鹿红方对氧糖剥夺模型心脏干细胞自噬和抗凋亡能力的影响

目的探讨鹿红方(LHF)对氧糖剥夺模型心脏干细胞(CSCs)自噬和抗凋亡能力的影响。方法将CSCs随机分为对照组(正常培养)与氧糖剥夺造模组(缺血缺氧)。将造模组分为模型组(不予有效干预措施)、自噬阻断到(3-MA)组(给予自噬阻断剂)、鹿红方200μg/mL组(给予LHF200μg/mL)和LHF200+3-MA组(给予LHF200μg/mL+自噬阻断剂)。各组给予相应干预措施后光镜下观察细胞形态,并采用CCK-8法测定细胞凋亡情况;WesternBlot检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的表达;RT-PCR检测自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-ⅡmRNA的表达。结果光镜下观察可见:LHF200组较模型组和3-MA组凋亡细胞显著减少,LHF200+3-MA组与LHF200组比较,细胞凋亡增加;CCK-8结果显示:LHF200组与模型组比较,CSCs活细胞OD值显著增高(P=0.006);LHF+3-MA组与LHF200组比较,CSCs活细胞OD值下降(P=0.03);WesternBlot结果显示:LHF200组Beclin-1和LC3-Ⅱ蛋白表达较模型组显著降低(P<0.001),但显著高于3-MA组和LHF200+3-MA组(P<0.001);RT-PCR结果显示:LHF200组Beclin-1和LC3-ⅡmRNA表达较模型组显著降低(P<0.001),但显著高于3-MA组和LHF200+3-MA组(P<0.001)。结论LHF可提高氧糖剥夺模型CSCs的抗凋亡能力,其机制与调节自噬有关。     

调控自噬对H9c2心肌细胞缺氧／复氧损伤的影响

目的探讨调控自噬水平对H9c2心肌细胞缺氧／复氧（H／R）损伤的影响及意义。方法将H9c2心肌细胞缺氧2h／复氧4h,建立H／R损伤模型。以3-甲基腺嘌呤（3-MA）为自噬特异抑制剂和雷帕霉素为自噬增强剂,试验随机分为四组：正常对照组（C组）、H／R组、H／R＋100mol／L3-MA组（M＋H／R组）、H／R＋100nmol／L雷帕霉素（R＋H／R组）,应用MTT法检测细胞活力,透射电镜检测心肌细胞自噬小体,流式细胞技术检测细胞凋亡比例,Westernblot法检测自噬相关蛋白LC3、Beclin1,凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及下游活性片段Caspase-9、Caspase-3蛋白表达。结果H／R组明显诱导H9c2心肌细胞自噬发生、细胞活力下降、凋亡增加（P〈O．01）．Westernblot检测发现,Bax、Caspase-9、Caspase-3活性片段蛋白表达明显增加,Bcl-2表达明显抑制,Bax／Bcl-2比值、活化蛋白Caspase-3、Caspase-9表达增加（P〈O．01）;M＋H／R组H／R损伤作用明显减弱,线粒体凋亡通路及下游蛋白表达抑制（P〈O．01）;而R＋H／R组线粒体凋亡通路进一步激活,促进细胞凋亡发生（P〈O．01）。结论自噬在H9c2心肌细胞H／R损伤中起到致命性作用,抑制自噬可保护心肌细胞H,R氧化应激损伤,其机制与抑制线粒体凋亡通路有关。     

抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对兔原代巨噬细胞自体吞噬的影响及机制

目的 探讨抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路对兔原代巨噬细胞自体吞噬中的影响。方法 分离培养纯种新西兰兔腹腔原代巨噬细胞并分为4组,加入磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）抑制剂LY294002（10 μmol/L）组、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抑制剂雷帕霉素（10 nmol/L）组、蛋白激酶B（Akt）抑制剂曲西立滨组（20 μmol/L）以及空白对照组。共培养4 h、12 h后分别收集细胞,运用透射电镜观察巨噬细胞自噬体的变化,细胞免疫荧光法检测微管相关蛋白轻链3Ⅱ（LC3Ⅱ）分子的表达,Western blot检测 Akt、mTOR、磷酸化Akt（p-Akt）、磷酸化mTOR（p-mTOR）及自噬相关蛋白Beclin-1和自噬蛋白Atg5-Atg12连接体的表达,单丹酰尸胺（MDC）染色法观察自噬溶酶体的变化。结果 与空白对照组相比,透射电镜下LY294002组自噬体、自噬空泡、髓磷脂图像等自噬标记物明显减少,雷帕霉素组、曲西立滨组明显增多;激光共聚焦显微镜下LY294002组LC3Ⅱ表达显著减少,雷帕霉素组、曲西立滨组表达显著增多;Western blot结果显示LY294002组Beclin-1及Atg5-Atg12蛋白表达水平显著下降,p-mTOR、p-Akt蛋白表达显著减少;雷帕霉素组、曲西立滨组Beclin-1及Atg5-Atg12蛋白表达水平明显上调,共培养4 h后p-Akt表达增多,雷帕霉素组p-mTOR表达增多,曲西立滨组减少;共培养12 h后雷帕霉素组、曲西立滨组p-mTOR表达显著减少,雷帕霉素组p-Akt表达显著增多,曲西立滨组显著减少;MDC染色显示LY294002组自噬溶酶体明显减少,雷帕霉素组、曲西立滨组明显增多。结论 抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路能促进兔原代巨噬细胞自体吞噬,抑制PI3K能减少兔原代巨噬细胞自体吞噬,可能是不同类型的PI3K分子通过其他通路起作用。     

联合应用自噬抑制剂增加雷帕霉素引起的肺癌细胞凋亡

目的探讨自噬抑制剂对雷帕霉素引起的肺癌细胞凋亡的影响。方法选用人肺癌A549细胞,MTT方法检测单独利用雷帕霉素(Rapamycin)或者联合自噬抑制剂3-MA对A549细胞存活率的影响,Western印迹检测单独利用雷帕霉素(Rapamycin)或者联合自噬抑制剂3-MA凋亡相关蛋白Caspase-3和PARP,以及线粒体相关蛋白细胞色素C表达水平的影响。结果 MTT结果显示,Rapamycin可以明显地引起A549细胞存活率的下降,并呈现出剂量依赖性。Western印迹结果显示,Rapamycin可以引起凋亡相关蛋白酶切的PARP、酶切的Caspase-3以及线粒体凋亡相关蛋白细胞色素C(cytochrome c)表达水平明显的上升。MTT结果显示,联合应用自噬抑制可以明显的增加Rapamycin引起的细胞存活率的下降。Western印迹显示,与单独给予Rapamycin相比较,联合应用自噬抑制剂3-MA,凋亡相关蛋白酶切的PARP、酶切的Caspase-3进一步增加。结论自噬抑制剂3-MA可提高人肺癌A549细胞对m TOR抑制剂Rapamycin的敏感性。     

雷帕霉素联合顺铂对肝癌细胞凋亡及自噬的影响

目的研究雷帕霉素联合顺铂对肝癌细胞凋亡、自噬的影响。方法将雷帕霉素及顺铂分别或联合作用于Hep G-2细胞,采用MTT法检测Hep G-2细胞增殖抑制情况,采用流式细胞仪检测Hep G-2细胞凋亡,采用MDC染色、转染p GFP-LC3检测细胞自噬。结果与正常对照组相比,雷帕霉素组未出现明显的细胞凋亡情况;顺铂组细胞凋亡情况较明显,凋亡率达到(21.27±3.65)%;顺铂联合雷帕霉素组细胞凋亡率最高,达到(43.33±5.64)%。三组Hep G-2细胞均出现点状的自噬泡,顺铂联合雷帕霉素组自噬泡数量显著高于雷帕霉素组和顺铂组。结论顺铂可直接诱导Hep G-2细胞凋亡,雷帕霉素本身不诱导Hep G-2细胞凋亡,但其可显著促进顺铂诱导Hep G-2细胞凋亡;顺铂和雷帕霉素均可直接诱导Hep G-2细胞自噬,但两者联合应用促进Hep G-2细胞自噬情况非常明显。     

小檗碱通过腺苷酸活化蛋白激酶、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α调节自噬减轻高糖环境下足细胞损伤的机制研究

目的探讨小檗碱(Ber)对高糖诱导的足细胞损伤保护作用及其机制研究。方法将小鼠永生系足细胞(MPC-5)分为正常浓度葡萄糖(Con)组、高糖(HG)组、Ber干预(Ber)组、雷帕霉素(Rap)干预组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)干预组、高糖+Ber(HG+Ber)干预组、高糖+雷帕霉素(HG+Rap)干预组。采用CCK-8法分析细胞存活率。Western blot检测MPC-5细胞自噬相关蛋白、自噬相关蛋白、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC1-α)蛋白的等表达。荧光显微镜观察自噬标记物(LC3-Ⅱ)在MPC-5细胞中的表达。结果与Con组比较,HG、3-MA组足细胞LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达降低(P0.05),Ber、Rap组表达升高(P0.05),HG组足细胞特异性标记物(Nephrin、Podocin)表达降低(P0.05),足细胞损伤标记物(Desmin)表达升高(P0.05),Ber、Rap组足细胞AMPK、PGC1-α蛋白表达升高(P0.05)。与HG组比较,HG+Ber、HG+Rap组Nephrin、Podocin表达升高(P0.01),Desmin表达降低(P0.01)。在正常对照siRNA中,与Con组比较,Ber、Rap组足细胞TRITC-LC3Ⅱ标记的自噬通量明显增加(P0.05)。在AMPK抑制剂中,与Con组比较,Ber、Rap组足细胞TRITC-LC3Ⅱ标记的自噬体量降低(P0.05)。结论 Ber可通过调控自噬活性保护高糖诱导的MPC-5细胞损伤,其过程可能通过AMPK/PGC-1α途径实现。     

心复力颗粒诱导缺氧无血清条件下H9C2心肌细胞自噬发挥抗凋亡作用的实验研究

目的探讨中药复方心复力颗粒(XG)诱导缺氧无血清条件下H9C2心肌细胞自噬发挥抗凋亡的作用机制。方法将H9C2心肌细胞随机分为正常组、缺氧无血清组、XG(100～800μg/mL)组、3-甲基腺嘌呤(3-MA)组(5μmol/L)、XG(400μg/mL)+3-MA(5 mmol/L)组,在缺氧无血清培养条件下处理24 h后,Hoechst33342荧光染色观察细胞凋亡,单丹磺酰尸胺(MDC)染色观察自噬小体形成,Western blotting方法检测凋亡和自噬蛋白表达水平。结果 Western blotting结果显示,缺氧无血清条件明显抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达,促进凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达。心复力颗粒处理后,可显著抑制细胞凋亡,Bcl-2表达上调,Bax和Caspase-3的表达下调,且呈浓度依赖性,在XG 400组作用最显著,与正常组比较,缺氧无血清组自噬小体明显减少,而在心复力颗粒各处理组中,随着药物浓度增加,自噬小体数量明显增加,在XG 400组最明显。同时LC3Ⅱ/LC3Ⅰ呈剂量依赖性增加,并在XG 400组表达水平达到峰值。用自噬特异性抑制剂3-MA处理细胞后,与缺氧无血清组比较,细胞凋亡明显增加,抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著减少,而凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达呈上升趋势。结论缺氧无血清培养条件可以引起明显的细胞凋亡和抑制细胞自噬;心复力颗粒干预后显著减少细胞凋亡同时诱导自噬发生,并呈现一定的浓度依赖性;心复力颗粒通过诱导细胞自噬下调细胞凋亡水平。心复力颗粒通过诱导缺氧无血清条件下的H9C2心肌细胞自噬,从而发挥抗凋亡作用,保护缺血心肌。     

ATF3转录调控HSP110对低氧诱导的肺动脉平滑肌细胞自噬和增殖的影响

目的 探讨ATF3调控HSP110表达对低氧刺激下人肺动脉平滑肌细胞增殖及自噬的影响。 方法 体外培养人肺动脉平滑肌细胞，单独感染ATF3沉默腺病毒或共感染HSP110过表达腺病毒，48 h后加入自噬激活剂雷帕霉素预处理3 h，建立缺氧细胞模型，24 h后，CCK-8法检测细胞增殖能力，流式细胞术分析细胞凋亡，Real-time PCR检测ATF3、HSP110 mRNA的表达，Western blot检测ATF3、HSP110、LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1、p62蛋白的表达，免疫荧光观察LC3斑点形成，荧光素酶报告系统鉴定ATF3对HSP110的调控作用。 结果 缺氧组ATF3和HSP110的表达显著增加（P<0.01），ATF3沉默后，细胞增殖能力下降，凋亡率增加（P<0.01），同时自噬蛋白LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin-1的表达及LC3荧光斑点显著减少(P<0.01)，自噬降解底物p62的表达明显增加(P<0.01)，而加入雷帕霉素或共感染HSP110过表达腺病毒后，ATF3沉默对细胞增殖和自噬的抑制作用显著减弱(P<0.01)。双荧光素酶报告基因检测结果显示，ATF3可上调HSP110启动子活性。 结论 ATF3调控HSP110表达增加而促进人肺动脉平滑肌细胞增殖，其机制可能与介导细胞自噬有关。     

百里醌对HUVECs细胞凋亡的影响及其机制

目的探究百里醌降低过氧化氢引起的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)细胞凋亡及其潜在机制。方法使用百里醌预处理HUVECs细胞后加入过氧化氢共培养1 h,使用四甲基偶氮唑蓝(MTT)方法测定细胞增殖能力改变;应用流式细胞仪检测百里醌预处理后加入过氧化氢共培养的HUVECs细胞凋亡情况变化;使用GFP-LC3荧光体系检测百里醌对HUVECs细胞自噬的影响;应用Western印迹法测定不同处理后HUVECs细胞Caspase-3/Cleaved Caspase-3、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ、Akt/p-Akt、mTOR/p-mTOR、Beclin1、Bcl-2、β-Actin蛋白表达情况改变。结果百里醌预处理HUVECs细胞,降低由过氧化氢引起的细胞凋亡并呈现剂量依赖性(P0.05);百里醌诱导HUVECs细胞发生自噬;3-MA阻断自噬途径后百里醌对过氧化氢处理的HUVECs细胞保护作用减弱(P0.05);百里醌抑制p-Akt、p-mTOR蛋白表达,促进Beclin1和Bcl-2蛋白表达(P0.05)。结论百里醌通过抑制Akt/mTOR信号通路和上调Beclin1蛋白激活自噬,促进Bcl-2蛋白表达抑制凋亡,降低过氧化氢引起的HUVECs细胞凋亡,为动脉粥样硬化的防治提供新思路。     

自噬在贝伐单抗诱导非小细胞肺癌凋亡中的作用

目的研究血管抑制药物贝伐单抗与自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)联用对于肺癌A549细胞增殖的抑制作用。方法四甲基偶氮唑盐(MTT)法分别描绘贝伐单抗与3-MA作用于肺癌A549细胞时的细胞生长曲线,并计算贝伐单抗对A549细胞的半数抑制浓度(Ic50)及3-MA对于A549细胞的抑制浓度Ic10;AnnexinV-FITC/PI双染色流式细胞术检测A549细胞凋亡率;吖啶橙(AO)与单丹磺酰尸胺(MDC)染色对照组、贝伐单抗组、3-MA组及联合用药组细胞后,在荧光显微镜下观察细胞自噬与凋亡状态;蛋白免疫印迹杂交(Western印迹)检测微管相关蛋白(LC)-3的表达变化〔1〕。结果流式细胞仪测得贝伐单抗组、3-MA组及联合用药组细胞凋亡率分别为(21.82±0.41)%、(3.54±0.11)%、(37.36±0.87)%;贝伐单抗组细胞分别经MDC及3-MA染色后,细胞中出现大量自噬空泡,而在加入3-MA联合作用后,自噬空泡现象被不同程度抑制;Western印迹结果显示LC-3在贝伐单抗组中的表达较对照组明显增加,在单用3-MA组中,二者表达明显减少,在联合用药组中的表达均介于贝伐单抗组及3-MA组之间。结论贝伐单抗可诱导肺癌A549细胞凋亡,同时增强细胞自噬;当与3-MA联用时,贝伐单抗的促细胞凋亡作用增加。     

线粒体乙醛脱氢酶2通过提高细胞自噬改善高糖导致的心肌损伤

目的:明确乙醛脱氢酶2(ALDH2)对高糖状态下H9c2大鼠心肌细胞自噬表达水平的影响及其对细胞存活的作用。方法:以33 mmol/L葡萄糖培养大鼠H9c2心肌细胞72 h。经ALDH2激动剂Alda-1及自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)干预后,用Western blot检测ALDH2、自噬基因相关蛋白5(ATG5)、微管相关蛋白质1轻链3(LC3)的表达水平。用免疫荧光法检测细胞内自噬体的数量,CCK-8法检测细胞的存活率,TUNEL法检测细胞凋亡。结果:与对照组相比,高糖导致心肌细胞自噬相关蛋白表达水平下降,减少自噬体的数量,降低细胞存活率,增加细胞凋亡;而ALDH2能提高高糖状态下自噬相关蛋白表达水平,增加自噬体的数量,增强细胞的存活率,减少细胞凋亡;应用自噬抑制剂3-MA处置后,可减弱ALDH2的上述作用。结论:ALDH2能够提高高糖状态下心肌细胞的自噬表达水平,提高细胞的存活率,减少细胞凋亡。     

Resveratrol Protects HUVECs from Oxidized-LDL Induced Oxidative Damage by Autophagy Upregulation via the AMPK/SIRT1 Pathway

Purpose

Resveratrol could induce basal autophagy through the activation of sirtuin. In this study, we investigated the effect of resveratrol on oxidative injury of human umbilical endothelial vein cells (HUVECs) induced by oxidized low-density lipoprotein (ox-LDL) and the role of autophagy in this effect.

Methods

HUVECs were exposed to 100 mg/L ox-LDL for 24 h to cause oxidative injury. The effect of different concentrations of resveratrol on oxidative damage in HUVECs treated with ox-LDL was evaluated by MTT assay and superoxide dismutase (SOD) activity test. The autophagic level in different groups was measured by the protein expression of microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) and sequestosome 1 (SQSTM1/P62). Autophagosomes were observed under electron microscope and fluorescence microscope (by MDC staining). The expression of silencing information regulator1 (Sirt1) and AMP activated protein kinaseα1 (AMPK) was investigated by Western blot. Autophagy inhibitor 3-methyladenine (3-MA) and Sirt1 inhibitor 6-Chloro-2,3,4,9-tetrahydro-1H-Carbazole-1-carboxamide (EX527) were used to confirm the role of autophagy in this effect of resveratrol and the pathway involved.

Results

Resveratrol reversed the decreases in cell viability (72.9?±?1.7 % of the control group) and SOD activity (14.37?±?0.21 U/ml) caused by ox-LDL at 83.4?±?1.4 % of the control group and 16.41?±?0.27 U/ml respectively. This effect accompanied by upregulation of autophagy and increased protein expression of Sirt1 and AMPK phosphorylation on threonine 172 (p-AMPK). Both 3-MA and EX527 abolished the protective effect of resveratrol in cell viability, at 80.4?±?2.7 % and 73.9?±?1.1 % of the control group respectively. 3-MA inhibited autophagy activation without any change of Sirt1 expression at both the mRNA and protein level. EX527 suppressed the expression of Sirt1 and diminished the upregulation of autophagy. Addition of 3-MA or EX527 could not affect the protein level of p-AMPK.

Conclusion

Resveratrol protected HUVECs from oxidative damage caused by ox-LDL. This effect was mediated by Sirt1-dependent autophagy via the AMPK/ Sirt1 pathway.     

The time-dependent autophagy protects against apoptosis with possible involvement of Sirt1 protein in multiple myeloma under nutrient depletion

The absence of researches about autophagy in multiple myeloma promoted us to explore the biological characteristics and role of autophagy induced by nutrient depletion in multiple myeloma (MM) cell line RPMI8226 cells. Both autophagic and apoptotic morphology were observed by TUNEL, transmission electron microscopy (TEM), and monodansylcadervarine (MDC) staining. MDC staining fluorescent intensity and the conversion of LC3-I to LC3-II demonstrated autophagy increased time-dependently at 6, 12, and 18 h then declined at 24 and 48 h. FCM analysis of Annexin V-FITC/PI (AV/PI) dual staining and TUNEL assay demonstrated apoptosis increased time-dependently at 6, 12, 18, 24, and 48 h, and it burst at 24 h when autophagy declined. Bax translocation from cytoplasm to mitochondria and active caspase3 protein level were promoted time dependently along with the increase of apoptosis. We demonstrated the same time-course pattern of Beclin1 protein and mRNA level as autophagy. The phosphorylating rate of S6K1 was inhibited at 6, 12, and 18 h when autophagy increased. Inhibition of autophagy by 3-methyladenine (3-MA) facilitated apoptosis and caspase3 activation at 6, 12, and 18 h but made no effect at 24 or 48 h. Sirt1 protein level in nuclei was gradually enhanced along with the increase of autophagy, however, 3-MA suppressed this enhancement. Taken together, nutrient depletion induced the time-dependent autophagy and apoptosis. Apoptosis was demonstrated as caspase3-mediated and Bax-dependent mitochondrial apoptosis. Autophagy appears to be Beclin1-dependent and related to mTORC1 inhibition. Autophagy protected against the apoptosis in the early period. Sirt1 possibly contributed to autophagy and was involved in pro-survival process mediated by autophagy.     

脂联素抑制炎症小体NLRP3表达减轻高糖高脂诱导内皮细胞损伤

目的 研究脂联素（APN）是否通过抑制炎症小体NLRP3表达减轻高糖高脂所致的内皮细胞损伤。方法 将培养的人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）分为6组:对照组、高糖高脂组、对照+ NLRP3 siRNA组,高糖高脂组+NLRP3 siRNA组,对照+APN组,高糖高脂+APN组。培养48 h后检测细胞存活率、凋亡率、炎症小体NLRP3表达水平。结果 与对照组相比,高糖高脂组细胞存活率显著下降,细胞凋亡显著升高,炎症小体NLRP3表达水平显著升高（均P<0.05）;炎症小体NLRP3 siRNA可有效的抑制炎症小体NLRP3的表达,改善高糖高脂引起的内皮细胞损伤（均P<0.05）;APN能抑制高糖高脂引起的炎症小体NLRP3表达增多,进而减轻高糖高脂引起的内皮损伤（均P<0.05）。结论 炎症小体NLRP3表达增多是高糖高脂诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的内在机制,而脂联素可以通过抑制炎症小体NLRP3的过度表达发挥内皮保护作用。伤,降低心肌炎症反应。     

α-硫辛酸通过mTOR通路抑制缺血再灌注诱导的PC12细胞自噬性凋亡

目的研究α-硫辛酸(LA)对PC12细胞缺血再灌注损伤的保护作用及其分子机制。方法传代培养PC12细胞,PC12细胞缺氧/复氧(氧糖剥夺4 h,复氧18 h)模拟缺血再灌注损伤模型。实验分为正常组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧+α-LA、缺氧/复氧+自噬抑制剂巴弗洛霉素(Baf)A1组。CCK8筛选α-LA的有效作用浓度;流式细胞术检测细胞凋亡变化;Western印迹检测细胞促凋亡蛋白B细胞淋巴瘤(Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、酶切caspase-3、自噬标志分子SQSTM-1/P62、LC3-Ⅱ/Ⅰ及mTOR通路的表达变化。结果缺氧/复氧显著降低PC12细胞的存活率(P<0.05),Western印迹结果显示Bax、酶切caspase-3、LC3-Ⅱ/Ⅰ的表达水平均显著升高(P<0.05),P62和p-mTOR的表达水平降低(P<0.05);与缺氧/复氧组比较,给予α-LA和Baf A1均能显著降低缺氧/复氧诱导的凋亡水平(P<0.05)。结论α-LA通过抑制缺氧/复氧诱导的过度自噬进而减少过度自噬诱导的细胞凋亡。     

肿瘤转移抑制基因KAI1诱导的自噬通过下调Caspase-3活化抑制凋亡

目的 观察KAI1基因诱导的自噬在人胰腺癌MiaPaCa-2细胞中调节凋亡的分子途径.方法 实验分为用细胞外调节蛋白激酶( ERK)的磷酸化阻断剂PD98059预处理组、Caspase-3的活化阻断剂VAD-FMK预处理组和未用PD98059、VAD-FMK预处理组3大组;每大组再分3小组进行不同处理,感染腺病毒空载体AD5-null对照组、感染人KAI1基因的重组腺病毒载体AD5-KAI1组和用自噬阻断剂3 MA预处理阻断自噬后再感染AD5-KAI1组.通过膜朕蛋白V-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)双染法检测细胞凋亡,流式细胞术评价Caspase-3活化水平,Western印迹检测ERK磷酸化水平和PARP蛋白的裂解情况.结果 感染AD5-KAI1后癌细胞表达KAI1蛋白的同时绿色荧光蛋白(GFP) LC3绿色颗粒增加,Caspase-3活化、PARP-1裂解、ERK磷酸化和凋亡均明显增多.自噬阻断剂3-MA预处理后,凋亡率由(63.0±7.9)％升至(88.0±4.5)％,Caspase-3活化由(34.0±2.8)％升至(44.2±4.0)％,同时PARP-1裂解更多.Caspase-3阻断剂VAI-FMK预处理可完全抑制3-MA预处理导致的促凋亡作用.ERK磷酸化抑制剂PD98059不能抑制3 MA预处理导致的促凋亡作用.结论 KAI1诱导的自噬通过抑制细胞中Caspase-3活化和PARP裂解而不是通过抑制ERK磷酸化来拮抗KAI1诱导的凋亡.     

热休克蛋白27磷酸化在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用

目的研究热休克蛋白27磷酸化在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用。方法取健康剖腹产孕妇的脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行培养,选择2～3代细胞进行实验。①检测高糖对内皮细胞中热休克蛋白27(HSP-27)蛋白活性的影响:实验分正常细胞组与高糖组。正常细胞组不做处理直接提取细胞总蛋白,高糖组为30.5mmol/L高糖分别干预细胞24、48、72h后提取总蛋白。②检测槲皮素对高糖诱导的内皮细胞中HSP-27活性的影响:实验分为正常细胞组,高糖组和高糖+槲皮素组。正常细胞组不做处理,高糖组为30.5mmol/L高糖干预细胞;高糖+槲皮素组为槲皮素(10μmol/L)先与细胞孵育1h后再加入刺激物高糖(30.5mmol/L),各细胞组培养48h后提取总蛋白。①与②中细胞总蛋白均采用特异性Phospho-HSP27抗体的蛋白免疫印迹法检测HSP-27的活性;采用Annexin-Ⅴ-PI染色流式细胞技术检测人脐静脉内皮细胞凋亡。分组及干预情况同②,比较各组间细胞的凋亡率。结果高糖呈时间依赖性诱导人脐静脉内皮细胞中HSP-27磷酸化,30.5mmol/L高糖作用24、48、72h,HSP-27磷酸化水平较正常对照组分别提高了100%(P<0.05),182.5%(P<0.01),117%(P<0.05)。而HSP-27选择性阻断剂槲皮素(10μmol/L)作用48h可以抑制高糖诱导的HSP-27磷酸化,与高糖组相比槲皮素组HSP-27磷酸化水平降低了52.6%(P<0.01),与此同时,可使凋亡增加,内皮细胞凋亡率较高糖组增高了37.6%(P<0.01)。结论 HSP-27磷酸化可能在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中起保护作用。     

TL1A在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用及机制探讨

目的 研究肿瘤坏死因子配体相关分子1A（TL1A）在高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡中的作用,并探讨机制.方法 采用RT-PCR、Western blot法检测不同浓度（5.6、11.2、22.4、33.6 mmol/L）葡萄糖与人脐静脉内皮细胞共同孵育48 h以及22.4 mmol/L葡萄糖作用于内皮细胞12、24、48、96 h后,TL1A mRNA及蛋白质在人脐静脉内皮细胞中的表达情况.在22.4 mmol/L葡萄糖培养的人脐静脉内皮细胞中加入不同浓度的TL1A单克隆抗体（1、3、9 μg/mL）,48 h后进行Annexin V/PI双染色流式细胞凋亡计数,以纯化重组人TL1A作为内源性TL1A的对照.结果 在人脐静脉内皮细胞中,随着葡萄糖浓度升高及作用时间延长,TL1A mRNA和蛋白水增高（P＜0.05）.流式细胞计数显示,高糖培养人脐静脉内皮细胞经TL1A单克降抗体处理后凋亡明显减少（P＜0.05）.结论 高浓度葡萄糖诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞TL1A的表达呈浓度、时间依赖性增高;TL1A表达增多可能是高糖诱导人脐静脉内皮细胞凋亡的重要因素.     

舒心胶囊对缺氧诱导人脐静脉内皮细胞凋亡及相关基因表达的影响

观察舒心胶囊对缺氧诱导人脐静脉内皮细胞凋亡及相关基因表达的影响。体外培养人脐静脉内皮细胞 ,建立缺氧模型 ,以透射电子显微镜技术、流式细胞术 (膜联蛋白v/碘化丙啶 )双染色鉴定细胞凋亡 ;流式细胞术检测Fas、bcl 2及p5 3蛋白表达。缺氧培养 12h后 ,电镜显示细胞呈典型凋亡形态 ,双染色流式细胞仪检测凋亡细胞比例 (13.0 3%± 0 .96 % )显著高于正常组 (4 .4 7%± 0 .6 4 % ) (P <0 .0 1) ,而加入 5g/L舒心胶囊原液缺氧培养 12h后 ,凋亡细胞显著减少 (5 .0 3%± 0 .5 4 % ) (P <0 .0 1)。Fas蛋白表达在缺氧损伤过程中未见改变 ,舒心胶囊可使bcl 2蛋白表达升高 ,p5 3蛋白表达降低。舒心胶囊能够抑制缺氧诱导人脐静脉内皮细胞凋亡 ,可能与其升高bcl 2表达、降低p5 3表达有关。