负载U266细胞抗原的树突状细胞诱导T细胞的抗骨髓瘤活性

本研究探讨负载骨髓瘤U266细胞裂解物的树突状细胞（DC）瘤苗活化的T细胞对U266细胞的体外杀伤作用。用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,然后分别用含重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、重组人白细胞介素-4（IL-4）的AIM-V无血清培养液和含胎牛血清的RPMI1640培养液体外诱导培养DC,用MTT法检测负载U266细胞全抗原的DC活化的T细胞对U266细胞的杀伤作用。结果表明：健康人外周血来源的单个核细胞用无血清培养液和含血清培养液诱导培养均可得到足够数量的DC,这两种培养液培养的DC在表型上无明显差异。分别用负载U266细胞全抗原的DC＋IL-2、成熟DC＋IL-2和单独应用IL-2刺激后的T细胞与U266细胞共培养,其对U266细胞的杀伤作用逐渐减弱,负载U266细胞全抗原的DC＋IL-2刺激后的T细胞较成熟DC＋IL-2刺激后的T细胞对U266细胞的杀伤作用明显,且T细胞对U266细胞的杀伤率随效靶比的增加而升高。结论：用GM-CSF、IL-4诱导培养健康人外周血单个核细胞可以得到不成熟的DC,体外负载U266细胞全抗原的DC可以刺激自体T细胞增殖并能杀伤U266细胞。     

抗原冲击致敏树突状细胞诱导特异性CTL杀伤Jurkat细胞实验研究

本研究以健康人外周血单核细胞为前体细胞，体外诱导其为树突状细胞（DC），分别负载Jurkat细胞冻融抗原及WT1多肽抗原，产生特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL），以探讨其对白血病Jurkat细胞的杀伤作用。联合应用rhGM—CSF、rhIL-4、rhTNF-α及rhsCD40L等细胞因子，密度梯度离心法、贴壁法从外周血获取单核细胞并进行诱导扩增，培养出DC，分别用冻融抗原及WT1多肽抗原冲击致敏DC。实验分4组：冻融抗原致敏DC组为实验组A，WT1多肽致敏DC组为实验组B，未致敏DC组为对照组A，单核细胞组为对照组B，观察CTL对Jurkat细胞的杀伤作用。结果表明：培养出了具有典型特征的DC，它高表达CD40、CD80、CD1a及CD86等表面标志，能体外诱导强烈的同种异基因混合淋巴细胞增殖反应。实验组显示高水平杀伤率，与对照组比较均具有统计学意义（P〈0.01），实验组A、B间比较无统计学意义。结论：Jurkat细胞冻融抗原及WT1多肽抗原冲击致敏DC能有效诱导T细胞抗白血病作用，为临床研制DC疫苗提供了实验依据。     

致敏的脐血源树突状细胞诱导CTL特异杀伤白血病细胞的实验研究

探讨脐血单个核细胞（MNC）诱导的树突状细胞（DC）通过负载冻融的HL-60、K562细胞抗原体外诱导产生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）对HL-60、K562的杀伤作用。取脐血12份,分离MNC。在MNC中加入细胞因子GM-CSF（granulocyte monocyte colony-stimulating factor）、IL-3（interleukin 3）、SCF（stemcell factor）和EPO培养4周。使用CD83、CD1a、CD11C和CDw123单克隆抗体、流式细胞仪测定培养前后脐血DC抗原变化及扩增情况。DC通过负载HL-60、K-562白血病细胞抗原致敏T淋巴细胞产生CTL^3H-TdR掺入试验测定DC免疫刺激活性,MTT法观察CTL对HL-60、K562细胞的特异性杀伤活性。结果表明：新鲜脐血CD1a^＋、CD11c^＋、CD83^＋、CDw123^＋细胞数分别为0．27×10^5／ml、5．87×10^5／ml、1．94×10^5／ml、2．73×10^5／ml。加入上述细胞因子培养的脐血MNC分化为CD1a^＋、CD11C^＋、CD83^＋、CDw123^＋DC,经培养2—4周,DC数明显增多,分别达11．02×10^5／ml、28．24×10^5／ml、10．57×10^5／ml、18．7×10^5／ml,此后逐渐减少。细胞因子诱导脐血DC具有免疫刺激活性,且DC与CBMNC细胞比例为1：40时的刺激活性最佳。冻融法得到的HL-60、K562白血病细胞抗原致敏DC诱导的CTL对HL-60、K562细胞的杀伤率分别为（42．04±8．46）％和（31．25±11．07）％,与实验组比较有显著性差异（P〈0．01）。结论：加入细胞因子GM—CSF、IL-3、SCF和EPO培养2-4周的脐血MNC可分化为cD1a^＋、CD11C^＋、CD83^＋、CDw123^＋DC。冻融法得到的HL-60、K562白血病细胞抗原致敏DC,其诱导的CTL对HL-60、K562细胞具有特异的杀伤作用。脐血DC作为抗原呈递细胞在肿瘤免疫治疗上将起到重要作用。     

转染慢性粒细胞白血病总RNA对树突状细胞介导的抗白血病作用的体外研究

目的体外诱导和鉴定慢性粒细胞白血病-树突状细胞（CML—DC）,并探讨人慢性粒细胞白血病（CML）总RNA体外转染对其介导的特异性细胞毒T淋巴细胞（CTLl对慢性粒细胞白血病细胞杀伤作用的影响。方法分离14例CML患者骨髓单个核细胞．加入rhIL-4、rhGbl—CSF、rhTNF-α诱导培养CML—DC。分别于培养第1、3、6、14d用倒置显微镜进行形态学观察．流式细胞术检测免疫学表型,染色体G显带技术检测其染色体核型,逆转录聚合酶链反应（RT—PCRIl检测bcr—abl融合基因。并于CML-DC培养第5d,加人CML细胞总RNA脂质体转染,或裸总RNA转染,或不加任何试剂继续培养的DC,共三种CML—DC．分别致敏T淋巴细胞．另设以IL-2培养的T淋巴细胞为对照组,比较不同组别的致敏T淋巴细胞的杀伤活性。结果CML骨髓单个核细胞诱导前CDlct、CD83表达均在5％以下。而诱导成熟的CML—DC细胞CDla、CD83阳性表达率分别为20．13~3．43％、26．76＋2．79％,较诱导前均明显增高（P〈0．01）。CML-DC细胞均存在Phl染色体,并表达bcr-abl融合基因。总RNA脂质体转染CML—DC、裸总RNA转染CML—DC、单纯CML—DC分别致敏的T淋巴细胞在效：靶比为20：1时对CML单个核细胞的杀伤效率分别为75．33±3．11％、37．23±2．92％、29．62±1．61％,均明显高于对照组f9．87＋3．43％,P〈0．01）。总RNA脂质体转染的CML—DC所诱导的CTL杀伤活性最强．与后三组杀伤活性均有显著性差异（P〈0．001）。结论CML—DC既具有CML白血病源性．又具有DC细胞的特性,并能诱导特异性CTL杀伤白血病细胞。经脂质体转染CML细胞总RNA可以提高CML-DC介导的CTL特异性杀伤慢性粒细胞白血病细胞。     

卵巢癌抗原冲击DC在体外对SKOV3细胞作用的研究

目的探讨卵巢癌患者外周血和腹水中培养的树突细胞(DC)在体外激活淋巴细胞产生的肿瘤特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)作用,及其对卵巢癌SKOV3细胞的杀伤作用。方法分别培养卵巢癌患者外周血及腹水来源DC,进行细胞形态学观察及细胞表面分子表达检测;以卵巢癌冻融抗原致敏DC,检测两种来源DC刺激T淋巴细胞增殖的能力及对IL-2水平的影响;检测抗原负载DC与T细胞诱导CTL对卵巢癌细胞的杀伤作用。结果镜下显示卵巢癌患者外周血及腹水来源的DC形态学无明显差异,腹水来源DC成熟时间较外周血来源DC晚,二者表面分子表达的阳性率除CD83外无明显差异;卵巢癌冻融抗原负载DC上调其表面相关分化抗原表达,统计学差异具有显著性(P0.05);经卵巢癌冻融抗原负载后的DC刺激T淋巴细胞的增殖,差异有显著性(P0.05),但两种来源DC间刺激指数无统计学差异;抗原负载DC与无抗原负载DC相比,其上清中IL-12浓度增高,差异具有显著性(P0.05);负载与不负载抗原的DC对卵巢癌细胞杀伤作用增强,与对照组相比具有显著性差异(P0.05),随着效应细胞数量的增高,杀伤作用增强,加入IL-2增强其杀伤作用,但外周血及腹水来源DC间相应情况下对卵巢癌细胞的杀伤作用无统计学差异(P0.05)。结论卵巢癌患者外周血及腹水来源的DC均具有诱导CTL作用,DC作为载体负载肿瘤抗原后可以激发T淋巴细胞形成CTL,在体外有效的杀伤卵巢癌SKOV3细胞。     

青蒿琥酯诱导凋亡的U937细胞负载树突状细胞后的免疫应答

本研究探讨凋亡白血病细胞负载的树突状细胞（dendritic cells,DC）能否诱导特异性细胞毒T淋巴细胞反应。用青蒿琥酯诱导U937细胞凋亡,从正常人外周血单个核细胞诱生DC,将凋亡U937细胞负载DC,并添加TNF-α诱导DC成熟,然后与自体T淋巴细胞共育,并联合IL-2以诱生细胞毒性T淋巴细胞（CTL）;应用流式细胞术分析DC和T细胞免疫表型,采用Dextran-FITC内吞试验检测DC的抗原摄取能力;用ELISA法检测IL-12p70的产生;采用MTT法检测凋亡U937细胞负载及未负载DC诱导的自体T淋巴细胞对不同的靶细胞（U937细胞和NB4细胞）的杀伤效应。结果表明：青蒿琥酯1μg/ml作用于U937细胞48小时后,U937细胞的凋亡率达51.52%,DC在未成熟阶段时吞噬Dextran-FITC的能力最强,负载凋亡U937细胞之后并不能促使未成熟DC（iDC）分化为成熟DC（mDC）。凋亡U937细胞负载后的iDC在TNF-α的作用下能够成为mDC。与未负载的mDC相比,凋亡U937细胞负载后的mDC（mDC-^ApoU937）分泌IL-12p70水平明显增高,而且由其所激发和扩增的T细胞以CD8^＋的T细胞为主。细胞毒性实验显示：mDC-^ApoU937诱导的T细胞的对U937细胞的杀伤显著超过对NB4细胞的杀伤。结论：mDC-^ApoU937能有效地诱导特异性抗白血病效应。     

表达新疆出血热病毒S基因片段的重组腺病毒特异性CTL功能测定

目的 通过表达新疆出血热病毒（XHFV）S基因片段的重组腺病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）功能测定，探求由XHFVS基闪片段编码的核衣壳蛋白作为抗原诱导的特异性CTL细胞对蓖组腺病毒致敏的靶细胞杀伤能力大小。方法 PCR扩增XHFVS基因的cDNA片段，将扩增后的cDNA片段克隆入腺病毒自主载体，使其成为重组腺病毒，用重组腺病毒感染Balb／C小鼠后，利用非放射性乳酸脱氰酶（LDH）释放法测定重组腺病毒的特异性CTL功能。结果 在一定比例范围内，效应细胞与靶细胞的比例越高，持异性CTL％越高。结论 由XHFVS基因片段编码的核衣壳蛋白抗原诱导的特异性CTL细胞，能特异性地杀伤重组腺病毒致敏的靶细胞；证实由腺病毒自主载体本身所表达的一些蛋白质也可诱导细胞免疫，由该载体所引发的细胞免疫对疫苗接种不利。     

自身肺癌抗原致敏DCs的抗肺癌体外免疫效应研究

目的探讨自身肺癌抗原致敏树突状细胞（DendriticCeil，DC）的体外免疫效应。方法体外原代培养肺癌细胞，并制备冻融抗原，冲击DCs，致敏肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）和外周血T淋巴细胞，MTT法检测DCs瘤苗体外联合抗肺腺癌细胞效应。结果采用效靶比为30：1和20：1的比例，30：1和20：1的CTL杀伤率为（18．21±2．89）和（24．69±3．51）；30：1和20：1的CTIL杀伤率为（25．46±3．02）和（27．52±2．68），CTIL比CTL杀伤率高（P〈0．05）。结论负载自身肺癌抗原的DCs致敏的肿瘤浸润淋巴细胞TIL比外周血T淋巴细胞杀伤率高，为肺癌的生物治疗提供了新的思路。     

树突细胞介导的独特型瘤苗的体外抗骨髓瘤作用

目的研究树突细胞（DC）介导的独特型瘤苗诱导骨髓瘤抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的抗肿瘤免疫反应。方法从多发性骨髓瘤（MM）患者外周血中分离获取DC前体细胞，使用GM-CSF、IL-4与TNF-α诱导分化促成熟。加入MM患者的M蛋白F（ab′），片段（Id），诱导MM肿瘤特异性CTL。光学显微镜下观察其培养过程中形态特征变化，电镜观察其超微结构，间接免疫荧光观察其表型特征，采用MTT法检测致敏DC促自体T淋巴细胞增殖的能力以及患者CTL对自体骨髓瘤细胞的特异性细胞毒杀伤作用。结果 GM-CSF、IL-4和TNF-α配伍可有效地从MM患者外周血单陔细胞中诱导出大量成熟的功能性DC。MM患者自体血清Id冲击致敏的成熟DC能够显著地提高T细胞的增殖能力，并且使幼稚T细胞活化成为肿瘤独特型CTL，各个剂量的CTLs均能够产牛针对自体MM细胞的抑制性杀伤反应。结论 在MM患者外周血中可获得典型的DC，使用负载了Id的DC疫苗能够诱导出有效的抗肿瘤免疫应答反应，以DC为基础的疫苗可能在MM免疫治疗中发挥重要的作用。     

MAGE-1多肽负载树突状细胞对人肝癌细胞的体外杀伤作用

目的:应用黑色素瘤基因(MAGE-1)多肽负载的树突状细胞(DC)在体外诱导出高度特异性的抗肝癌免疫应答。方法:分离肝细胞肝癌患者外周血单个核细胞;GM-CSF、IL-4、TNF-α联合培养获得DC;MAGE-1多肽负载DC激活自体T淋巴细胞,使之增殖、分化为细胞毒T细胞(CTL);用MTT法检测CTL对BEL-7402HCC细胞的杀伤作用。结果:MAGE-1多肽负载DC激活的T淋巴细胞对BEL-7402HCC细胞有明显的体外杀伤作用,而无关抗原和无抗原负载的DC活化的淋巴细胞无明显杀伤作用(P<0.01)。结论:MAGE-1多肽负载的HCC患者外周血DC在体外可诱导出高度特异性的抗肿瘤免疫应答,提示MAGE-1基因可作为免疫治疗HCC的攻击靶点,MAGE-1多肽负载的DC疫苗在HCC的治疗中起重要作用。     

多发性骨髓瘤中miR-21与SPRY2基因表达的相关性研究

目的：检测多发性骨髓瘤（MM）患者外周血miR-21的表达水平,研究MM中miR-21与SPRY2基因表达的相关性。方法选择30例MM患者、15例意义未明单克隆丙种球蛋白病（MGUS）患者及20例正常对照（NC）的门诊患者,用实时荧光PCR定量检测miR-21和SPRY2表达水平;Western blot检测miR-21和SPRY2在MM细胞系中表达;在荧光显微镜下观察：U266用脂质体转染荧光标记的 miR-21 mimic/inhibitor后miR-21的表达。结果 MM组血清循环miR-21的表达水平较MGUS组和NC组显著增高,差异有统计学意义（P＜0.01）;在miR-21内源性高表达的MM细胞株中,SPRY2明显低表达;反之,明显高表达;荧光标记的 miR-21 mimic/inhibitor,转染效率90%以上,转染mimics细胞miR-21表达量（98.6±14.2）较未处理的U266细胞miR-21表达量（0.82±0.13）升高了120.2倍（差异有显著的统计学意义,P＜0.001）,转染inhibitor细胞miR-21表达量（0.37±0.06）较未处理细胞降低了61.9%（差异有明显的统计学意义,P＜0.05）。结论 miR-21可能是导致SPRY2在MM中表达下调的一个负性调控因子。miR-21与MM 的发生发展和疾病预后有密切关系,可作为判断MM 患者预后不良指标之一。     

负载肿瘤抗原的DC疫苗体外诱导的特异性抗膀胱癌效应研究

目的探讨负载膀胱癌抗原成分树突状细胞（dendritic cells,DC）疫苗的制备和体外诱导T淋巴细胞特异性杀伤膀胱癌细胞的作用。方法冻融法制备EJ细胞裂解物抗原成分,体外培养的人外周血单个核细胞（hu-PBMC）在rhGM-CSF、rhIL-4、TNF-α诱导下分化出DC,负载EJ细胞裂解物抗原后制备膀胱癌DC疫苗;免疫磁珠分离法从人免疫重建Balb/c裸小鼠脾脏组织中分离CD3＋T淋巴细胞,3H-TdR掺入试验测定DC疫苗刺激自体T淋巴细胞增殖的能力,51Cr释放试验检测DC疫苗诱导的T细胞对EJ细胞的杀伤作用。结果 Hu-PBMC在细胞因子rhGM-CSF、rhIL-4和TNF-α的刺激下分化为成熟DC,负载EJ抗原的DC疫苗体外可使同源T淋巴细胞活化,增殖指数增加,活化的T淋巴细胞对EJ细胞的杀伤率为（62.58±6.13）%,和对照组比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论负载膀胱癌冻融抗原的DC疫苗体外可诱导人T淋巴细胞活化增殖,对EJ细胞有明显的杀伤作用。     

热休克蛋白96白血病抗原肽抗髓系白血病效应的研究

目的研究热休克蛋白96（HSP．gp96）白血病抗原肽的抗白血病效应及相关机制。方法将不同的白血病细胞株（K562、HL-60、U937）分别分为A、B细胞株组,A组加预先构建的HSP．gp96重组腺病毒感染,B组不加以感染。将两组细胞株均制备为相应的抗原肽（分别设为A1、B1组）,外周血单个核细胞诱导树突细胞（DC）后分别负载A。及B．组抗原肽以分别获取相应的DC复合物（分别设为A1、B2组）。用四甲基偶氮唑蓝反应比色法检测各组对T淋巴细胞增殖的影响,用乳酸脱氢酶释放法检测其在不同效靶比下的自然杀伤细胞（NK）活性和细胞毒性T淋巴细胞（CTL）效应,并比较K562来源的A：组复合物对3种白血病细胞株杀伤效应的不同。结果与A、B及B。组相比,3种不同细胞株的A1、A2和B2组均可刺激T淋巴细胞的增殖,同时也能增强NK细胞活性和CTL效应（P均〈0．05）。其中A1、A2组对NK活性和CTL效应的增强尤为显著。且随着效靶比的增加,A1、A2和B2组NK细胞活性和CTL效应也明显增强。另外,K562细胞株制备的A2组复合物的CTL效应在K562细胞中明显增强,与HL一60及U937细胞相比,差异有统计学意义。结论HSP—gp96白血病抗原肽抗白血病效应明显,经DC诱导后其作用增强,且后者对同源细胞株的杀伤效应具有特异性。     

膜联蛋白A2基因对多发性骨髓瘤细胞的诱导凋亡作用及相关机制研究

本研究探讨膜联蛋白A2（AnxA2）基因诱导骨髓瘤U266、RPMl8226细胞凋亡的作用及相关机制。采用AnxA2siRNA转染人骨髓瘤U266、RPMl8226细胞,应用实时PCR和Westernblot检测AnxA2基因和蛋白的表达。应用流式细胞术检测细胞凋亡,应用实时PCR检测凋亡相关基因的表达水平。结果表明,AnxA2siRNA转染U266和RPMl8226后,AnxA2基因和蛋白表达水平均明显下调;细胞凋亡率增高（P〈0．05）,同时降低凋亡相关基因p65NF-κB、儿_2、IL-6的表达（P〈0．05）,增强P53基因的表达（P〈0．05）。结论：AnxA2基因沉默在骨髓瘤细胞U266和RPMl8226凋亡中起促进作用。     

C反应蛋白对多发性骨髓瘤细胞系U266增殖机制的研究

为了观察C反应蛋白（CRP）对人骨髓瘤细胞系U266细胞增殖活性的作用机制,将液氮冻存的U266细胞复苏后,悬浮培养,第3天收集细胞备用,分别以不同浓度CRP（0、5、10、20mg／L）培养24小时,采用血液分析仪检测细胞增殖情况,采用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法检测凋亡相关蛋白survivin和HSP90ct的表达。结果发现：CRP处理的细胞组增殖率及survivin、HSP90α的表达量均高于对照组（P〈0．05）,20mg／LCRP组作用最显著;survivin、HSP90α之间表达具有显著相关性（r=0．737,P〈0．0001）。结论：CRP是通过调节凋亡抑制蛋白Survivin及HSP90α的表达发挥促进U266细胞增殖的作用。     

白介素21对树突状细胞诱导的CTL抗白血病作用的影响

本研究探讨白介素21（IL-21）对树突状细胞（DC）诱导的CTL抗白血病的体外作用。以不同细胞因子诱导培养急性白血病（AL）患者缓解期外周血单个核细胞产生DC，自体AL细胞RNA作为抗原负载DC，与自体T淋巴细胞共培养诱导白血病特异性CTL产生；用LDH释放法检测CTL杀伤自体AL细胞的作用，并检测CTL产生IFN-γ和TNF-α的变化。实验共分2组：实验组，在DC—CTL共培养过程中加用IL-21（200ng／ml）；对照组，不加IL-21。同时对IL-21单独作用培养后成熟DC，检测其表面抗原表达变化以及诱导同种混合淋巴细胞反应能力。结果表明：对照组和实验组的CTL产生率分别为：（56．73±10．21）％，（73．43±18．01）％（P〈0．01）；培养上清中IFN-γ和TNF-α分别为：（154．91±67．20）ng／L，（310．62±141．15）ng／L（p〈0．01）和（8．77±5．09）μg/L，（15．25±6．56）μg／L（p〈0．01）。在效靶比为20：1时，两组对自体AL细胞的杀伤作用分别为（50．22±5．07）％，（75．38±9．47）％（P〈0．01）；IL-21作用后的成熟DC的CD1a、CD83、CD86、CD80和HLA—DR表达没有明显变化；诱导同种混合淋巴细胞反应能力亦没有明显不同。结论：IL-21可促进DC诱导的CTL增殖、增加IFN--γ和TNF—α产生从而增强其抗白血病作用；IL-21对成熟DC表面抗原表达及其免疫功能无明显影响；提示IL-21在白血病免疫治疗中发挥一定的作用，具有潜在的临床应用价值。     

马钱子碱对多发性骨髓瘤中成骨细胞及破骨细胞代谢的影响

本研究旨在探讨体外马钱子碱对多发性骨髓瘤(MM)中成骨细胞早期分化和破骨细胞代谢途径的影响,同时比较马钱子碱与硼替佐米在体外对多发性骨髓瘤的影响。用MTT法检测硼替佐米与马钱子碱对多发性骨髓瘤细胞株U266的半数抑制浓度(IC50);将多发性骨髓瘤细胞株U266的上清液加入到成骨细胞MC3T3-E1诱导分化体系中培养后,用RT-PCR方法测定碱性磷酸酶(ALP)、骨钙蛋白(OC)、骨保护蛋白(OPG)及骨保护蛋白配体(RANKL)的mRNA水平。结果表明,硼替佐米作用于多发性骨髓瘤细胞株U266 48小时后半数抑制浓度(IC50)为22.4 nmol/L,马钱子碱为0.16 mg/ml;经马钱子碱及多发性骨髓瘤细胞上清液共同干预组的成骨细胞中ALP、OC及OPG的mRNA水平高于只经多发性骨髓瘤细胞上清液干预组的成骨细胞的表达水平(p<0.05),而RANKL的mRNA水平则降低(p<0.05),且它们增高或降低的程度大于硼替佐米作用组(p<0.05)。结论:马钱子碱对多发性骨髓瘤中骨代谢机制的影响可能通过成骨细胞对破骨细胞的调节而发挥作用。实验证实,马钱子碱对多发性骨髓瘤的治疗效果优于硼替佐米。