α7烟碱型乙酰胆碱受体点突变体的制备及其功能研究

目的 利用氨基酸定点突变技术以大鼠野生型α7烟碱型乙酰胆碱受体(nAChR)为模板制备α7 nAChR突变体。方法 采用体外转录、定点突变、凝胶电泳、双电极电压钳等技术对α7 nAChR进行点突变,在非洲爪蟾卵母细胞上表达α7 nAChR及其突变体,并研究其受体活性功能。结果 将α7 nAChR第111位的丙氨酸突变为丝氨酸,制备了α7 nAChR的点突变体,测定了突变体对激动剂乙酰胆碱(ACh)的半数效应浓度(EC₅₀)为165.6 μmol/L。结论 该结果不仅为受体定点突变提供了一种方法,同时为药物筛选和研究α7 nAChR结构与功能关系提供了模型。     

淀粉样β蛋白1-40对爪蟾卵母细胞表达的淋巴细胞神经递质受体功能的影响

观察淀粉样β蛋白_1-40(Aβ_1-40)对爪蟾卵母细胞表达的淋巴细胞神经递质受体(NR)功能的影响,探讨淋巴细胞NR功能检测在阿尔茨海默痴呆(AD)病理生理学上的意义. 将提取的人外周血淋巴细胞mRNA(50 ng)显微注射到成熟的非洲爪蟾卵母细胞,在(19.0±1.0)℃条件下孵育24 h后采用双电极电压钳位记录-60 mV维持电位时的受体激活电流. Aβ_1-40于记录前12 h加入孵育液. 结果发现注射人外周血淋巴细胞mRNA的爪蟾卵母细胞能表达出乙酰胆碱, 谷氨酸, 多巴胺, 5-羟色胺和γ-氨基丁酸受体. 这些表达的受体激活电流的共性是由氯离子载流的内向电流,其平衡电位接近于-22 mV. Aβ_1-40 60 nmol·L^-1对卵母细胞表达的NR功能有抑制效应,其NR峰电流降低分别为乙酰胆碱23%, 谷氨酸27%, 多巴胺25%,维生素E有拮抗Aβ_1-40效应的作用。外周血淋巴细胞NR功能检测作为AD外周评价指标值得更深入的研究.     

肌肉型乙酰胆碱受体在HEK293细胞上的表达

目的　利用受体克隆技术 ,建立骨骼肌细胞乙酰胆碱受体 (m nAChR)的实验模型 ,以便进行各种药理研究。方法　应用分子生物学技术将编码小鼠m nAChR的α、β、γ、δ、ε亚基之cDNA分别重组于真核细胞表达质粒pcDNA3 1+ 上 ,用脂质体转染技术 ,将重组后的pcDNA3 1+ 导入HEK2 93细胞 ,使其细胞膜上表达胚胎型乙酰胆碱受体 (γ nAChR)和成年型乙酰胆碱受体 (ε nAChR) ,这样建立了两种m nAChR亚型的实验模型。应用全细胞膜片钳技术测量转染细胞对该受体的内生配基乙酰胆碱的反应。结果　乙酰胆碱可激发转染细胞产生一内向电流 ,电流的大小与乙酰胆碱呈浓度依赖性。结论　HEK2 93细胞在转染后 2 4～ 72h内 ,其细胞膜上表达γ nAChR或ε nAChR ,用于进行各种药理实验。     

人淀粉样蛋白前体695基因及人烟碱乙酰胆碱受体α4β2亚单位基因共表达细胞模型的构建

目的为满足寻找可能影响淀粉样β蛋白(Aβ)在阿尔茨海默病过程中的药物实验的需求,建立共表达人淀粉样蛋白前体(APP)695基因和烟碱乙酰胆碱受体(nAChR)α4β2亚单位基因的细胞模型。方法用脂质体转染方法把APP695基因转染进已稳定转染nAChRα4β2亚单位基因的SH-EP1细胞。用500mg.L-1G418加压筛选,并挑选细胞单克隆。用RT-PCR和Western蛋白印迹法对转染后的细胞单克隆进行鉴定,挑取成功转染并高表达APP695的细胞进行克隆。膜片钳检测所挑细胞克隆的α4β2受体功能。结果挑出成功稳定转染人APP695基因及人nAChRα4β2亚单位基因的共表达细胞克隆株。膜片钳方法检测到此细胞克隆株上nAChRα4β2存在活性。结论成功制备了共表达人APP695基因及人nAChRα4β2亚单位基因的细胞模型,为探讨神经元nAChRα4β2亚型对Aβ加工影响的药物实验提供了条件。     

在非洲爪蟾卵母细胞上表达大鼠肌肉乙酰胆碱受体的方法学研究

目的 :建立适合于研究肌肉松驰药作用的乙酰胆碱受体的实验模型。方法 :采用磁珠技术从大鼠肌肉中提取多聚腺嘌呤mRNA ,注入去膜的非洲爪蟾卵母细胞 ,表达为有功能的离子通道 ,并与未去膜和去膜未注射的卵母细胞比较 ,利用电压钳方法记录电压依赖性的离子通道电流 ,观察并分析三组电流特性。结果 :三组卵母细胞的静息膜电位和钳制到 - 6 0mV时的补偿电流之间无显著的统计学意义 ,通过去除卵母细胞的卵泡膜可以去除内源性受体的干扰 ,在注射大鼠肌肉mRNA的卵母细胞膜上记录到典型的N2 型ACh受体的电流。结论 :本实验建立的模型可作为在细胞和蛋白水平研究肌松药的方法。     

α4β2亚型烟碱受体激动抑制SH-EP1-α4β2 nAChR-hAPP695细胞BACE1基因启动子活性

目的：为了在构建的共表达α4β2烟碱亚型受体（nAChR）基因和淀粉样蛋白前体蛋白（APP695）基因的SH-EP1-α4β2 nAChR—hAPP695细胞模型进行高通量药物筛选，探索用基因启动子活性分析作为在此细胞模型进行亚型特异性药物筛选的简捷节省的方法。方法：用荧光定量PCR的方法，探测在SH-EP1-α4β2 nAChR-hAPP695细胞模型α4β2 nAChR激动对BACE1和PSEN1 mRNA水平的影响；     

非洲爪蟾卵母细胞上内源性ATP及GABA激活电流的比较

实验用双电极电压钳技术在具有滤泡膜的非洲爪蟾卵母细胞上记录三磷酸腺苷 (ATP)与γ-氨基丁酸 (GABA)激活电流 ,并对两者进行了比较。结果显示 ,在不同的非洲爪蟾卵母细胞上 ,ATP和 GABA受体分布的种类和数目不同 ;且 ATP和 GABA激活电流均与 K+通道有关     

Kir2.1/Kir2.3嵌合体的构建与表达

目的构建Kir2.1/Kir2.3通道嵌合体,为进一步研究Kir2.1和Kir2.3通道的调控机制打下基础。方法利用重叠延伸PCR方法构建不同的Kir2.1/Kir2.3嵌合体质粒:N1P3C3,N3P1C1,N3P3C1,N1P1C3,NIP3C1,N3P1C3。将不同的嵌合体质粒分别用NheI线性化后,转录为cRNA表达于非洲爪蟾卵母细胞,用双电极电压钳记录电流。结果不同的Kir2.1/Kir2.3嵌合体质粒构建成功,在非洲爪蟾卵母细胞上可以记录到电流表达。结论成功构建Kir2.1/Kir2.3嵌合体并完成了嵌合体通道的异源性表达和电压钳记录。     

水分子在尼古丁与α4β2烟碱乙酰胆碱受体结合过程中的作用研究

目的 为了了解水分子在尼古丁与α4β2烟碱乙酰胆碱受体（nAChR）结合过程中的作用机制以及其在构象稳定中的作用,本研究对尼古丁与α4β2 nAChR的结合进行了分子动力学（MD）模拟。方法 对与激动剂尼古丁结合的α4β2 nAChR体系运行500 ns的全原子分子动力学模拟。结果 模型表明,关键的水分子存在于α4(+)β2(-)的结合部位,形成氢键连接尼古丁的吡啶N、β2 L121的骨架NH原子和N109的羧基氧原子。还发现与尼古丁结合的α4β2 nAChR中,C环开放程度在不同亚基之间有明显的差异,结论 桥接水分子通过形成3个氢键连接尼古丁与受体蛋白,在尼古丁与α4β2受体的结合中起重要作用。     

烟碱乙酰胆碱受体结构的研究进展

烟碱型乙酰胆碱受体（nAChR）是离子通道型受体,属于Cys-loop受体的超级家族,通过配体门控离子通道介导许多生理活动,是治疗精神类疾病的重要靶点。nAChR包括肌肉型和神经型两种。nAChR是由五个亚基组成的具有中心孔道的五聚体,本文简要介绍了近年来烟碱乙酰胆碱受体结构的研究进展。     

以α7 nAChR为靶点的药物研究进展

α7 nAChR属于烟碱型乙酰胆碱受体,是由5个α7单体组成的配体门控离子通道。α7 nAChR的配体结合位点主要有两种,即激动剂(拮抗剂)结合位点以及变构调节位点。α7 nAChR是精神分裂症认知障碍以及阿尔茨海默病药物研究的一个重要靶点,现已有多个治疗药物处在临床试验阶段。本文主要综述了α7 nAChR激动剂以及变构调节剂药物的研究进展。     

人心律失常相关基因Kv1.5和Kv4.2在蟾卵母细胞上的表达

本文采用基因克隆、膜片钳和微注射技术，分别将人的心律失常相关基因Kv1.5和Kv4.2 cDNA转录入cRNA,将Kv1.5 cRNA和Kv4.2 cRNA分别注射蟾蜍卵母细胞（Xenopus oocytes)，分别在蟾蜍卵母细胞上获得纯净，单一的超速延迟性整流钾电流（Ikur,ultrarapid delayed rectifier K^ current)和瞬时外向钾电流（Ito,transient outward K^ current)表达，克服以往在筛选评价抗心律失常药物时，人新鲜心肌细胞取材困难，以及多种电流在细胞膜上共同表达等缺点，从而建立筛选评价Ⅲ类抗心律失常药物的先进药理模型。     

兴奋性氨基酸受体所介导细胞钙电流特征及其中L-SOP的作用途径

目的:研究兴奋性氨基酸受体各亚型所介导非洲爪蟾卵母细胞跨膜电流的特征及其中Ⅲ型受体激动剂L-SOP的作用途径.方法:用异硫氰酸胍-酚-氯仿法从成年大鼠脑中提取总RNA,以寡聚脱氧胸苷酸纤维素亲和层析法分离出mRNA并注射入非洲爪蟾卵母细胞使表达,以全细胞双电极电压钳位法灌流此卵母细胞.结果:100 μM KA(kainate)(离子型)产生一主峰电流后缓慢下行,成为一稳定电流平台,最终脱敏,脱敏时间平均为37.57 min.2 μM QA(quisqualate)(代谢Ⅰ型)产生一峰值电流后转为一持续性钙振荡或直接出现钙振荡,振荡维持时间为(6.72±1.33)min,脱敏时间均随激动剂浓度的增加而缩短.0.8 mM L-SOP(L-phosphoserine)(代谢Ⅲ型)灌流产生规律性电流振荡,振荡时间为(20.17±8.47)min.此振荡电流可被代谢Ⅰ型受体拮抗剂L-AP3所拮抗.结论:离子型、代谢Ⅰ型及代谢Ⅲ型受体均产生各自特征电流模型;L-SOP不仅是Ⅲ型受体的激动剂,而且是Ⅰ型受体的弱的激动剂,即细胞振荡电流是L-SOP通过Ⅰ型受体的作用途径而产生.     

烟碱α4β2型受体与相关疾病及药物研究进展

4β2型烟碱受体(nAChR)是一种配体门控离子通道,在整个神经系统几乎都有分布,参与乙酰胆碱、多巴胺、γ-氨基丁酸、去甲肾上腺素等神经递质的调节和释放,在机体的学习、记忆、认知、注意力、炎症以及疼痛中发挥重要作用。大量研究表明,α4β2型nAChR是阿尔茨海默症、帕金森病、癫痫、抑郁症、尼古丁依赖、疼痛等神经系统性疾病的重要治疗靶点,对以老年痴呆为主的神经退行性疾病早期诊断和疗效检测具有重要意义。本文总结了α4β2型nAChR在神经系统性疾病治疗中的作用、机制以及相关药物研究进展,为筛选和开发更合适的α4β2型nAChR相关化合物提供理论依据。     

大鼠酸感受离子通道亚基2a表达质粒的构建及生物学特性考察

目的构建大鼠酸感受离子通道亚基2a(acid-sensingion channel subunit 2a,ASIC2a)的表达质粒并研究其组成的同聚体离子通道的生物学特性。方法使用分子生物学技术构建大鼠ASIC2a亚基表达质粒;通过体外转录技术,使编码ASIC2a亚基的cRNA在爪蟾卵母细胞内表达并在膜表面形成同聚体离子通道;使用双电极电压钳技术研究ASIC2a的生物学特性。结果在注射ASIC2a亚基cRNA的爪蟾卵母细胞上,降低胞外液pH值可诱导出内向电流。H+诱发的ASIC2a内向电流具有稳态失活成分可被氨氯吡咪可逆性阻断,其pH50为5.12。提高胞外Ca2+浓度可降低H+诱发的电流幅度,其IC50为11.98 mmol.L-1。当细胞外液中无Na+时,H+基本上不能诱发出内向电流;当同时去除细胞外液中Na+和K+时,H+可诱发出外向电流。结论成功构建ASIC2a表达质粒;ASIC2a除了对Na+通透外,对K+也有一定的通透性,胞外Ca2+抑制ASIC2a孔道的开放。     

肌醇依赖性激酶1α对心脏发育的影响

目的 探讨肌醇依赖性激酶1α(IRE1α)对非洲爪蟾心脏发育的影响.方法 通过显微注射IRE1αmRNA实现基因过表达,注射IRE1α或其下游基因XBP1特异性反义寡核苷酸(MO)实现基因封闭;利用全胚胎原位杂交方法检测基因表达,免疫组化方法检测体节形成.结果 过表达IRE1α对心脏发育无明显影响;利用MO封闭IRE1α或XBP1后,心脏明显减小,形态异常,心脏发育相关基因nkx2.5表达下降,但对体节无影响.结论 IRE1α影响非洲爪蟾心脏的发育,可能是通过XBP1发挥作用.     

注射老龄大鼠脑皮层mRNA的爪蟾卵母细胞对乙酰胆碱，谷氨酸和5－羟色胺的反应

从老年（３２月龄）和成年（３月龄）大鼠大脑皮层提取多聚腺啤呤ｍＲＮＡ，注入非洲爪蟾卵母细胞表达有功能的神经递质受体。用电生理方法检测乙酰胆碱，谷氨酸和５－羟色胺诱发的去极化反应，揭示老化脑递质受休反应的变化。注射老年大鼠大脑皮层ｍＲＮＡ的卵母细胞对三种递质诱发反应去极化幅度下降，上升时间及潜伏期延长，Ｔ１／２缩短，与成年对照组有显著性差异；三种递质受体反应幅度约为成年对照组的４０％－６０％，其变化趋势相同，表明老年大鼠脑递质受体蛋白合成的翻译水平发生了改变     

非洲爪蟾卵非细胞翻译体系的建立及应用

目的　当前人类基因组研究的重心正在由“结构”向“功能”转移。而基因功能的研究离不开基因的表达 ,这就迫切需要一种操作简便 ,适用范围广的表达工具来表达有功能的蛋白质。方法　非洲爪蟾注射HCG催卵 ,2 %半胱氨酸去胶膜 ,高速离心制备卵提取物 ,即为非洲爪蟾卵非细胞翻译体系。通过亚克隆技术将TFAR1 9基因克隆到体外转录质粒中 ,通过酶切线性化模板 ,体外转录 ,加帽合成cRNA ,将其加入到制备的蛙卵提取物中进行体外翻译。结果　用Westernblot鉴定 ,获得了高效翻译 ,并且加入亚精胺和ATP再生系统可以提高翻译的效率。结论　非洲爪蟾卵非细胞翻译体系为表达有功能的蛋白提供了一种极有应用前景的表达工具     

海南产芋螺毒素在疼痛与成瘾治疗中的应用前景

芋螺毒素(conotoxin,conopeptide,CTX)是热带海洋软体动物芋螺分泌的一类用于麻醉猎物的神经毒素肽,是当今国际生物药物研究的热点,被誉为海洋药物宝库,已跃居动物神经毒素研究的首位。其结构新颖,多样性高,活性强,选择性高,能区分各种离子通道的不同亚型,广泛应用于神经药理学的研究、及作为诊断试剂与治疗药物。不同芋螺种类的毒素互不相同,且同一种类不同个体之间的毒素成份及其活性也差异很大,特别是对神经系统疾病有非常重要的研究与诊断治疗作用。在我国,芋螺是海南特有的药用海洋生物资源,其毒素具有特异结合动物体内各种离子通道受体的特殊功能,在镇痛和戒烟戒毒,以及治疗帕金森症、精神病等重大疾病方面具有极好的应用前景。芋螺毒素大多是由7～50个氨基酸残基组成的、富含半胱氨酸(Cys)的神经肽毒素。芋螺毒素按其前体蛋白的内质网信号肽序列的相似性,以及半胱氨酸模式,分为不同的基因家族,至今,所有已知的芋螺毒素可分为17个超家族,分别为A,C,D,S,M,I1,I2,I3,J,L,O1,O2,O3,P,T,V,Y。按其受体靶位可分为α,ω,μ,δ等多种药理学家族。每个超家族根据受体靶类型,又可分为α,αA,κA(A-超家族),ω,δ,κ,μO(O-超家族),μ,ψ,κM(M-超家族)等家族(亚型)。其中的α-家族类芋螺毒素(α*-CTX)特异阻断哺乳动物的烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)。nAChRs是动物界普遍存在的具有重要生理作用和临床研究意义的离子通道型受体,其介导众多中枢和外周神经系统的生理功能,包括学习、记忆、应答、镇痛和运动控制等。nAChRs激活多巴胺、去甲肾上腺素、五羟色胺、γ-氨基丁酸等多种神经递质的释放。已证实nAChRs是筛选诊断和治疗一大类重要疾病药物的关键靶点,这些疾病包括成瘾、疼痛、癌症、智障、帕金森症、精神病、抑郁、重症肌无力等疑难杂症。至今对于上述疾病还没有对症治疗的药物。常用的非选择性的nAChRs激动剂如烟碱,虽然可以缓解上述神经疾病的症状,但它们对心脏和胃肠道产生强烈的副作用,且有成瘾性。因此,开发针对nAChRs各种亚型具有高选择性的配体药物是治疗上述疾病的关键所在。研究表明,α9α10 nAChR是治疗神经痛、癌症化疗、乳腺癌、肺癌、伤口愈合等的新靶点;阻断脊髓神经上的α3β2nAChR,通过抑制C-纤维释放谷氨酸进行疼痛信号的传递,可产生镇痛效应。α9α10 nAChR阻断剂具有治疗神经痛和加速受伤神经恢复的功能。角化细胞上的α9α10 nAChR在伤口愈合的病理生理学过程中起着很重要的作用。α9nAChR亚基在乳腺癌组织中过表达。α9亚基变体影响支气管细胞的转化与增殖,该亚基在乳腺癌与肺癌的治疗中具有非常重要的意义。表达在多巴胺能神经元上的α6β2*-nAChRs能被内源乙酰胆碱(Ach)或外源烟碱(尼古丁)及其类似物激活,也就是说,α6β2*-nAChRs的激活在中枢神经系统的胆碱能信息传递通路中起着至关重要的作用,包括运动行为以及药物成瘾的调节。阻断含有α6β2*的nAChRs可有效防止烟瘾、可卡因和吗啡毒瘾的发作,显著抑制吸烟和吸毒的欲望,预示α-芋螺毒素在戒烟、戒毒新药的研发领域具有巨大的潜力。能治疗成瘾的α-芋螺毒素的预期经济和社会效益无可限量。已证实α6/α3β2β3 nAChR是烟碱和其他药物,如可卡因和吗啡等成瘾治疗的新靶点。另外,阻断α3β4 nAChRs可有效减少鸦片与其他刺激物的自身给药欲望和行为。α3β4 nAChR基因敲除的小鼠明显减少烟瘾的发作。因此,α6/α3β2β3与α3β4 nAChRs阻断剂在戒烟戒毒新药的研发领域具有非常重要的价值。我们从海南产芋螺中研究发现了5个特异阻断nAChRs的新颖芋螺毒素及其突变体,分别是αB-CTX VxⅩⅩⅢA,αO-CTX GeⅩⅣA,3个α-CTXs LvⅠA,Txd4和TxIC突变体。其中,αB-CTX VxⅩⅩⅢA来自菖蒲芋螺(Conus vexil-lum),是我们首次发现的一个新超家族芋螺毒素,其半胱氨酸模式和信号肽、以及前肽的组成区域均与以往发现的芋螺毒素完全不同,我们将之定名为B-超家族芋螺毒素,第23种(ⅩⅩⅢ)半胱氨酸模式(4个Cys)的第一个毒素肽。含有40个氨基酸的αB-CTX VxⅩⅩⅢA的前体肽只含有信号肽和成熟肽,而没有其他已知超家族普遍含有的前肽区部分。我们成功合成了αB-CTX VxⅩⅩⅢA的3种可能的异构体,经活性检测发现,αB-CTX VxⅩⅩⅢA是α9α10 nAChR的特异阻断剂。来自将军芋螺(C.generalis)的新芋螺毒素αO-CTX GeⅪⅤA,与O-超家族芋螺毒素前体蛋白信号肽具有很高的同源性,αO-CTX GeⅪⅤA前体由信号肽、前肽和成熟肽3部分组成,推导的含有28个氨基酸的成熟肽含有与J-超家族芋螺毒素相同的半胱氨酸模式。高浓度的αO-CTX GeⅪⅤA既是nAChRs的阻断剂,也是NMDA受体〔N-methyl-D-aspar-tic acid receptor(NMDAR)〕的阻断剂,低浓度的αO-CTX GeⅪⅤA对α9α10 nAChR具有很好的选择性和最强的生物活性,其半阻断剂量(IC50)仅为4.6 nmol·L-1。系统研究了αO-CTX GeⅪⅤA对18个α9α10 nAChR与配体结合界面的关键氨基酸突变型的阻断活性,以及确定结合部位的竞争性试验。3个新的α-芋螺毒素(α-CTX)属于A-超家族芋螺毒素成员,分别是来自疣缟芋螺(Conus lividus)的LvIA,来自织锦芋螺(C.textile)的Txd4与TxIC突变体。它们对相应的nAChRs亚型具有极好的选择性和很强的生物活性。α-CTXLvIA特异阻断α3β4 nAChR,其半阻断剂量(IC50)为12.5nmol·L-1;α-CTX Txd4特异阻断α6/α3β2β3 nAChR,其半阻断剂量(IC50)为28 nmol·L-1;α-CTX TxIC突变体特异阻断α3β2 nAChR,其半阻断剂量为14.5 nmol·L-1。这些新的海南产α-家族类芋螺毒素的作用靶点清楚,活性强,选择性高,是开发镇痛和戒烟戒毒等新药的原创先导药物,蕴涵着巨大的经济价值和社会效益。     

Effect of IRE1α knockdown on gut development

目的 探讨肌醇酶1α(IRE1α)在非洲爪蟾胚胎发育中的作用.方法 利用全胚胎原位杂交法检测IRE1α在胚胎发育晚期的表达;设计合成特异性封闭IRE1α的反义寡核苷酸(MO),通过显微注射方法实现基因封闭.结果 IRE1α在胚胎发育晚期高表达于胰腺.在体外翻译系统中,IRE1αMO可以阻断IRE1α蛋白质的合成.封闭IRE1α对胚胎发育早期无明显影响;但在发育晚期导致肠道结构消失,胚胎发育明显异常.结论 IRE1α对非洲爪蟾胚胎发育早期无影响,但在晚期导致肠道发育异常.