大鼠成骨细胞的原代培养和鉴定

背景：组织工程需要大量的种子细胞,成骨细胞已成为骨组织工程构建的重要种子细胞之一。但成骨细胞取材困难,获得的成骨细胞的纯度不一。 目的：建立大鼠新生乳鼠颅骨来源成骨细胞的分离培养纯化方法,观察颅骨来源成骨细胞生物学特点。 方法：采用二次酶消化法对SD大鼠乳鼠成骨细胞进行原代培养,扩增。通过差速贴壁法进行成骨细胞纯化。通过形态学、细胞碱性磷酸酶检测、茜素红染色、钙结节Von kossa法染色、超微结构以及细胞增殖曲线,确定其增殖与成骨活性。 结果与结论：二次酶消化法培养颅骨来源成骨细胞可获得原代细胞增殖,传代扩增细胞具有典型成骨细胞形态学和生物学活性。碱性磷酸酶、茜素红染色、钙结节Von kossa法染色均呈阳性结果。超微结构显示为高分化功能活跃成骨细胞,细胞增殖曲线显示细胞生长活跃。提示,新生SD大鼠颅骨来源成骨细胞具有良好的增殖与成骨活性,能连续传代增殖,纯度高,细胞生物学特征稳定,适用于做体外实验研究。     

人正常皮肤和瘢痕疙瘩成纤维细胞的培养及生物学差异

背景：成纤维细胞是创伤愈合过程中的主要效应细胞,对瘢痕疙瘩成纤维细胞进行培养可为体外研究瘢痕疙瘩提供基础。 目的：比较体外培养的人正常皮肤和瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞生物学特性的差异,为体外研究瘢痕疙瘩提供平台。 方法：应用组织微粒贴壁法,对人正常皮肤和瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞进行原代培养、传代培养、冻存及复苏,观察二者的生长增殖情况及差异。 结果与结论：瘢痕疙瘩成纤维细胞的生长增殖与正常皮肤来源的成纤维细胞无明显差异,二者进入对数生长期的时间大致相同;体外培养的成纤维细胞在液氮中冻存后,细胞复苏状态良好,接种后绝大部分细胞存活,与冻存前无明显差异。说明瘢痕疙瘩来源的成纤维细胞及正常皮肤来源的成纤维细胞生长增殖无明显差异,且均可成功冻存和复苏。     

大鼠胚胎神经干细胞的冷冻复苏

目的：建立大鼠胚胎神经干细胞冷冻复苏方法，探讨冻存后神经干细胞的活力及生物学特性。方法：采用10％BSA＋7．5％DMSO作冷冻保护剂，于液氮中冻存；采用细胞培养和间接免疫荧光染色方法对冻存后细胞的活力，形态及分化能力作鉴定。结果：不同的冻存时间，细胞代数，组织来源以及神经营养因子对冻存后细胞存活率没有明显差异（P＞0．05）。冷冻保存复苏后培养的大鼠胚胎神经干细胞能够存活，能在体外多次传代，并能分化成神经元，星形胶质细胞细胞和少突胶质细胞。结论：大鼠神经干细胞的冻存复苏并不影响其原有的生物学特性包括其正常的，增殖能力和多向分化能力。     

正常人成骨细胞系的建立及鉴定

背景：骨细胞的体内研究由于受许多因素的影响而不便于结果分析。分离的骨细胞培养则可获得单一的细胞系,以此来观察各种不同物质或实验手段对细胞的直接效应,可以避免许多干扰因素的影响。 目的：探讨建立可行的、能大量生产人正常成骨细胞培养方法和保存方式。 方法：取引产胎儿四肢皮质骨,彻底刮除皮质骨表面的骨膜及内部的骨髓,并反复冲洗去除残余组织,胰酶、胶原酶消化后,将骨粒平铺于尼龙网上培养,建立正常人成骨细胞系。观察细胞形态及组织学变化;以免疫组织化学方法测定其生成Ⅰ型胶原情况。利用液氮冻存细胞以建立适当的保存方法。选取对数生长良好的细胞进行遗传学特性-染色体的制备。 结果与结论：成骨细胞呈梭形,多突起;细胞核呈卵圆形,偏于一侧;胞体大,胞浆丰富;碱性磷酸酶染色可见胞浆中含有大量的灰黑色颗粒,某些部位染成黑色,定量分析细胞内的碱性磷酸酶、骨钙素水平明显高于成纤维细胞;细胞免疫组织化学染色表明其主要合成Ⅰ型胶原。染色体分析表明,其具有23对染色体,未发现异常染色体,从而证实了其为正常人体来源的细胞,经培养与多次传代后仍保持正常,未发生变异。通过使用对新生骨有特异性的荧光染料四环素进行染色标记,证实了此培养细胞具有成骨能力。证实建立了可靠的正常人成骨细胞系,并能采用液氮冷冻的方式长期保存。经多次传代其遗传性质及生物学特征均未发生变异,复苏后的冻存细胞仍具有稳定的生物学特性。     

人胚胎干细胞饲养层的制备及生物学活性

背景：建立一种既可以大量制备,又能保存并保持较高活性的饲养层是胚胎干细胞培养研究不可缺少的环节。 目的：体外分离培养、冻存复苏ICR小鼠胚胎成纤维细胞,观察其生物学特性。 方法：取ICR小鼠13.5 d胚胎,用胰蛋白酶分步消化法分离培养小鼠成纤维细胞,对冻存复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞形态、生长曲线、贴壁率、细胞化学染色及支持人胚胎干细胞生长特性等进行观察。 结果与结论：复苏后的小鼠胚胎成纤维细胞在体外传代30 min时80%以上细胞贴壁,生长曲线显示细胞增殖活跃,细胞化学染色AKP、PAS、POX阴性,能长期支持人胚胎干细胞传代生长。提示此方法所获得的小鼠胚胎成纤维细胞复苏后有较高的生物学活性,可为人胚胎干细胞扩增提供稳定、优质的饲养层细胞。     

改良酶消化联合植块法培养兔骨膜成骨细胞

背景：骨膜成骨细胞具有很强的增殖能力和分化成骨潜能,而且取材方便,但以往常规培养方法时间较长,如何能够缩短培养时间,是骨膜源性成骨细胞成为理想种子细胞的关键之一。 目的：应用改良酶消化法培养兔骨膜原代成骨细胞,观察其在喷砂钛片上的黏附及增殖情况。 方法：切取雄性日本大耳白兔胫骨近端前内侧面骨膜0.5~1.0 cm2：①常规方法：以0.25%胰蛋白酶在37 ℃消化30 min后,用0.1%Ⅰ型胶原酶在37 ℃消化30 min,不断振荡,弃掉胰蛋白酶后植入培养瓶,干涸培养2 h,加入含体积分数15%胎牛血清的DMEM完全培养基培养。②改良方法：将Ⅰ型胶原酶消化时间由30 min改为1 h。碱性磷酸酶染色、钙结节染色鉴定成骨细胞。将原代培养成骨细胞与喷砂钛片联合培养,采用扫描电镜、MTT法检测不同时间点成骨细胞在喷砂处理钛片上的黏附及增殖情况。 结果与结论：培养第5天,改良法培养的骨膜成骨细胞从组织块周围爬出,第25天细胞汇聚成单层,细胞呈三角形或多角形;传代培养1个月后,可见细胞成复层生长,并有黑色钙结节生成,具有典型的成骨细胞形态特征,碱性磷酸酶染色、钙结节染色呈阳性。常规法培养的细胞爬满单层时间推迟12 d左右。在喷砂处理的钛片表面上成骨细胞立体感强,有伪足伸出,伪足嵌入小的孔洞内,细胞表面有基质分泌。两种方法培养的成骨细胞在钛片表面的黏附及增殖差异无显著性意义。 提示改良消化法可明显缩短成骨细胞培养时间,对成骨细胞的黏附及增殖能力无影响。     

液氮冻存前后成骨细胞免疫原性的对比

背景：低温冻存可以降低组织和器官的抗原性，而对细胞的影响，存在较大争论。 目的: 探讨液氮冷冻对成骨细胞免疫原性的影响。 设计：随机对照，配对设计实验。 单位：实验于2003-07/2004-03在山东大学附属齐鲁医院实验中心完成。 材料：4只新西兰大白兔，雌雄不限。3H-TdR由山东大学核医学教研室提供。 方法:于兔胫骨骨膜取材，体外原代培养成骨细胞，传代鉴定后液氮冻存3个月，复苏。设新鲜培养细胞为未冻存组，冻存3个月后复苏细胞为冻存组。利用流式细胞仪，通过间接免疫荧光技术测定冻存前后成骨细胞主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex-I，MHC-I）抗原阳性率。同时建立成骨细胞、淋巴细胞混合培养模型,利用β液闪计数仪测定每分钟闪烁数，计算淋巴细胞刺激指数。 主要观察指标：冻存前后成骨细胞MHC-I抗原阳性率及淋巴细胞刺激指数。 结果:未冻存组成骨细胞MHC-I抗原阳性率和刺激指数明显高于冻存组，差异有显著性意义（P < 0.01）。 结论: 液氮冻存后成骨细胞免疫原性显著降低，低温液氮冷冻是一种理想的降低成骨细胞免疫原性的方法。     

人脂肪间充质干细胞的分离培养与生物学特性☆

背景：脂肪来源间充质干细胞取材于吸脂手术所获得的脂肪抽吸物,可反复取材,原料来源充足。 目的：建立一种体外分离培养人脂肪来源间充质干细胞的方法,并分析其生物学特性。 方法：采用胶原酶消化法分离获取人脂肪来源间充质干细胞并进行体外培养,倒置相差显微镜下观察细胞形态;观察分析传代第3,7,10 代细胞生长曲线;采用流式细胞仪检测传代第5 代细胞表面标志表达。取传代第4代细胞行体外成骨细胞诱导和成脂诱导,采用碱性磷酸酶染色及油红O染色鉴定。冻存传代细胞,分别于 2,6 个月后复苏,锥虫蓝染色计数复苏后细胞存活率。 结果与结论：原代细胞3 d 贴壁,6 d 后开始快速增长并形成集落,11 d左右达80%~90%融合,多呈纤维样;传代后细胞维持纤维样形态。传代细胞潜伏期24~48 h,对数增殖期三四天,对数增殖期后第五六天进入平台期。间充质干细胞表面CD34、CD14、HLA-DR 呈阴性表达,CD44、CD105、CD13呈阳性表达,HLA-ABC呈弱阳性表达。具有向脂肪细胞、成骨细胞分化的能力,冻存复苏后细胞存活率达 90% 以上,且与未冻存传代细胞具有相同的生长特性。     

大鼠胚胎神经干细胞的冷冻复苏

目的:建立大鼠胚胎神经干细胞冷冻复苏方法,探讨冻存后神经干细胞的活力及生物学特性.方法:采用10%BSA+7.5%DMSO作冷冻保护剂,于液氮中冻存;采用细胞培养和间接免疫荧光染色方法对冻存后细胞的活力、形态及分化能力作鉴定.结果:不同的冻存时间、细胞代数、组织来源以及神经营养因子对冻存后细胞存活率没有明显差异(P＞0.05).冷冻保存复苏后培养的大鼠胚胎神经干细胞能够存活,能在体外多次传代,并能分化成神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞.结论:大鼠神经干细胞的冻存复苏并不影响其原有的生物学特性包括其正常的形态、增殖能力和多向分化能力.     

大鼠胚胎神经干细胞的体外培养及冻存

目的体外培养、冻存大鼠胚胎神经干细胞(NSCs),观察其生长、增殖特点及复苏后的活性。方法取孕15d的大鼠海马区细胞,体外培养。以20%牛血清白蛋白(BSA)加10%二甲基亚砜(DMSO)作冷冻保护剂,于液氮中冻存。复苏后计数活细胞数,免疫细胞化学鉴定其分化状态。结果第1~4代NSCs复苏后神经干细胞存活率在40%~63%之间,差异无统计学意义。冻存复苏后的NSCs能够存活、传代,并能分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。结论大鼠胚胎神经干细胞能够在体外增殖、分化,并且冻存复苏不影响其生物学特点和细胞活性。     

聚乳酸-壳聚糖纤维/羟基磷灰石-硅酸钙复合支架材料的细胞相容性

背景：实践证明,有机和无机材料单独应用都不是理想的支架材料。聚乳酸具有良好的生物相容性、生物降解性和生物吸收性,聚乳酸类复合材料将成为21世纪最重要的生物复合材料之一。 目的：观察复合支架材料聚乳酸-壳聚糖纤维/羟基磷灰石-硅酸钙对成骨细胞黏附、增殖、分化的影响。 方法：取新生24 h内Wistar大鼠的颅盖骨,采用改良胶原酶消化法进行成骨细胞原代培养。通过倒置相差显微镜、苏木 精-伊红染色、碱性磷酸酶染色、钙结节茜素红染色对获得的细胞进行生物学特性的观察与鉴定。然后将第3代细胞与聚乳酸/壳聚糖纤维、聚乳酸-壳聚糖纤维/硅酸钙、聚乳酸-壳聚糖纤维/羟基磷灰石-硅酸钙三种支架材料体外复合培养。培养3,6,9 d后,采用倒置相差显微镜观察材料周边的细胞形态,通过碱性磷酸酶活性测定法和MTT法观察3种支架材料对细胞分化、增殖的影响。 结果与结论：三种材料均有利于成骨细胞的黏附、生长、分化、增殖,而聚乳酸-壳聚糖纤维/羟基磷灰石-硅酸钙复合支架材料较聚乳酸/壳聚糖纤维、聚乳酸-壳聚糖纤维/硅酸钙支架材料促进成骨细胞的分化增殖效果更好,证实其生物相容性好,有望成为一种新型的骨组织工程支架材料。 关键词：复合支架;细胞相容性;生物材料;成骨细胞;组织工程支架材料;骨组织工程 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2010.08.016     

大鼠骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构变化

背景：目前对骨髓间充质干细胞成骨诱导分化的超微结构观察的报道甚少。 目的：采用全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,成骨诱导并染色鉴定,利用电镜观察诱导前后细胞超微结构变化特点。 方法：全骨髓贴壁法体外分离、培养、纯化大鼠骨髓间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标记物,成骨染色鉴定向成骨方向诱导分化,扫描电镜及透射电镜观察成骨诱导前后细胞超微结构变化。 结果与结论：培养的第3代骨髓间充质干细胞纯度高、活力强,成骨诱导后的碱性磷酸酶活性染色、钙化结节染色均呈阳性。扫描电镜及透射电镜观察显示,经向成骨细胞诱导分化后,细胞形态铺展,不规则,其线粒体、粗面内质网、空泡明显增多,表明细胞功能活跃。     

模拟失重状态下成骨细胞胰岛素样生长因子1基因表达与降钙素的干预

背景：航天飞行、长期卧床等低重力负荷状态会引起骨吸收和骨形成的代谢紊乱,导致骨质疏松。有研究显示降钙素有直接促进成骨细胞增殖的作用,并可增加成骨细胞胰岛素样生长因子1 mRNA的表达。 目的：观察降钙素和体外模拟失重状态对成骨细胞功能及胰岛素样生长因子1基因表达的影响。 方法：采用二次酶消化法提取新生SD大鼠颅骨的成骨细胞,凝胶化形成成骨细胞海藻酸钠微包囊后进行实验。实验分为正常重力组、模拟失重组、模拟失重+降钙素(10,40,80 IU/L)组。将细胞置于模拟失重三维回转培养器中培养72 h后,检测成骨细胞的增殖、凋亡及碱性磷酸酶活性;采用RT-PCR 方法检测胰岛素样生长因子1、碱性磷酸酶、骨钙素mRNA的表达。 结果与结论：与正常重力组比较,模拟失重组细胞增殖率及培养基中碱性磷酸酶活性均明显降低(P < 0.01),胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达减少,凋亡增多;与模拟失重组比较,模拟失重+降钙素组细胞增殖率,胰岛素样生长因子1、骨钙素、碱性磷酸酶mRNA表达均有所增加,但无剂量依赖关系。说明降钙素可通过上调胰岛素样生长因子1 mRNA表达改善模拟失重条件下成骨细胞的增殖与分泌功能。     

永生化人骨髓基质细胞的表面抗原及多向分化研究

目的研究本所转入人端粒酶逆转录酶基因的人骨髓基质细胞（hMSC—TERT细胞）的生物学特性。方法复苏hMSC—TERT细胞第30代，扩增，流式细胞仪检测细胞表面抗原；进行体外脂肪细胞、成骨细胞定向诱导，并分别进行油红O染色、碱性磷酸酶染色及von Kossa染色。结果hMSC—TERT细胞表面抗原检测CD34、CD5、CD44、CD106、CD166均为阴性；脂肪细胞定向诱导后油红O染色见胞浆内有红色脂肪颗粒，成骨细胞定向诱导后见胞浆内有碱性磷酸酶染色阳性黑褐色颗粒，von Kossa染色见有钙结节形成。结论hMSC—TERT细胞依然保留骨髓基质干细胞的自我更新特性及多向分化潜能。     

脐带间充质干细胞向成骨细胞分化的潜能

背景：人脐带间充质干细胞含量丰富,较为原始,分化能力强,免疫原性低,是细胞治疗的理想靶细胞。 目的：体外分离培养脐带间充质干细胞并将其定向诱导为成骨细胞。 方法：无菌条件下培养脐带间充质干细胞,分为诱导组和对照组,诱导组用成骨诱导液处理、对照组为干细胞培养液处理。倒置光显微镜观察细胞形态,MTT法测细胞增殖,荧光双染法检测细胞活力,流式细胞仪检测细胞周期与细胞表面标记。诱导后：检测碱性磷酸酶,Von Kossa染色分析钙盐沉积,RT-PCR检测骨桥蛋白基因、碱性磷酸酶、骨唾液蛋白mRNA的表达。 结果与结论：传代细胞形态稳定、活力好,高标达CD44。诱导后von Kossa染色表现为阳性。碱性磷酸酶活性诱导组比对照组高(P < 0.05),不同时间点比较21 d最高(P < 0.05)。RT-PCR显示：诱导组21,28d 碱性磷酸酶mRNA表达均较与对照组增强(P < 0.05)。诱导组有骨唾液蛋白和骨桥蛋白基因mRNA表达。提示,人脐带间充质干细胞能够定向分化为成骨细胞。     

兔骨髓间充质干细胞的体外培养及多向诱导分化

髓间充质干细胞的分离获取及培养鉴定一直以来仍无统一标准和定论。 目的：体外获取兔骨髓间充质干细胞、纯化、扩增,同时研究其生物学特性及多向分化潜能。 方法：采用贴壁筛选法分离培养兔骨髓间充质干细胞,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线;倒置相差显微镜、苏木精-伊红染色及碱性磷酸酶染色观察细胞形态;并向成骨细胞、软骨细胞和血管内皮细胞多向诱导分化,分别采用钙结节茜素红染色、甲苯胺蓝染色和荆豆凝集素染色鉴定。 结果与结论：经贴壁筛选法得到的骨髓间充质干细胞性状稳定,为纺锤状,呈克隆样生长,碱性磷酸酶染色弱阳性;经成骨、成软骨、成血管内皮细胞诱导培养的骨髓间充质干细胞,表现出相应细胞的形态特征和生物学特征。提示,全骨髓培养法取材方便,骨髓间充质干细胞增殖能力强,在适宜条件下能够多向分化。     

富血小板血浆诱导兔骨髓基质干细胞向成骨细胞的分化

背景：对于骨髓基质干细胞向成骨细胞的定向诱导分化,目前大多存在诱导物价格昂贵、制备困难或细胞培养周期长、成骨能力低等缺点,近年研究发现浓缩血小板中存在的生长因子有诱导骨再生的作用。 目的：观察富血小板血浆对体外培养兔骨髓基质干细胞的增殖和成骨细胞分化作用。 方法：从8只兔双侧股骨大转子抽取骨髓,体外分离培养兔骨髓基质干细胞,传至第3代分为两组,实验组用含1%富血小板血浆的DMEM进行干预,对照组加入普通DMEM条件培养液。 结果与结论：倒置显微镜下,原代培养细胞24~36 h后开始贴壁,10~12 d细胞融合成单层。实验组细胞培养第2天已贴壁,第6天细胞大部分融合;对照组细胞形态学变化较实验组晚出现1~3 d。培养第2,6,10,14天,碱性磷酸酶活性测定和茜素红钙结节染色结果显示,体外培养的兔成骨细胞生长良好,生化指标稳定,表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性,证实富血小板血浆能促进体外培养的兔骨髓基质干细胞增殖,并能促使其向成骨细胞分化。     

胶原-纳米羟基磷灰石复合支架的细胞相容性

背景：观察成骨细胞在生物材料上的形态、增殖和分化等项目,可评估生物支架材料的生物相容性。 目的：观察复合支架材料纳米羟基磷灰石/胶原对成骨细胞增殖、分化的影响。 方法：取新生24 h内Wistar大鼠的颅盖骨,采用改良胶原酶消化法进行成骨细胞原代培养,取第3代细胞与纳米羟基磷灰石/胶原支架或普通羟基磷灰石材料体外复合培养。培养3,6,9 d后,观察材料周边的细胞形态及支架材料对细胞分化、增殖的影响。 结果与结论：纳米羟基磷灰石/胶原材料较普通的羟基磷灰石材料更有利于成骨细胞的黏附、生长、分化、增殖,证实其生物相容性更好,有望成为一种新型的骨组织工程支架材料。     

诱导分化过程中不同融合状态大鼠骨髓间充质干细胞成骨的差异

背景：诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的方案已基本成熟，但是诱导过程中影响分化效果的因素仍处于探索阶段。 目的：观察诱导时机的选择对大鼠骨髓间充质干细胞分化为成骨细胞的影响。 设计、时间及地点：以细胞为对象的观察实验，于2006-08/2007-01在苏州大学江苏省干细胞重点实验室完成,省级重点实验室完成。 材料：骨髓间充质干细胞来源于SD大鼠，雌雄不限，体质量150~200 g。 方法：采用Percoll淋巴细胞分离液分离培养大鼠骨髓间充质干细胞。将第3代大鼠骨髓间充质干细胞以5×107 L-1密度分组培养，诱导组分别于接种当时、细胞达50%~60%融合时、细胞达85%~95%融合时加入含地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C的成骨诱导培养基诱导。非诱导组采用普通培养基培养。 主要观察指标：诱导后7，14 ，21，28 d行钙钴染色、Von-Kossa染色、碱性磷酸酶活性检测成骨细胞能力。定期在倒置相差显微镜下观察细胞形态变化及生长状况。 结果：经钙钴染色后，诱导组大部分染色的细胞呈阳性反应，胞浆中可见浅棕色至棕黑色的细胞颗粒，大多数多角形细胞呈阳性，如铺路卵石样排列，随着时间的延长，可见片状强阳性细胞，以细胞达85%~95%融合时诱导培养组数量最多，结节体积最大。非诱导组未见片状强阳性细胞。Von-Kossa 染色后可见深棕色致密结节。以细胞达85%~95%融合时诱导培养组形成结节较早，同期相比数量较其他组多。细胞内碱性磷酸酶活性检测表明经成骨诱导剂诱导后与同期非诱导组相比细胞内碱性磷酸酶活性明显提高，表现细胞成骨分化特点。 结论：初始接种密度相同的情况下，细胞间相互接触程度越高，成骨能力越强。