ROCK Ⅰ/Ⅱ基因下调对TGF-β1诱导的人主动脉平滑肌细胞迁移及增殖的影响

目的:探讨Rho激酶Ⅰ/Ⅱ(ROCKⅠ/Ⅱ)对转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人主动脉平滑肌细胞(HA-VSMCs)迁移及增殖的影响。方法:比较转染ROCKⅠsiRNA、ROCKⅡsiRNA、TGF-β1单独处理、转染ROCKⅠsiRNA或ROCKⅡsiRNA后加TGF-β1处理的HA-VSMCs中ROCKⅠ和ROCKⅡ蛋白表达;比较TGF-β1单独处理、转染ROCKⅠsiRNA或ROCKⅡsiRNA后加TGF-β1处理以及用ROCKⅠ抑制剂Y-27632后加TGF-β1处理的HA-VSMCs的迁移与增殖能力。实验均以无处理的HA-VSMCs为空白对照。结果:与空白对照HA-VSMCs比较,TGF-β1单独处理后HA-VSMCs的ROCKⅠ蛋白表达明显升高(P0.05),而ROCKⅡ蛋白表达无明显变化(P0.05);ROCKⅠsiRNA或ROCKⅡsiRNA转染后HA-VSMCs中各自靶蛋白表达明显降低(均P0.05),TGF-β1诱导的ROCKⅠ蛋白表达升高被ROCKⅠsiRNA转染明显抑制(P0.05)。与空白对照HA-VSMCs比较,TGF-β1单独处理后HA-VSMCs细胞迁移数明显增加(P0.05),该作用被ROCKⅠsiRNA转染及Y-27632处理明显抑制(均P0.05),而不被ROCKⅡsiRNA转染影响(P0.05);TGF-β1单独处理后HA-VSMCs增殖明显增强(P0.05),而无论ROCKⅠsiRNA、ROCKⅡsiRNA转染或Y-27632处理均对TGF-β1的增殖诱导作用无明显影响(均P0.05)。结论:ROCKⅠ可能在TGF-β1诱导的HA-VSMCs迁移中起主要作用,而ROCKⅠ和ROCKⅡ可能均不参与TGF-β1诱导的HA-VSMCs增殖。     

ROCKI/II在转化生长因子β1诱导的主动脉平滑肌细胞表型转化中的作用

目的：探讨ROCKI/II在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人主动脉平滑肌细胞（HA-VSMC）表型转化中的作用。 方法：将HA-VSMC分别转染ROCKI和ROCKII的siRNA后荧光显微镜观察转染情况,并用Western blot方法检测不同处理的HA-VSMC（ROCKI siRNA转染、ROCKII siRNA转染、+TGF-β1、ROCKI siRNA转染+TGF-β1、ROCKII siRNA转染+TGF-β1）中ROCKI和ROCKII蛋白的表达;分别用Western blot和RT-PCR方法检测不同处理的HA-VSMC（+TGF-β1、ROCKI siRNA转染+TGF-β1、ROCKII siRNA转染+TGF-β1、ROCK非特异性抑制剂Y-27632预处理+TGF-β1）中细胞收缩表型标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、平滑肌22α（SM22α）与合成表型标志物骨桥蛋白（OPN）的蛋白与mRNA表达,均以无处理的HA-VSMC为空白对照。 结果：免疫荧光观察与Western blot检测表明两种siRNA均成功转染;TGF-β1处理后,HA-VSMC中ROCKI蛋白表达明显升高（P<0.05）,但ROCKII蛋白表达无明显变化（P>0.05）,ROCKI siRNA转染后TGF-β1上调ROCKI的作用被明显抑制（P<0.05）。与空白对照组HA-VSMC比较,TGF-β1处理后的HA-VSMC中α-SMA、SM22α的蛋白和mRNA表达明显降低,而OPN蛋白与mRNA表达明显升高（均P<0.05）,ROCKI siRNA转染或Y-27632预处理后,TGF-β1的上述作用均明显减弱（均P<0.05）,ROCKII siRNA转染对TGF-β1的上述作用均无明显影响（均P>0.05）。 结论：TGF-β1可诱导HA-VSMC由收缩表型向合成型表型转化,ROCKI表达的升高可能在这一转化中起主要作用。     

ROCKⅠ/Ⅱ在转化生长因子β1诱导的主动脉平滑肌细胞表型转化中的作用

目的:探讨ROCKⅠ/Ⅱ在转化生长因子β1(TGF-β1)诱导的人主动脉平滑肌细胞(HA-VSMC)表型转化中的作用。方法:将HA-VSMC分别转染ROCKI和ROCKII的si RNA后荧光显微镜观察转染情况,并用Western blot方法检测不同处理的HA-VSMC(ROCKI si RNA转染、ROCKII si RNA转染、+TGF-β1、ROCKI si RNA转染+TGF-β1、ROCKII si RNA转染+TGF-β1)中ROCKI和ROCKII蛋白的表达;分别用Western blot和RT-PCR方法检测不同处理的HA-VSMC(+TGF-β1、ROCKI si RNA转染+TGF-β1、ROCKII si RNA转染+TGF-β1、ROCK非特异性抑制剂Y-27632预处理+TGF-β1)中细胞收缩表型标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、平滑肌22α(SM22α)与合成表型标志物骨桥蛋白(OPN)的蛋白与m RNA表达,均以无处理的HA-VSMC为空白对照。结果:免疫荧光观察与Western blot检测表明两种si RNA均成功转染;TGF-β1处理后,HA-VSMC中ROCKI蛋白表达明显升高(P0.05),但ROCKII蛋白表达无明显变化(P0.05),ROCKI si RNA转染后TGF-β1上调ROCKI的作用被明显抑制(P0.05)。与空白对照组HA-VSMC比较,TGF-β1处理后的HA-VSMC中α-SMA、SM22α的蛋白和m RNA表达明显降低,而OPN蛋白与m RNA表达明显升高(均P0.05),ROCKI si RNA转染或Y-27632预处理后,TGF-β1的上述作用均明显减弱(均P0.05),ROCKII si RNA转染对TGF-β1的上述作用均无明显影响(均P0.05)。结论:TGF-β1可诱导HA-VSMC由收缩表型向合成型表型转化,ROCKI表达的升高可能在这一转化中起主要作用。     

Smad4 siRNA对乳腺癌细胞侵袭力和MMP-9表达的影响

目的:探讨Smad4特异性小分子干扰RNA(siRNA)对乳腺癌MDA-MB-231细胞侵袭力及MMP-9表达的影响。方法:构建Smad4 siRNA,将细胞分为空白对照组,Smad4 siRNA转染组,TGF-β处理组,Smad4 siRNA转染+TGF-β处理组。首先用Western blot法检测转染Smad4 siRNA后细胞中Smad4蛋白的表达,以及用荧光素酶报告基因法检测TGF-β处理后细胞Smad结合元件(4xSBE)的活性;然后用Transwell小室模型和Western blot法检测各组细胞的黏附侵袭能力以及基质金属蛋白酶9(MMP-9)蛋白的表达水平。结果:转染Smad4 siRNA后,乳腺癌细胞的Smad4蛋白表达及其TGF-β诱导的4xSBE活性增强均被明显抑制(均P<0.05);与对照组细胞比较,细胞经TGF-β刺激后的侵袭能力及MMP-9的表达量均明显增加(均P<0.05),但预先转染Smad4 siRNA的细胞的上述TGF-β刺激作用被明显抑制(均P<0.05),单纯Smad4 siRNA转染对细胞的侵袭能力及MMP-9的表达量无明显影响。结论:Smad4 siRNA能减弱TGF-β诱导的MDA-MB-231细胞的侵袭能力,该作用可能与其抑制MMP-9的表达有关。     

PRS-CTGF-siRNA对TGF-β1诱导的人腹膜间皮细胞细胞外基质及VEGF表达的影响

目的 观察pRetro-Super(PRS)反转录病毒载体介导的表达人结缔组织生长因子(CTGF)小分子干扰RNA(siRNA)对体外培养的人腹膜间皮细胞(HPMC) 细胞外基质和血管内皮生长因子(VEGF)表达的影响。 方法 根据siRNA靶序列要求及PRS反转录病毒载体特点分别设计4 对寡核苷酸，构建表达人CTGF基因siRNA 的PRS-CTGF-siRNA1～4重组反转录病毒载体。以脂质体2000将重组反转录病毒载体转染PT67包装细胞，继而感染HPMC。采用RT-PCR法检测mRNA表达及Western印迹法检测蛋白质表达。 结果 5 μg/L外源性转化生长因子β1（TGF-β1）刺激可诱导HPMC表达CTGF、纤连蛋白（FN）、I型胶原（Col I）、层粘连蛋白（LN）和VEGF明显增高； 而PRS-CTGF-siRNA 1～4组与TGF-β1刺激组比较，HPMC细胞内CTGF、FN、Col I、LN mRNA和蛋白表达和VEGF mRNA表达明显较低（P < 0.01），各干扰组对CTGF mRNA抑制率分别为 69.3％、22.2%、27.4%和38.8%，其中以PRS-CTGF-siRNA 1组最为明显；同时PRS-CTGF-siRNA 1组相对于TGF-β1刺激组，VEGF蛋白表达也明显较低（P < 0.01）；而PRS空载体组与TGF-β1刺激组比较，差异无统计学意义（P ＞ 0.05）。 结论 PRS-CTGF-siRNA重组反转录病毒载体可明显抑制TGF-β1诱导的细胞外基质及VEGF表达的增加。     

RhoA-Rock信号通路在转化生长因子β1诱导大鼠腹膜间皮细胞转分化中的作用

目的　探讨RhoA-Rock信号通路在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导大鼠腹膜间皮细胞（RPMC）转分化中的作用。 方法　体外培养SD大鼠原代腹膜间皮细胞,静止24 h后,采用随机数字表法随机分为以下4组：正常对照组、TGF-β1（10 μg/L）刺激组、TGF-β1（10 μg/L）＋Y-27632（Rock特异性抑制剂,10 μmol/L）组（Y-27632预处理2 h）、Y-27632（10 μmol/L）组。用TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC不同时间,观察α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）,E钙黏素（E-cadherin）、Ⅰ型胶原（ColⅠ）的表达。RT-PCR法检测E-cadherin、α-SMA 和ColⅠmRNA表达。Western印迹法检测RhoA（包括总RhoA及活化的RhoA）、E-cadherin、α-SMA、ColⅠ和波形蛋白（vimentin）表达。活化的RhoA由膜蛋白提取试剂盒提取。 结果 （1）TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC能诱导RhoA活化,于10 min开始出现活性升高,为对照组的（2.57±0.52）倍（P < 0.05）;1 h达高峰,为对照组的（4.35±0.41）倍（P < 0.05）。（2）TGF-β1（10 μg/L）刺激RPMC能导致E-cadherin mRNA和蛋白表达下调,α-SMA、ColⅠmRNA和蛋白表达上调,呈时间依赖性。（3）Rock特异性抑制剂Y-27632能显著下调α-SMA、ColⅠmRNA的表达,较TGF-β1刺激组各降低了53.8%和55.7%（均P < 0.05）,并且能下调α-SMA、ColⅠ和vimentin蛋白的表达,较TGF-β1刺激组分别降低了42.6%、60.1%和58.1%（均P < 0.05）,但不能上调E-cadherin mRNA和蛋白的表达。 结论　TGF-β1可通过RhoA-Rock信号通路介导大鼠腹膜间皮细胞转分化,抑制该通路可作为防治腹膜纤维化的潜在靶点。     

TGF-β3和BMP-7腺病毒共转染兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化的研究

【摘要】 目的：探讨利用转基因技术构建的转化生长因子β3（transforming growth factor beta 3,TGF-β3）和骨形态发生蛋白7（bone morphogenetic protein 7,BMP-7）重组腺病毒转染兔骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchyme stem cells,BMSCs）,诱导其向类髓核细胞分化的可行性。方法：将培养获得的BMSCs分成5组,A：空白对照组,B：免疫荧光对照组,C：TGF-β3单独转染组,D：BMP-7单独转染组,E：TGF-β3+BMP-7共转染组。利用转基因技术构建的TGF-β3和BMP-7重组腺病毒对BMSCs进行转染,荧光显微镜观察其转染效率,培养14d后,再以Western-Blot方法检测A、C、D、E组细胞TGF-β3和BMP-7蛋白分泌情况,以Realtime PCR方法检测各组蛋白聚糖（ACAN）、Ⅰ型胶原（Collagen Ⅰ）、Ⅱ型胶原（Collagen Ⅱ）、Ⅹ型胶原（Collagen Ⅹ）、SOX9基因表达水平,明确腺病毒转染后兔骨髓间充质干细胞的分化情况。结果：以TGF-β3和BMP-7重组腺病毒转染兔BMSCs后常规DMEM培养基培养14d,细胞形态出现明显变化,圆形及椭圆形细胞明显增多。Western blot方法检测,共转染组TGF-β3和BMP-7蛋白表达水平明显增高。培养14d时,Realtime PCR检测ACAN、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅱ、SOX9基因的表达水平转染组（C、D、E组）较对照组（A、B组）明显升高（P<0.05）,其中Collagen Ⅰ和SOX9表达单独转染组（C、D组）与共转染组（E组）比较差异无显著性（P>0.05）,Collagen Ⅱ表达共转染组较单独转染组明显增高（P<0.05）。TGF-β3单独转染组和共转染组的Collagen Ⅹ基因表达较BMP-7单独转染组和对照组明显降低（P<0.05）。结论：转基因技术重组TGF-β3和BMP-7腺病毒可成功转染兔BMSCs,获得TGF-β3和BMP-7蛋白的表达。TGF-β3和BMP-7腺病毒共转染兔BMSCs后,可有效诱导兔BMSCs向类髓核细胞方向分化。     

Y-27632 对小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

目的探讨Rho A/ROCK通路特异性阻断剂Y-27632对小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖及成骨分化的影响。方法自小鼠股骨、胫骨骨髓腔分离培养小鼠骨髓单个核细胞,流式细胞仪细胞表面标记检测及细胞成骨、成脂、成软骨三系分化鉴定小鼠骨髓单个核细胞。将第3代小鼠骨髓间充质干细胞随机分为2组,单纯成骨诱导液对照组、Y-27632干预组。分别于细胞培养后1d、2d、3d、4d收集细胞,噻唑蓝(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)比色法观察BMSCs增殖能力;成骨诱导后7 d、14 d收集细胞,可见光比色法检测碱性磷酸酶(ALP)变化;成骨诱导后24h收集细胞,western blot法检测Rho相关卷曲螺旋形成蛋白激酶1(Rho associated coiled-coil-containing protein kinases1,ROCK1)的表达。结果流式细胞术细胞表面标志检测及成骨、成脂、成软骨三系分化鉴定均证实我们所获细胞为BMSCs。与对照组相比,Y-27632能促进BMSCs增殖,差异具有统计学意义(P0.05);Y-27632能降低ALP表达,差异具有统计学意义(P0.05);Y-27632能明显阻断ROCK1的表达,差异具有统计学意义(P0.05)。结论 Y-27632阻断Rho A/ROCK信号通路可以促进BMSCs增殖,抑制BMSCs成骨分化。     

Smad7在肌腱粘连组织中的表达及对肌腱成纤维细胞纤维化的作用

[目的]通过观察人肌腱粘连组织中Smad7的表达情况,并在TGF-β1诱导的肌腱成纤维细胞(TDFs))中沉默或过表达Smad7,观察细胞纤维化相关指标的变化,讨论Smad7在肌腱粘连中的作用及调控机制。[方法]收集肌腱粘连组织及正常肌腱腱周组织,Western blotting检测Smad7蛋白含量。设计并合成针对Smad7基因编码区的siRNA,同时构建Smad7基因表达载体,经脂质体转染至TDFs细胞,Real Time-PCR检测胞内Smad7基因含量,Western-blot检测细胞中Smad7蛋白表达;使用TGF-β1诱导转染后TDFs细胞,CCK-8检测细胞增殖活性变化,Western blotting检测纤维化相关的蛋白指标。[结果]与正常腱周组织比较,肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少。siRNA及Smad7基因过表达载体转染TDFs,可以明显抑制或者上调细胞内Smad7基因含量及蛋白表达,与未转染组比较,差异均有统计学意义(P0.05);TGF-β1诱导的TDFs细胞,可以明显增强细胞增殖活性(P0.01,vs未诱导组),siRNA转染后,TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标上升的趋势进一步增强,Smad7基因表达载体转染则使得TGF-β1诱导TDFs增殖活性和纤维化蛋白指标增强的趋势得到明显抑制,基因干预且诱导组与只诱导组细胞活性和蛋白含量相比较,差异均有统计学意义(P0.05)。[结论]肌腱粘连组织中Smad7蛋白减少,提示肌腱粘连发生过程中Smad7表达受抑制;Smad7基因过表达可以抑制TGF-β1诱导TDFs细胞纤维化。     

下调HDAC6表达对乳腺癌细胞生物学行为的影响及机制

目的：探讨下调HDAC6表达对乳腺癌MCF-7细胞生物学行为的影响及其分子机制。 方法：分别用HDAC6 siRNA和阴性siRNA转染乳腺癌MCF-7细胞,以未处理的MCF-7细胞为空白对照,分别用RT-PCR和Western blot方法检测细胞HDAC6与p21基因和蛋白的表达,CCK-8试剂盒和流式细胞术分别检测细胞增殖与细胞周期,并用TUNEL法检测细胞凋亡。 结果：干扰效果验证结果显示,HDAC6 siRNA转染能有效降低MCF-7细胞HDAC6 mRNA和蛋白的表达（均P<0.05）,而阴性siRNA无此作用（P>0.05）。与空白对照组比较,HDAC6 siRNA组细胞增殖受到明显抑制,细胞G0/G1期比例增加,S期比例减少,细胞的凋亡率明显增加（均P<0.05）;阴性siRNA组无上述改变（均P>0.05）。HDAC6 siRNA组细胞p21 mRNA与蛋白的表达均较空白对照组和阴性siRNA组明显升高（均P<0.05）。 结论：下调HDAC6的表达能抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖,诱导细胞G0/G1期阻滞,并促进细胞凋亡,其机制可能与升高p21表达有关。     

RhoA/ROCK通路在转化生长因子-β1诱导骨髓基质干细胞向软骨分化中的作用

目的 探讨RhoA／ROCK信号通路在转化生长因子-β1（TGF-β1）体外诱导骨髓基质干细胞（BMSCs）向成软骨细胞表型分化过程中的表达及作用。方法 由小鼠骨髓中分离出BMSCs，体外传代培养，取第3代细胞通过TGF-β1诱导向软骨细胞分化。采用Western-blot和RT-PCR方法分别检测RhoA和ROCK1／2、Ⅱ型胶原在细胞分化过程中的表达及应用Rho激酶抑制剂Y27632后的表达。结果 RhoA和ROCK1／2在分化过程中均有表达。Rho激酶抑制剂Y27632导致诱导后成软骨细胞相关的Ⅱ型胶原表达减少。结论 RhoA／ROCK信号通路可能在BMSCs分化为软骨细胞过程中起着重要调控作用。     

PRRX1在胃癌细胞增殖与转移中的作用及其与TGF-β/Smad2介导的上皮间质转化的关系

背景与目的:上皮间质转化(EMT)在恶性肿瘤进展与转移中发挥着重要的作用,近年来研究显示配对相关同源框1(PRRX1)是促进EMT的重要转录因子。笔者前期研究表明,PRRX1在胃癌中表达增加,并与患者的不良预后密切相关。本研究进一步探讨PRRX1促胃癌细胞增殖、转移与EMT及相关信号通路的关系,为胃癌复发转移的防治提供研究思路。方法:用Western blot法检测人正常胃黏膜细胞GES-1和胃癌细胞SGC7901、MNK45中PRRX1表达。将MNK45细胞分别转染PRRX1过表达慢病毒(PRRX1过表达组)及空载慢病毒(阴性对照组),以无处理的MNK45细胞作为空白对照,用Transwell实验检测细胞的迁移能力,Western blot检测细胞PRRX1、TGF-β1、Smad2及EMT标志物的表达,以及TGF-β/Smad2通路阻断剂SB-431542干预后以上蛋白表达的变化。将8只裸鼠皮随机均分为两组,分别皮下接种转染PRRX1过表达慢病毒的MNK45细胞(PRRX1过表达组)与转染空载慢病毒MNK45细胞(阴性对照组),比较两组裸鼠皮下移植瘤的生长情况。结果:PRRX1在胃癌SGC7901与MNK45细胞中表达均明显高于正常胃黏膜细胞GES-1且在SGC7901细胞中高于MNK45(均P<0.05)。与空白对照组比较,PRRX1过表达组MNK45细胞的迁移能力明显增强,PRRX1、TGF-β1、Smad2、间质标志物vimentin蛋白表达明显增加,而上皮标志物E-cadherin表达明显降低(均P<0.05);阴性对照组MNK45细胞无以上变化(均P>0.05)。用SB-431542处理后,PRRX1过表达组MNK45细胞的PRRX1和TGF-β1表达未受影响(均P>0.05),但Smad2和vimentin表达的升高与E-cadherin表达的降低被明显抑制(均P<0.05)。PRRX1过表达组裸鼠移植瘤的体积生长速度与瘤体质量均明显大于阴性对照组(均P<0.05)。结论:PRRX1过表达能促进胃癌细胞的增殖与转移,机制可能与其诱导TGF-β/Smad2通路活化促进EMT有关。对过表达PRRX1及TGF-β/Smad2 通路的干预可能是胃癌复发转移防治的新途径。     

RhoA/Rho激酶信号通路在TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化中的作用

目的 观察TGF-[1对人皮肤成纤维细胞表型转化的作用是否受到RhoA/Rho激酶信号通路的影响,以探究该通路是否参与了人皮肤成纤维细胞的表型转化。方法 原代培养人皮肤成纤维细胞,将第4代细胞用TGF-β1( 10 ng/ml)刺激后,分不同作用时间(0、3、6、24h)提取细胞内总蛋白。BCA法测定总蛋白浓度,Western -blot检测α-SMA的表达水平;并用相同的方法检测不同浓度TGF-β1(0、2、10、50 ng/ml)刺激人皮肤成纤维细胞后,α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表达水平。用RhoA/Rho激酶信号通路阻断剂Y-27632处理后,再用TGF-β1刺激,作为实验组,将未作处理的正常细胞作为空白对照组,Y-27632（10 μmol/L）组作为阴性对照组,只用TGF-β1( 10 ng/ml)刺激组作为阳性对照组,分别检测α-SMA的表达差异。使用ANOVA对蛋白表达量进行统计学分析,P ＜0.05为差异有统计学意义。结果 10 ng/ml TGF-β1按不同作用时间刺激人皮肤成纤维细胞后,α-SMA的表达量分别为：0h为1.0,3h为1.9+0.2、6h为2.1±0.1,24 h为3.1±0.1。24 h较其他3个时间点α-SMA表达量明显上升（n=4,P＜0.05）。不同浓度TGF-β1刺激人皮肤成纤维细胞后,α-SMA的表达量分别为：0 ng/ml为1.0,2 ng/ml为1.4±0.2,10 ng/ml为3.2±0.1,50 ng/ml为3.1±0.2。10 ng/ml表达量明显高于0 ng/ml和2 ng/ml(n =4,P ＜0.05),较50 ng/ml差异无统计学意义(n=4,P＞0.05)。用Y-27632（10 μmol/L）处理后,再用TGF-β1刺激,细胞的表型转化明显受到抑制,实验组α-SMA的表达量(1.2±0.2)较阳性对照组(2.9±0.1)明显降低(n=5,P ＜0.05),与空白对照组(1.0)和阴性对照组(1.1±0.1)相比差异均无统计学意义(n=5,P＞0.05)。结论 RhoA/Rho激酶信号通路参与了 TGF-β1诱导的人皮肤成纤维细胞表型转化过程。     

骨形成蛋白7重组腺病毒的构建及对TGF-β1诱导的大鼠肾系膜细胞α-SMA表达的影响

目的 构建骨形成蛋白7重组腺病毒(adenovirus bone morphogenetic protein 7.Adeno-BMP-7)及观察其对转化因子-β1(TGF-β1)诱导的大鼠肾系膜细胞(MC)α-SMA表达的影响.方法 构建Adeno-BMP 7并转染(M.O.I=100)大鼠肾系膜细胞,48h后用Western印迹法检测BMP-7蛋白的表达;分空白组.TGF-β1处理组(TGF-β1刺激24h,5ng/ml),Adeno-BMP 7转染组(TGF-β1刺激24h,5ng/ml;Adeno-BMP 7转染M.O.I=100),48h后用RT-PCR方法分别检测各组α-SMA的表达.结果 Western-blot检测示转染骨形成蛋白7重组腺病毒后的大鼠肾系膜细胞可表达BMP-7蛋白;RT-PCR示Adeno-BMP 7转染组α-SMA表达较TGF-β1处理组明显降低(Adeno-BMP 7转染组α-SMA/GAPDH值0.108,TGF-β1处理组α-SMA/GAPDH值0.112,P<0.05).结论 成功构建Adeno-BMP7,其转染能降低由TGF-β1诱导的大鼠肾系膜细胞α-SMA的表达.     

TGF-β1/Smad7信号通路在乳腺癌组织中的表达及与细胞增殖和转移的关系

目的 :探讨TGF-β1/Smad7信号通路在乳腺癌组织中的表达及与细胞增殖、转移的关系。方法:留取67例乳腺癌患者肿瘤及癌旁组织,利用实时荧光定量PCR检测乳腺癌及癌旁组织中TGF-β1和Smad7基因表达,培养人乳腺癌Luminal A型细胞株MCF-7,根据转染处理不同分为TGF-β1 si RNA转染组、阴性对照组和空白对照组,MTT法检测不同转染组细胞增殖能力,Transwell细胞侵袭、迁移实验检测不同转染组细胞侵袭和迁移能力,利用实时荧光定量PCR检测不同转染组细胞中TGF-β1、Smad7和EMT相关基因表达。结果:乳腺癌组织中TGF-β1 m RNA相对表达量高于癌旁组织,而Smad7 m RNA相对表达量则低于癌旁组织,差异有统计学意义(P0.05);MTT检测结果显示,TGF-β1 si RNA转染组细胞48、72和96 h时吸光度值均低于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P0.05);细胞侵袭实验结果显示,TGF-β1 si RNA转染组每高倍视野细胞数均低于阴性对照组和空白对照组(P0.05);细胞迁移实验结果显示,TGF-β1 si RNA转染组每高倍视野细胞数均低于阴性对照组和空白对照组(P0.05);TGF-β1 si RNA转染组细胞中TGF-β1 m RNA、Vimentin m RNA、Snail-2 m RNA和MMP-9 m RNA相对表达量均低于阴性对照组和空白对照组,而Smad7m RNA和E-cadherin m RNA相对表达量均高于阴性对照组和空白对照组,差异有统计学意义(P0.05)。结论:乳腺癌发生与TGF-β1/Smad7信号通路激活有关,特异性抑制TGF-β1可促进Smad7表达而抑制乳腺癌细胞EMT发生,从而抑制肿瘤细胞增殖、侵袭和转移过程。     

let-7a对血管平滑肌细胞迁移、增殖功能调控作用的体外研究

目的:观察let-7a对体外培养血管平滑肌细胞(VSMC)迁移和增殖能力的影响。方法:分离大鼠胸腹主动脉VSMC,并传代培养。将培养的VSMC通过慢病毒表达载体分别转染let-7a模拟物(实验组)及其阴性对照物(阴性对照组),或不做转染处理(空白对照组)。通过绿色荧光蛋白的表达估计转染效率;用real-time PCR检测各组细胞let-7a的表达水平;用细胞划痕试验和CCK-8法分别检测各组细胞的迁移能力及增殖情况。结果:荧光显微镜观察显示,96 h后细胞的转染效率达85%以上;real-time PCR结果显示,实验组VSMC的let-7a表达水平明显高于阴性对照组和空白对照组(均P<0.01);细胞划痕试验与增殖检测结果显示,实验组的细胞迁移数及增殖率明显低于阴性对照组和空白对照组(均P<0.01)。阴性对照组与空白对照组间上述项目无明显差异(均P>0.05)。结论:let-7a对体外培养的VSMC迁移与增殖有抑制作用。     

核因子κB反义寡核苷酸对转化生长因子β1诱导人肾小管上皮细胞转分化的影响

目的 探讨在转化生长因子β1（TGF-β1）诱导下，核因子κB（NF-κB）反义寡核苷酸对体外培养的人肾小管上皮细胞（HK-2）转分化的影响。 方法 采用脂质体介导的方法将NF-κB反义寡核苷酸（AS-ODN）导入细胞，以TGF-β1（10 μg/L）刺激HK-2细胞24 h后，用RT-PCR方法检测细胞中NF-κB mRNA及α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）mRNA表达，用荧光光谱法分析α-SMA蛋白的表达，并以倒置相差显微镜观察细胞转分化过程的形态变化。 结果 TGF-β1诱导24 h后，HK-2细胞中NF-κB mRNA的表达显著上调，为空白对照组的8倍以上（P < 0.01）。NF-κB反义寡核苷酸导入细胞后，可显著抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞的 NF-κB mRNA表达，比TGF-β1组减少75％（P < 0.05），同时，α-SMA mRNA和蛋白表达亦较TGF-β1组均明显下调（P < 0.05）。 结论 NF-κB反义寡核苷酸可抑制TGF-β1诱导肾小管上皮细胞NF-κB的表达，抑制肾小管上皮细胞转分化，可能有利于肾间质纤维化的防治。     

AFAP-1L2对胰腺癌细胞侵袭及转移的影响及机制

目的：探讨AFAP-1L2表达下调对胰腺癌细胞的影响及其机制。 方法：人胰腺癌SW1990细胞分别转染靶向AFAP-1L2的干扰质粒siAFAP-1L2和阴性对照siRNA,以未处理的SW1990细胞为空白对照,检测各组细胞的迁移与侵袭能力,以及肿瘤浸润相关分子的蛋白与mRNA变化;免疫共沉淀法检测AFAP-1L2蛋白与p85α蛋白相互作用关系。 结果：与空白对照SW1990细胞比较,转染siAFAP-1L2下调AFAP-1L2后,SW1990细胞的迁移与侵袭能力明显降低,p85α及α-pAkt表达降低,α-Akt表达升高（均P<0.05）,MMP-9与E-cadherin表达无变化（均P>0.05）;转染阴性对照siRNA的SW1990细胞各项指标无明显变化（均P>0.05）。免疫共沉淀显示,胰腺癌SW1990细胞中AFAP-1L2蛋白与p85α蛋白存在相互作用。 结论：AFAP-1L2可能通过与p85α相互作用调控PI3K/Akt通路,从而影响胰腺癌细胞的迁移及浸润,下调AFAP-1L2表达能抑制胰腺癌细胞迁移与侵袭能力。     

CIP4对转化生长因子β1诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化的影响

目的 观察骨架调节蛋白CIP4（Cdc42 interacting protein 4）对转化生长因子β1（TGF-β1）诱导的人肾小管上皮细胞-间充质转分化（EMT）的影响,并探讨其产生的机制。 方法 10 ?滋g/L TGF-β1刺激72 h诱导人近端肾小管上皮细胞（HK-2细胞）向间充质转分化。Western印迹法检测各组细胞内E-cadherin和α-SMA蛋白的表达。倒置显微镜观察细胞形态的变化。根据GenBank人CIP4的完全cDNA序列,设计1条特异性干扰CIP4表达的RNA片段（CIP4-siRNA）和含野生型CIP4的重组真核表达质粒（pcDNA3.1-hCIP4）,利用lipofactamine 2000将其转染HK-2细胞。Western 印迹法检测对照组、TGF-β1刺激组、CIP4-siRNA转染组、pcDNA3.1-CIP4转染组细胞内CIP4、E-cadherin和α-SMA蛋白的表达,共聚焦显微镜观察 E-cadherin和α-SMA蛋白的分布改变;用PI3K-Akt特异性抑制剂渥曼青霉素（wortmannin） 1 μmol/L干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,Western 印迹法检测对照组和干预组CIP4表达的变化。 结果 TGF-β1干预后HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,细胞形态由典型的上皮细胞向肌成纤维细胞转变,表明TGF-β1诱导肾小管上皮细胞EMT模型成功。CIP4-siRNA抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞表达CIP4后,E-cadherin蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,部分逆转了上述TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT。pcDNA3.1-hCIP4转染使CIP4高表达后,HK-2细胞E-cadherin蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）,α-SMA蛋白表达显著增多（P ＜ 0.05）,诱导了肾小管上皮细胞EMT。用渥曼青霉素干预TGF-β1刺激的HK-2细胞48 h,CIP4可能蛋白表达显著减少（P ＜ 0.05）。 结论 TGF-β1通过PI3K-Akt途径上调CIP4表达,CIP4可能进一步参与TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞EMT过程。     

HMGA2通过Wnt/β-catenin信号通路促进结直肠癌上皮间质转化的研究

目的：研究高迁移率蛋白A2(HMGA2)通过Wnt/β-catenin信号通路促进结直肠癌上皮间质转化（EMT）的影响。方法：采用Real-time PCR法和Western blot法测定正常人结直肠上皮细胞和人结直肠癌HCT116细胞中HMGA2表达水平；将HCT166细胞转染GV144-HMGA2质粒过表达HMGA2后，测定过表达HMGA2对HCT166细胞活力、凋亡及迁移的影响；转染GV144-HMGA2质粒6 h后，加入重组转化生长因子（TGF）-β1蛋白继续培养48 h，测定EMT标志物和细胞周期蛋白（cyclin）D1表达水平。HCT166细胞中分别加入Wnt/β-catenin信号通路的激活剂（Li Cl）和抑制剂（XAV93920），并加入TGF-β1和过表达的HMGA2，检测EMT标志物和cyclin D1表达水平。结果：HCT166细胞中HMGA2表达水平显著高于FHC细胞（P<0.05）；过表达HMGA2可以显著增加HCT166的细胞活力和迁移，降低细胞凋亡（P<0.05）;HMGA2可以显著降低E-caderin表达水平，降低TGF-β1诱导的cy...