:小鼠GV期卵母细胞可体外培养成熟、受精和胚胎发育。培养液中添加促性腺激素和EGF都促进卵母细胞体外成熟、受精和胚胎发育能力。但IVM组卵母细胞的受精率、卵裂率低于体内成熟组,培养系统仍需改进。     

PCR技术在鼠肺支原体检测中应用的初步研究

目的　研究不同培养条件对小鼠卵母细胞体外成熟及体外受精率的影响。方法　小鼠卵母细胞分别在含有FSH、BSA和胰岛素的培养液中体外成熟,在Whitten 氏液中体外受精,比较体外成熟率、体外受精率。结果　1- 裸卵(DO) 的体外成熟率、体外受精率(81-4% ,31-0 % ) 均高于卵丘卵母细胞复合体(COC)(48-6 % ,27-1% ) 。2- 在培养液中添加FSH、胰岛素和BSA,卵母细胞的体外成熟率为77-9 % ,82-3% 、60-7% ;体外受精率为77-2 % 、72-6 % 、26-7% ;2 - 细胞率为49-2 % 、34-2 % 、10-0% 。胰岛素组的卵母细胞IVM 率最高,但IVF率、2 - 细胞率低于FSH 组。3- 添加BSA的两组的体外受精率只有26-7 % 、25-8 % ,显著低于其他组,其体外成熟率也较添加FSH 和胰岛素的组成。4- 排出第一极体(PbI) 的卵母细胞的体外受精率和2 - 细胞率(85-9 % ,22-4% ) 均高于GV期卵母细胞(71-1 % ,12-9 % ) 。结论　1- 卵丘卵母细胞(COC) 较裸卵(DO) 的体外成熟率、体外受精率都低,差异显著(P成熟< 0-01;P受精< 0-05) 。2-FSH 和胰岛素均能提高小鼠卵母细胞的体外成熟率、体外受精率。3-BSA可以降低小鼠卵母细胞体外受精率,差异极显著。4-GV 期卵母细胞的体外受精率显著低于体外培养的排出第一极体的卵母细胞(P2 - cell < 0-05,P受精<0-05)     

昆明小鼠成熟卵母细胞体外受精及受精卵体外培养的研究

目的通过比较获能受精液成分及成熟卵母细胞的处理方法，观察对昆明小鼠体外受精(IVF)效果的影响和用于早期胚胎培养的三种发育培养液培养效果，探讨并建立起适合于昆明小鼠卵子体外受精与受精卵体外发育的实验体系。方法用T6或FM两种获能受精液对采自昆明雄鼠附睾尾的精子与成熟卵母细胞进行体外受精(IVF)，受精前对成熟卵母细胞选用透明质酸酶去除卵丘细胞和不去卵丘细胞(对照组)两种方法进行处理，受精卵分别用M16、改良的CZB液(mCZB)和改良的M16液(mM16)三种发育培养液对体外受精胚进行培养。结果选用FM获能受精液的受精率极显著高于T6液(92．3％对64．7％)，且体外受精前先用透明质酸酶处理的成熟卵母细胞比对照组成熟卵母细胞受精率要低(59．2％对64．7％)，但差异不显著；用mM16培养液进行培养时桑胚率及囊胚率(55．3％和35．6％)显著高于mCZB(13．3％和8．1％)和M16培养液(17．3％和14．7％)，后两者差异不显著。结论昆明小鼠卵子体外受精时宜选用FM受精获能液，不宜用透明质酸酶去除卵丘细胞，且宜选用mM16培养液对昆明小鼠体外受精卵进行早期培养，其中的亚硫磺酸钠可有效的克服2-细胞胚后的体外发育阻滞现象。     

小鼠体外受精、胚胎培养及胚胎快速冷冻的研究

目的　为扩大胚胎来源并获取特定胚龄胚胎 ,建立小鼠冷冻胚胎库。方法　运用超数排卵、体外受精与胚胎培养及胚胎冷冻技术系统研究了小鼠受精卵的体内发育与运行规律。卵母细胞的体外成熟与受精、单细胞胚胎培养及胚胎快速冷冻。结果　 (1)注射hCG后 12～ 2 0h受精卵发育至原核期 ,4 2～ 4 8h为 2 细胞期 ,4 8～ 6 0h为 4 细胞期 ,6 0～ 6 8h为 8 细胞期 ,以上各期受精卵均处于输卵管中 ;75～ 78h为桑椹胚 ,78～ 80h为致密桑椹胚 ,90～ 92h为早期囊胚 ,92～ 96h为囊胚 ,以上各期均处于子宫角中。 (2 )培养液中添加促性腺激素 (FSH与hCG) ,能显著提高卵母细胞的体外受精率 ,添加FCS和激素组的体外受精率又显著高于单独添加激素组 ,FCS还能显著提高胚胎发育。 (3)在培养液中添加EDTA ,能有效克服小鼠胚胎的 2 细胞阻断 ,其 2 细胞胚的发育率达 10 0 % ,8 细胞胚发育率达 5 5 %以上 ;牛、羊上皮细胞培养液上清也能有效克服 2 细胞阻断。添加乳酸钠和丙酮酸钠可使 2细胞与 8细胞期胚的发育率显著提高。 (4)以D PBS +甘油 +蔗糖为冷冻液 ,以D PBS +蔗糖为稀释液 ,对小鼠胚胎进行快速冷冻 ,桑椹胚的存活率为 6 9 3% ,早期囊胚的存活率为 6 0 4 %。结论　研究为将生物技术应用于小鼠 ,扩大卵子和胚胎来源     

山羊卵泡大小对卵母细胞体外发育能力的影响

目的比较不同大小山羊卵泡的卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎发育的能力。方法收集不同大小山羊卵泡的卵母细胞,分3组进行体外培养。Ⅰ组：卵泡直径≥5.0mm;Ⅱ组：卵泡直径3.0～4.9mm;Ⅲ组：卵泡直径〈3.0mm。观察各组卵母细胞体外成熟率、体外受精率、卵裂率及囊胚形成率。结果3组卵母细胞体外成熟率与受精率差异无统计学意义（均P〉0.05）。Ⅲ组卵母细胞的卵裂率及囊胚形成率分别为53.8%和28.6%,均显著低于Ⅰ组和Ⅱ组（均P〈0.01）。结论在进行山羊未成熟卵体外成熟培养时,卵泡直径≥3mm的卵母细胞体外发育潜能较卵泡直径〈3mm的卵母细胞好。     

内膜下血管成形术动物模型的构建

目的探讨人用体外受精液用于实验大鼠体外受精的可行性,为实验大鼠的胚胎保种提供参考。方法选用人体外受精的IVF-20培养液作为大鼠精子获能和受精培养液,对SD、Wistar、GK、F344等四种不同品系的实验大鼠进行体外受精。并用mR1ECM培养液对SD大鼠体外受精所得胚胎进行体外培养试验。结果四个品系大鼠体外受精后的2细胞发育率分别可达83.2%、72.6%、87.8%和71.6%。体外受精的2细胞胚胎能够在体外进一步发育,SD大鼠囊胚发育率为16.7%,与体内受精胚胎在体外培养的囊胚发育率(24.5%)差异不显著。结论用于人体外受精的IVF-20培养液同样适合于实验大鼠精子的体外获能和受精,可以在多种品系获得较高的2细胞发育率,并且所得2细胞能够在体外发育到囊胚。     

猪卵母细胞在不同培养液中成熟后的发育潜力

目的 优化猪胚胎体外生产培养系统。方法 将猪卵母细胞在不同培养认中行体外成熟、体外受精，比较成熟率和卵裂率。结果 促性腺激素明显提高猪卵母细胞成熟率，其中以15IU／ml FSH 30IU/ml LH成熟率、卵裂率最高，分别为62％和15％。M199和NCSU－23基础培养液中的成熟率相近，但二者的卵裂率差异显著（15.7% vs 36%)；两种基础培养液中添加150μmol/L半胱氨酸后，仅M199培养液中出现促卵裂效应（P＜0.05)；添加1mmol/L dbcAMP后，卵母细胞的GVBD被阻止，去除dbcAMP后继续培养22h，实验组的成熟率和卵裂率分别为76.1%-83.3%和43.9%-52.9%率，显著高于基础液组和半胱氨酸单独添加组。结论 促性腺激素是猪卵细胞体外成熟的重要调节因子；dbcAMP通过调节卵体外成熟动力学，促卵母细胞分裂同步化，提高成熟和发育能力。     

不同成熟时期山羊卵母细胞冷冻保存研究

目的比较山羊卵母细胞在不同成熟时期解冻后体外成熟、体外受精及胚胎发育能力。方法收集山羊生殖泡（GV）期未成熟卵和成熟卵,分5组行开放式拉细麦管（OPS）法玻璃化冷冻,Ⅰ组：直接冷冻GV期卵;Ⅱ组：GV期卵在体外培养（IVC）8h后冷冻;Ⅲ组：GV期卵在IVC16h后冷冻;Ⅳ组：GV期卵体外培养成熟（IVM）后冷冻;Ⅴ组：直接冷冻体内成熟卵。解冻后比较各组卵受精率、卵裂率及8细胞胚胎形成率。结果Ⅰ组（GV期卵）冷冻解冻后存活率达56.8%,显著高于Ⅱ组（33.3%）、Ⅲ组（31.6%）、Ⅳ组（28.9%）及Ⅴ组（30.4%）,差异有高度统计学意义（均P〈0.01）。各组体外受精率、卵裂率及8细胞胚胎形成率比较,差异无统计学意义（P〉0.05）。结论采用OPS法玻璃化冷冻山羊GV期卵较冷冻其他成熟时期卵效果好。     

排卵前成熟卵泡液对卵母细胞体外成熟的影响

目的 :探讨成熟卵泡液、促性腺激素对人类生殖泡期 (germinalvesicle,GV)不成熟卵母细胞体外成熟 (invitromaturation ,IVM)的影响。方法 :在基本培养液中加入 5 0 %成熟卵泡液 (folliclefluids ,FF) (Ⅰ组 )、或促性腺激素 (gonadotrophin ,Gn) (Ⅱ组 )或单用基本培养液即对照组 (Ⅲ组 )用于GV期卵母细胞的体外培养 ,观察成熟率及进一步发育能力。结果 :三组之间GVBD(生殖泡期破裂 )率差异无显著性 (P >0 .0 5 ) ,MⅡ期率和受精率 ,Ⅰ、Ⅱ组明显高于Ⅲ组 (P <0 .0 1)、Ⅰ组与Ⅱ组之间无差异 (P >0 .0 5 ) ;Ⅰ组卵裂至 8细胞的比例为 6 2 .5 % ,明显高于Ⅱ组的33.3% (P <0 .0 1)。结论 :GV期卵母细胞尽管在基本培养液中可完成核成熟 ,但胞质不成熟 ,加入 5 0 %FF或Gn均能促卵母细胞的成熟 ,两者相比 5 0 %FF效果更好。     

人类卵子体外成熟及其胚胎冷冻复苏研究

目的:探讨取卵周期准备、卵泡发育状态、培养液成分对未成熟卵的获取率、体外成熟率、受精率、胚胎质量、胚胎移植后成功率及其胚胎冷冻复苏移植的影响。方法:19例进行卵子体外成熟的不孕不育患者为研究对象。其中1例为自然周期,14例为促性腺激素(Gn)诱导排卵周期,4例常规控制性促排卵(COS)周期;分别以TCM 199或人输卵管液(HTF)为基础培养液,进行卵子体外成熟培养。结果:当取卵时卵泡大小不均一且最大卵泡直径≥12 mm时,获卵率、受精率和胚胎质量下降;TCM 199组优质胚胎的形成率显著高于HTF组(P<0.01)。IVM胚胎经冷冻复苏、胚胎移植能获得与常规IVF周期相似的妊娠成功,出生后代健康、无畸形。结论:在IVM周期取卵时卵泡大小不均一且最大卵泡直径≥12 mm时,将影响胚胎着床率和累积妊娠率。TCM 199优于HTF培养液,能提高未成熟卵体外成熟后受精卵所形成胚胎的发育能力。IVM胚胎经冷冻复苏-胚胎移植能获得与常规IVF周期相似的妊娠成功,出生后代健康、无畸形。     

促性腺激素及雌二醇对小鼠卵母细胞体外成熟的影响

目的:探讨取卵前给予孕马血清(PMSG)或人绒毛膜促性腺激素(HCG)以及在培养液中添加不同浓度雌二醇对小鼠未成熟卵母细胞体外成熟(IVM)及胚胎发育的影响。方法:将雌性小鼠随机分成5组,即24 h PMSG组(取卵前24 h给小鼠腹腔注射PMSG)、48 h PMSG组(取卵前48 h给小鼠腹腔注射PMSG)1、6 h HCG组(取卵前16 h给小鼠腹腔注射HCG)、PMSG+HCG组(给小鼠腹腔注射PMSG 48 h后腹腔注射HCG 16 h取卵)和未用药组。取未成熟卵丘-卵母细胞复合体(COCs)置入含不同浓度E2(0,0.5,1.0,2.0 mg/L)培养液中培养24 h,并行卵细胞胞质内单精子注射(ICSI)及胚胎培养。比较各组之间卵母细胞成熟率、受精率和卵裂率。结果:①24 h PMSG组和48 h PMSG组COCs的卵母细胞成熟率明显高于未用药组或16 hHCG组,差异有统计学意义(P<0.05)。PMSG+HCG组的受精率和卵裂率明显高于其他4组(P<0.01)。②与对照组比较,1.0 mg/L E2组和1.5 mg/L E2组中COCs的卵母细胞受精率和卵裂率明显增高(P<0.05)。各浓度17β-E2组间以及与对照组比较DO的成熟率和受精率无显著差异(P>0.05),但极少数受精卵发生卵裂。结论:①取卵前给予小鼠PMSG或者联合给与HCG均可促进卵母细胞体外成熟,但不能提高其早期胚胎发育能力;取卵前给予小鼠HCG不能提高卵母细胞体外成熟及早期胚胎发育能力。②在培养液中添加一定浓度E2可促进未成熟卵母细胞胞质成熟,但不能促进核成熟。     

In-vitro Maturation of Immature Oocytes from Preantral Follicles in Prepuberal Mice

Objective To observe the morphological changes in in vitro growth of preantral follicle isolated from prepuberal mice and to assess impacts of gonadotropin （Gn）, insulin transferrin selenium （ITS） and epidermal growth factor （EGF） on their development. Methods Early preantral mice follicles （90-130μm diameter） were mechanical isolated and selected from 2 weeks＇ old mice and then cultured in alpha-minimal essential medium （α-MEM） with or without Gn, ITS and EGF. The preantral follicles were cultured singly in 20 miovliters droplets for up to 14 d. The medium was replaced and the .follicles were observed everyday. Granulosa cells （GC） prolification, antrum formation and oocyte maturation were recorded. Results The medium with Gn supported preantral follicle culture in vitro, during which they retained a three-dimensional structure, maintained oocytes viability and increased in diameter and number of somatic cells＇. Preantral follicles cultured in Gn medium grew obviously, while those without Gn grew slowly and after 6 d＇s culture began to shrink and blacken. Significant increase in survival rate and maturation rate of oocytes was observed in Gn group （P〈0.01）, with 92.9% survived and 28.7%formed an antrum. Further supplementation of the Gn medium with ITS and rLH, resulted in the significant increase in survival and maturation of preantral follicle （P〈0.05） Conclusions α-MEM can be the medium for in vitro culture （IVC） of preantral follicles, but need to be added with rLH/rFSH, rHCG/rEGF to facilitate thecal cell attachment, GC proliferation and oocyte maturation.     

应用人黄素化颗粒细胞条件培养液行人类胚胎体外培养

目的 研究卵泡壁颗粒细胞条件培养液在人类胚胎体外发育中的作用。方法 将卵泡液中回收的卵泡壁颗粒细胞,分别置于添加0．1％聚乙烯醇(PVA)和添加10％胎牛血清(FCS)的TCM-199培养系统中进行体外培养。结果 在无蛋白培养系统中,颗粒细胞能够缓慢生长,第三～五天达到生长高峰,群体倍增时间发生在培养的第二～三天,培养第一～五天可分泌雌二醇到培养液中(3．22～4．65pmol／ml)。在有蛋白培养系统中,颗粒细胞生长速度明显高于无蛋白的培养系统。使用颗粒细胞条件培养液,获得的囊胚在囊胚腔的大小和细胞数量上,均优于商品化囊胚培养液。结论颗粒细胞条件培养液有利于人类4-细胞以后胚胎的发育。     

磷酸二酯酶5选择性抑制剂zaprinast对小鼠卵母细胞成熟的影响

目的研究磷酸二酯酶5(PDE5)选择性抑制剂扎普司托(zaprinast)对小鼠卵母细胞体外成熟的影响。方法采用小鼠卵母细胞自发成熟、促卵泡刺激素(FSH)诱导次黄嘌呤(HX)阻滞成熟以及卵泡卵母细胞成熟三种体外培养模型。结果10μmol/L的zaprinast不仅能显著抑制小鼠卵丘卵母细胞复合体(COCs)和裸卵(DOs)的自发成熟(P<0.01),而且还能显著抑制FSH对HX阻滞的COCs的以及卵泡卵母细胞成熟的促进效应(P<0.01)。结论PDE5能促进小鼠卵母细胞的体外成熟。     

磷酸二酯酶抑制剂己酮可可碱对人精子受精力的影响

为进一步证明己酮可可碱(pentoxifylline,PF)对精子受精力的影响,对29例临床送检标本进行精液常规分析及体外受精实验.结果:6例精液常规及受精率均低于正常;14例精液常规正常, 但受精率低;9例精液常规及受精率均正常.所有标本均提取上游精子, 其中部分经体外获能后用作对照,部分用1mg/ml PF,37℃, 孵育0.5小时后再行体外获能.获能精子与去透明带金黄地鼠卵行异种体外受精,然后观察受精率,受精指数,及每个卵表面附着的精子平均数,结果提示PF对精液常规正常但受精力低下的精液标本有明显增强精子受精力的作用,这类患者精子经PF体外处理可能提高人工助孕技术的成功率.     

人外周血来源的成熟树突状细胞的体外无血清培养

目的探讨无血清条件下健康人外周血单个核细胞（PBMC）快速诱导生成成熟树突状细胞（dendritic cell,DC）的体外培养方法。方法分离获取健康者外周血PBMC,将细胞分为血清组和无血清组：设血清组A组为对照组,B、C、D组为无血清组。A组加入10%FCS的RPMI1640完全培养液,B组加入单核/巨噬细胞无血清培养液MΦ-SFM,两组均加入rhGM-CSF＋IL-4＋rhTNF-α培养9d;C组加入钙离子载体（CI）A23187,D组加入rhGM-CSF＋A23187,两组细胞均培养于MΦ-SFM中48h。于倒置显微镜下观察细胞形态,流式细胞术分析细胞表型,MTT比色法检测各组细胞刺激同种异体T淋巴细胞增殖的能力。结果在无血清条件下,单独给予A23187或A23187＋rhGM-CSF联合刺激48h,均可诱导PBMC分化成具有典型形态的DC;与血清组细胞相比,细胞表面标志CD80、CD86和CD83分子具有相似的高表达（P〉0.05）,对同种异体T淋巴细胞的刺激能力无显著性差异（P〉0.05）。结论在无血清培养条件下配合使用钙离子载体A23187,可以更快速、有效地诱导健康人PBMC分化成更成熟、功能更强的DC。