小鼠体外受精及其胚胎体外培养的比较研究

目的 通过比较不同品系小鼠体外受精情况以及不同培养液对C57BL/6J小鼠胚胎体外培养效果的实验,进一步完善小鼠体外受精和早期胚胎体外培养体系.方法 对C57BL/6J、DBA/2、FVB/NJ、BALB/c、KM、ICR及BARR Ⅱ小鼠进行超排和体外受精,并对C57BL/6J小鼠体外受精后的2-细胞胚胎用HTF、CZB、KSOM、M16、HECM五种培养液在相同条件下进行体外培养到囊胚,计算4-细胞～囊胚的发育率.结果 各品系小鼠平均排卵数为13.0～38.7个(P＜0.01),体外受精率为70.2%～92.8%(P＜0.05).不同培养液至4-细胞的发育率为60.3%～95.8%,其中KSOM的4-细胞发育率为95.8%,最适合2-细胞向4-细胞的发育.8-细胞发育率为52.8%～91.1%,桑椹胚发育率为40.6%～87.5%,囊胚发育率为5.1%～75.4%,各阶段胚胎发育率均差异显著.其中适合于金黄仓鼠桑椹胚、囊胚发育的HECM-2并不支持C57BL/6J囊胚的发育,其囊胚发育率只有5.1%,CZB最适合其囊胚的发育.结论 遗传背景是影响小鼠超排及体外受精效果的主要因素之一.葡萄糖的存在不利于克服2-细胞发育阻断,胚胎在8-细胞期以前,主要能源物质不是葡萄糖,直到桑椹胚后期,葡萄糖才是主要的能量物质.磷酸盐可引起胚胎发育阻断.氨基酸和EDTA有利于克服胚胎发育阻滞.     

不同品系小鼠的体外受精、胚胎冷冻及移植的比较研究

目的　探讨不同品系小鼠的体外受精、胚胎和精子的低温保存效果。方法　本实验分别在中国科学院上海实验动物中心 (SLAC)和日本熊本大学动物资源开发中心 (CARD)对 13个品系小鼠 (C57BL 6J、BALB c、C3H HeJ、ICR、KM、FVB、MRL、NOD、CBA、DBA 2、CD 1、BDF1、B6C3F1)的体外受精 (IVF)率、胚胎培养及移植成绩进行了比较研究。结果　各品系小鼠新鲜精子的IVF率 15 1%～ 87 9% ,冻融精子的IVF率 8%～ 80 % ;冷冻胚胎的复苏率4 2 6 %～ 83 9% ;冻融胚胎移植后的产仔率在 17 8%～ 5 1 8%。结论　遗传背景不同的小鼠体外受精率、冷冻胚胎复苏率和胚胎移植的产仔率差异有显著性。但同一品系两个实验室间的新鲜精子的IVF率、冷冻胚胎的复苏率及移植产仔率差异无显著性 (P >0 0 5 ) ;冻融精子的体外受精率CARD明显高于SLAC(P <0 0 1)。     

小鼠胚胎干细胞的培养

ＥＳ细胞的培养应满足促进细胞增殖和抑制细胞分化而保持其高度未分化潜能。我们用胚胎成纤维细胞作为饲养层，培养基ＤＭＥＭ中加白血病抑制因子的方法来培养ＥＳ细胞。培养的ＥＳ细胞呈集落状生长，细胞排列紧密，呈未分化状态。胚胎成纤维细胞作为饲养层是分离培养ＥＳ细胞最普遍使用而且有效的方法。本文还围绕ＥＳ细胞培养中的促进增殖和抑制分化这两个方面的影响因素进行了讨论。     

近交系小鼠胚胎玻璃化冷冻技术研究

目的 对近交系小鼠体内受精的胚胎在三种不同处理温度(20℃、25℃、28℃)进行玻璃化冷冻保存。方法 不同温度下,胚胎在10％EG溶液中预处理5min,再投入EFS40玻璃化溶液中1min,平衡后冷冻。结果 与20℃和28℃相比,三个品系小鼠的胚胎都在25℃冷冻时获得最佳效果,解冻后培养观察发育率分别是87．77％、90．00％、87．18％。结论 该结果对近交系小鼠胚胎保存具有重要意义。     

两种不同培养体系对卵母细胞体外受精及胚胎体外发育的影响

目的　挑选出一种较为理想的体外受精(IVF)培养体系。方法　90例(91个周期)接受IVF/单精子胞浆内注射(ICSI)技术治疗的患者,卵母细胞的IVF及胚胎的体外培养分别采用GⅢ体系(A组, 51周期, )和Quinn体系(B组,40周期)。结果　A组和B组分别获得683枚和652枚卵母细胞,IVF后,受精率分别为63 .25% ( 432 /683 )及66 41%(433 /652),无显著性差异(P>0. 05)。体外培养24h后,A组414枚受精卵发生卵裂,卵裂率为95. 83% ( 414 /432 );B组397枚受精卵发生卵裂,卵裂率为91 69% (397 /433) ,无显著性差异(P>0 .05)。继续培养,行第3天胚胎移植,A、B两组分别获得优质胚胎220及140枚(53. 14%和35. 26% )。最终,A组共有26例获得临床妊娠,B组15例获得临床妊娠,妊娠率为50. 98%和37. 5%,两者之间有显著性差异(P<0 .05)。另外,B组中受精率、卵裂率、优质胚胎率及临床妊娠率方面,IVF周期与ICSI周期之间无显著性差异(P>0. 05),而A组中优质胚胎率及临床妊娠率方面,有显著性差异(48. 97%和63 .11%, 45 .71%和56 25%,P<0 05),受精率和卵裂率方面两周期之间无显著性差异(P>0. 05 )。结论　Quinn系列似乎有助于卵母细胞的体外受精,而GⅢ体系更有利于胚胎的早期发育及后期的着床方面。对于GⅢ系列采取ICSI授精方式似乎更能提高试管婴儿的     

小鼠早期胚胎的体外培养研究

目的 寻求一种体外稳定培养早期胚胎的方法。方法 比较了不同培养基(M16、G1、CZB)从受精卵到囊胚的培养效果，并对CZB做了加糖与不加糖、加BSA与15％FBS的比较研究。对体外形成的囊胚做细胞记数以评估胚胎的质量。结果 CZB无论加糖还是不加糖，均能有效克服2-细胞阻滞(70．0％～84．6％)，加糖CZB囊胚形成率(46．1％～50．0％)更高。受精卵一直在无糖CZB中培养与第3d后转入加糖CZB培养的桑椹胚和囊胚形成率无显著性差异。CZB中加BSA和15％FBS的培养效果相当。体外培养形成的囊胚较体内发育有迟滞现象，但是细胞记数无显著性差异。结论 对于昆明小鼠早期胚胎的体外培养，CZB是较M16、G1更适合的培养基，且CZB中从一开始就应该加糖。CZB中加BSA足可取代FBS，其培养的胚胎无明显异常。     

小鼠胚胎原始生殖细胞的体外培养

采用细胞生物学方法和组织培养技术研究小鼠胚胎原始生殖细胞(PGCs)的一般形态学特征及生物学特点.在体外培养条件下,PGCs 按体积大小可分大、中、小3类。本研究发现,中、小型原始生殖细胞在培养的第2、3 d 增多,形态似大型原始生殖细胞。培养中的 PGCs 不贴壁而悬浮生长于培养液中,培养到第6～7 d时开始死亡。体细胞(间充质细胞或间皮细胞)贴壁生长,生长旺盛,与PGCs 同时死亡。     

HBV—C转基因小鼠快速胚胎冷冻方法的建立

目的 建立用于转基因小鼠种质保存的快速胚胎冷冻方法。方法 用乙二醇作为抗冻保护剂,对携带HBV—C基因的转基因小鼠模型进行了玻璃化胚胎冷冻保存的研究。结果 发现含体积分数30％乙二醇的冷冻液可达到最佳的冷冻效果,有81．54％的冷冻胚胎在体外可进一步发育,其中69．81％达到孵化阶段,比较不同发育阶段的胚胎的冷冻效果发现,致密桑椹胚解冻后的孵化率显著高于囊胚。不同的装管方法对胚胎的回改率也有影响,五段法的胚胎回收率显著高于二段法。将解冻后形态正常的胚胎82枚移植给8只假孕母鼠,5只怀孕,怀孕率为62．5％,产下28只小鼠,产仔率为54．9％。结论 一步法玻璃化冷冻方法可用于转基因小鼠的种质保存。     

小鼠胚胎冷冻研究

目的 探讨小鼠胚胎冷冻保存方法。方法 用EG40、ES40、EFS403种冷冻液进行小鼠胚胎快速冷冻，比较解冻后胚胎的发育率、孵化率、着床率。结果 EFS40冷冻液冷冻效果最好，与对照组相比无明显差异；ES40其次，EG40效果最差。结论 EFS40冷冻液适合用于小鼠胚胎冷冻保存。     

乙醇对小鼠胚胎体外发育影响的研究

用含不同浓度乙醇的 Whitten氏培养液对小鼠 2细胞、4细胞、8细胞和桑椹期胚胎分别进行体外培养 ,研究乙醇对小鼠不同发育时期胚胎体外发育的影响。首先利用含 0 .0 1%、0 .5 %、1.0 %、1.5 %、2 .0 %、3.0 %、5 .0 %、10 .0 %乙醇的 Whitten氏培养液对 2细胞胚胎进行培养 ,观察研究小鼠 2细胞胚胎对培养液中乙醇浓度的耐受极限。然后再用含 1%和 3%乙醇的 Whit-ten氏培养液分别对小鼠 2细胞、4细胞、8细胞和桑椹期胚胎进行培养。结果 :含低浓度乙醇 (1%以下 )的培养液对外细胞胚胎和桑椹胚的囊胚形成有促进作用 ,而在 2细胞和 4细胞胚胎…     

昆明小鼠成熟卵母细胞体外受精及受精卵体外培养的研究

目的通过比较获能受精液成分及成熟卵母细胞的处理方法，观察对昆明小鼠体外受精(IVF)效果的影响和用于早期胚胎培养的三种发育培养液培养效果，探讨并建立起适合于昆明小鼠卵子体外受精与受精卵体外发育的实验体系。方法用T6或FM两种获能受精液对采自昆明雄鼠附睾尾的精子与成熟卵母细胞进行体外受精(IVF)，受精前对成熟卵母细胞选用透明质酸酶去除卵丘细胞和不去卵丘细胞(对照组)两种方法进行处理，受精卵分别用M16、改良的CZB液(mCZB)和改良的M16液(mM16)三种发育培养液对体外受精胚进行培养。结果选用FM获能受精液的受精率极显著高于T6液(92．3％对64．7％)，且体外受精前先用透明质酸酶处理的成熟卵母细胞比对照组成熟卵母细胞受精率要低(59．2％对64．7％)，但差异不显著；用mM16培养液进行培养时桑胚率及囊胚率(55．3％和35．6％)显著高于mCZB(13．3％和8．1％)和M16培养液(17．3％和14．7％)，后两者差异不显著。结论昆明小鼠卵子体外受精时宜选用FM受精获能液，不宜用透明质酸酶去除卵丘细胞，且宜选用mM16培养液对昆明小鼠体外受精卵进行早期培养，其中的亚硫磺酸钠可有效的克服2-细胞胚后的体外发育阻滞现象。     

精子孵育时间及培养液成分对小鼠体外受精和胚胎发育的影响

目的探讨精子孵育时间及培养液成分对小鼠体外受精和胚胎发育的影响,为人类辅助生殖技术完善质量控制体系创建可靠的平台。方法将精子获能时间分为3组,分别为0.5、1和2h,用HTF＋10%SSS和HTF＋10%FCS两种获能受精液,ICR雄鼠附睾尾的精子与成熟卵母细胞进行体外受精（IVF）。受精卵分别用IVC-ONE＋10%SSS、IVC-ONE＋10%FCS、HTF＋10%FCS和HTF＋10%SSS4种培养液对体外受精胚胎进行培养。结果结果获能时间为0.5h时,卵母细胞的受精率显著高于其他组,差异有高度统计学意义（P〈0.01）;获能时间若超过1h,受精率明显下降。胚胎用IVC-ONE＋10%FCS培养液进行培养时囊胚率和囊胚孵出率（89%和40%）显著高于IVC-ONE＋10%SSS（51%和29%）、HTF＋10%FCS（11%和2%）和HTF＋10%SSS（11%和0%）,差异有高度统计学意义（P〈0.01）。结论小鼠体外受精时,宜选用HTF受精液,并获能0．5h;小鼠体外受精卵进行培养,以含10％FCS的IVC＋ONE为胚胎培养液,可获得较高的囊胚率,葡萄糖并不是小鼠胚胎形成囊胚所必需的;在含磷酸盐的培养液中EDTA不能有效克服ICR2-cell的体外发育阻滞现象。     

山羊体外受精的研究

通过在山羊卵母细胞体外成熟培养液中添加不同的血清和不同浓度的卵泡液 ,在体外成熟培养液中培养不同的时间 ,以及采用不同的精子获能方法来摸索效率较高的体外受精方法体系。在山羊卵母细胞体外成熟培养液中添加FCS、EGS及不同浓度的卵泡液 ,成熟培养时间分别为 16、2 0、2 4和 2 7h ,山羊新鲜精液用钙离子载体法和肝素法进行获能处理后用于体外受精 ,比较其体外成熟率和体外受精率。添加FCS、EGS和 2 0 %卵泡液组的成熟率无显著差异 ,显著高于添加 10 %和 3 0 %卵泡液组的成熟率 ;但添加FCS和EGS组的受精率显著高于添加10 %、2 0 %、3 0 %卵泡液组的受精率。培养 2 4h组和 2 7h组的成熟率显著高于另外两组 ,而培养 2 7h组的受精率显著高于其余各组。用钙离子载体法处理的山羊精子的顶体反应率和体外受精率显著高于肝素法。EGS可以代替FCS添加于成熟培养液中 ,对COCs的成熟率和受精率没有明显的影响 ,但卵泡液不能完全代替FCS的作用。培养时间为 2 7h ,精子用钙离子载体法处理获能后能得到较高的体外受精率     

FVB小鼠精子冷冻及体外受精的研究

目的：探索FVB小鼠及FVB遗传工程小鼠种系保存的新途径.方法：用孕马血清和人绒毛膜促性腺激素（HCG）超排FVB小鼠,并分别用复苏精子和新鲜精子进行体外受精并将受精卵移植到假孕雌鼠输卵管中,比较两种精子的受精率;对注射HCG后13,15,17h不同时间采集FVB小鼠的卵母细胞进行体外受精,比较其受精率及体外培养至2细胞情况.结果：新鲜精子的受精率（62.4%）略高于冷冻复苏精子的受精率（58.1%）;在注射HCG 13～15 h后取FVB小鼠卵母细胞其受精率效果较好,受精率（60.2%、61.6%）显著高于17h取卵的受精率（51%）,但13,15,17 h采集卵母细胞体外受精后胚胎发育至2细胞及异常卵数无显著性差异.结论：本研究将为FVB小鼠及FVB遗传工程小鼠的种系保存、繁殖提供了基础.     

体外受精-胚胎移植后异位妊娠相关因素分析

目的分析体外受精（IVF）或卵母细胞胞质内单精子注射（ICSI）后进行新鲜或冻融胚胎移植（ET）妇女异位妊娠的发生情况及其影响因素。方法对接受胚胎移植治疗后获得临床妊娠的1564个周期的病因、年龄、移植时机、不育形式等高危因素进行回顾性调查。采用SPSS17．0软件进行统计学分析,计数资料采用t检验,计量资料采用x2检验,相关性统计采用Logistic回归分析。结果冻融周期ET后异位妊娠发生率明显低于新鲜周期ET。年龄≤30岁的患者ET后发生异位妊娠率高于年龄〉30岁者,继发不孕者较原发不孕者发生异位妊娠的比例更高。结论年龄、移植时机和不育形式是体外受精一胚胎移植后发生异位妊娠的重要相关因素。     

获能培养液等因素对遗传工程小鼠冻融精子体外受精率的影响

目的 探讨遗传工程小鼠精子冷冻、复苏及体外受精率的效果,建立简便、经济的遗传工程小鼠保种体系.方法 采用精子冷冻、体外受精和胚胎移植技术,比较了精子获能培养液、雄鼠周龄及精子冻存液等因素对于遗传工程小鼠精子冷冻保存的影响.结果 用CPA精子冻存液冷冻保存精子,精子复苏后用PM精子培养液获能培养,体外受精率在82.49%～91.43%,而HTF精子培养液的体外受精率为14.46%～27.38%,同品系间差异极显著(P<0.01);10～35周龄的雄鼠精子均能成功冷冻、受精,移植后产仔;使用R18S3,CPM,CPA三种不同精子冻存液冷冻遗传工程小鼠精子,复苏后采用PM精子培养液体外受精,受精率分别是75.85%、88.89%和94.27%,移植后得到阳性小鼠;体外受精后的胚胎成功冷冻保存,移植后产仔.结论 采用CPA精子冻存液冷冻保存精子,精子复苏后用PM精子培养液体外受精,能够更有效地保存遗传工程小鼠.     

NO对小鼠卵母细胞及胚胎发育的影响

目的 评价外源性NO对小鼠卵母细胞体内成熟、体外受精及胚胎发育的影响. 方法受试雌性小鼠超排卵期间分别腹腔注射NO供体硝普钠(SNP)1.0、5.0和10.0 mg/kg,对照组雌性小鼠注射等量的生理盐水.注射hCG 15 h后处死小鼠,收集卵母细胞进行体外受精和胚胎培养,观察卵母细胞的成熟度、受精率、早期胚胎的发育能力及其形态学变化.结果 5.0 mg/kg SNP组M Ⅰ期卵母细胞和M Ⅱ期卵母细胞的比例较对照组和1.0 mg/kg SNP组升高(P＜0.05,P＜0.01),而受精率降低(P＜0.01),10.0 mg/kg SNP组小鼠在注射药物20 min后全部死亡;5.0 mg/kg SNP组2-细胞胚胎以后各阶段胚胎的卵裂率低于对照组和1.0 mg/kg SNP组(P＜0.01),并被阻滞在桑葚胚期;5.0 mg/kg SNP组形态异常胚胎的比例高于对照组和1.0 mg/kg SNP组(P＜0.01).结论 较高浓度NO抑制卵母细胞体内成熟、体外受精及早期胚胎发育并影响胚胎的质量.     

子宫内膜异位症患者卵泡液对小鼠成熟卵子体外受精的影响

目的：探讨子宫内膜异位症患者卵泡液对小鼠成熟卵母细胞体外受精的影响。方法：小鼠经HMG及HCG促排卵,处死后收集其输卵管内成熟卵母细胞。将收集到的卵母细胞随机分为三组进行体外受精：空白对照组：DMEM液＋10％胎牛血清＋50IU／ml青霉素＋50μg／ml链霉素;研究组：DMEM液＋10％胎牛血清＋50IU／ml青霉素＋50μg／ml。链霉素＋40％子宫内膜异位症患者卵泡液;对照组：DMEM液＋10％胎牛血清＋50IU／ml青霉素＋50μg／mL链霉素＋40％输卵管因素不孕患者卵泡液。观察三组卵子体外受精情况。结果：研究组、对照组及空白对照组体外受精率分别为68．28％,74％,78．5％。三组体外受精情况比较,无显著性差异（P〉0．05）。结论：子宫内膜异位症患者卵泡液对小鼠成熟卵母细胞的受精能力无明显影响。     

剖宫产与体外授精技术在小鼠生物净化中的应用

目的 采用剖宫取胎和体外受精对微生物级别达不到SPF级的小鼠进行生物净化.方法 对于具有正常繁殖能力的小鼠品系,通过对阴道栓的检查和触诊确定剖宫产取胎时间,采用子宫摘除手术对小鼠进行剖宫产,取出仔鼠用SPF级受体母鼠代乳,观察代乳情况及代乳仔鼠成活率;对于繁殖力较差或者丧失繁殖能力的品系,采取辅助生殖的方式,采集小鼠精子和卵子,在HTF液中受精,培养3.5 d后的胚胎移植到SPF级受体母鼠子宫内,待产仔.结果 两种方式净化的小鼠断奶后进行微生物检测,均达到SPF级.结论 对微生物级别达不到SPF级但不含垂直传播病原体的小鼠,采用两种方式可有效提高小鼠的微生物等级.     

人体外受精与胚胎移植的研究(附试管婴儿1例报告)

介绍了我校一院人卵体外受精与胚胎移植的研究概况，并报告１例采用ＦＳＨ／ＨＭＧ／ＨＣＧ方案超促排卵，进行体外受精－胚胎移植，临床妊娠成功。１９９７年９月２１日，经剖宫产术获得１男婴。