靶向人乳腺癌HPSE基因的shRNA慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的：应用RNA干扰技术构建HPSE shRNA重组慢病毒载体,并筛选出最显著抑制HPSE表达的shRNA干扰序列。方法：体外化学合成针对HPSE基因的siRNA序列,在慢病毒载体介导下转染MDA-MB-231细胞,实时定量PCR检测HPSE mRNA表达水平。结果：HPSE shRNA转染MDA-MB-231细胞72 h后,RT-PCR结果表明：所设计的siRNA1组、siRNA4组针对不同靶点的shRNA与对照组相比均可有效抑制HPSE的表达,且成功筛选出最有效抑制HPSE表达的shRNA4序列（P〈0.05）。结论：成功构建了HPSE shRNA重组慢病毒载体,其转染乳腺癌MDA-MB-231细胞后显著抑制了HPSE的表达,为进一步探讨乳腺癌的侵袭转移机制及肿瘤的基因治疗提供了实验基础。     

长链非编码RNA RP1-85F18.6在乳腺癌细胞中的表达及其对增殖和细胞周期的影响

背景与目的:近年来,大量研究表明长链非编码RNA(lncRNA)在肿瘤发生、发展中起着重要作用。lncRNA RP1-85F18.6是新近发现的非编码RNA,其在结肠癌组织和细胞系中高表达,并可促进肿瘤细胞增殖和侵袭,抑制凋亡及调控细胞周期。然而,目前尚无lncRNA RP1-85F18.6在乳腺癌中的研究报道,因此,本研究初步探讨lncRNA RP1-85F18.6在乳腺癌细胞中的表达及其对增殖和细胞周期的影响。方法:qRT-PCR法检测lncRNA RP1-85F18.6在乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MBA-MD-468、MCF-7 及正常乳腺细胞系MCF-10A中的表达。将MDA-MB-231细胞分别转染RP1-85F18.6沉默序列(沉默组)与阴性对照序列(阴性对照组),将无处理的MDA-MB-231细胞作为空白对照组,在各组细胞中采用MTT法测定增殖能力,PI染色流式细胞仪检测法测定细胞周期,Western blot法测定Ki-67、增殖细胞核抗原(PCNA)、cyclin A1和p21~(C1P1)蛋白的表达。结果:乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MBA-MD-468及MCF-7中lncRNA RP1-85F18.6相对表达量均高于正常乳腺上皮细胞系MCF-10A(均P0.05)。沉默组在转染后24、48、72、96 h的OD_(490) _(nm)值均明显低于空白对照组(均P0.05)。与空白对照组比较,沉默组的G_1/G_0期细胞比例无明显变化(P0.05),但S期细胞比例明显升高、G_2/M期细胞比例明显降低(均P0.05);沉默组Ki67﹑PCNA及cyclin A1蛋白表达量明显下调,而p21~(C1P1)蛋白表达量明显上调(均P0.05)。阴性对照组与空白对照组间以上指标差异均无统计学意义(均P0.05)。结论:lncRNA RP1-85F18.6在乳腺癌细胞系中高表达,其可能通过调节增殖相关蛋白及细胞周期蛋白的表达而参与乳腺癌的发生与发展,对lncRNA RP1-85F18.6及其相关靶基因的干预可能为乳腺癌的治疗提供新的途径。     

泛素蛋白连接酶E3A在乳腺癌细胞中作用的蛋白质组学与生物信息学分析

目的:通过蛋白质组学与生物信息学方法探讨泛素蛋白连接酶E3A(UBE3A)在乳腺癌细胞中的生物学功能。方法:将三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231分别转染shRNA-UBE3A片段(UBE3A敲低组)与阴性对照shRNA片段(对照组)后,采用双向电泳(2-DE)法及基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF-MS/MS)对两组细胞的差异蛋白质分离和鉴定;采用DAVID Functional Annotation及String在线工具对差异表达蛋白质进行生物信息学分析。结果:2-DE及MALDI-TOF-TOF-MS/MS分离和鉴定出28个差异蛋白,其中UBE3A敲低组相对于对照组有4个表达上调,24个表达下调。与DAVID数据库有23个相匹配,其中能够进行生物学途径、细胞成分、分子功能注释分类的蛋白质分别为23个(100%)、20个(87.7%)和23个(100%),而在泛素-蛋白酶体系统及糖代谢方面分类比较明确;String分析显示这些差异蛋白中有23个存在直接或间接的联系。结论:UBE3A可能通过泛素-蛋白酶体系统功能与糖代谢途径参与乳腺癌细胞生物学行为的调控。     

Osteopontin RNAi对人乳腺癌细胞MDA-MB-231生物学行为的影响

目的 观察乳腺癌细胞MDA-MB-231 osteopontin (OPN) RNA靶向干扰效果.方法 采用OPN mRNA干扰质粒转染MDA-MB-231细胞,建立OPN基因沉默细胞株,采用RT-PCR、蛋白质印迹法从mRNA和蛋白水平检测乳腺癌细胞OPN表达量的变化,侵袭试验检测OPN下调对细胞侵袭能力的影响,MTT法测细胞增殖能力的改变,裸鼠成瘤后观察OPN RNA干扰对肿瘤细胞生长的影响及对移植瘤乏氧程度的影响.结果 与MDA-MB-231细胞相比,OPN沉默细胞在常氧和乏氧状态下OPN表达均显著下调(均P＜0.05),OPN稳定沉默细胞侵袭力和增殖能力下降(均P＜0.01),OPN RNAi能明显抑制裸鼠移植瘤的生长(P＜0.05),且移植瘤内乏氧程度降低(P＜0.05).结论 OPN RNA干扰可抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞侵袭力和增殖能力,降低移植瘤的乏氧程度.     

反义RNA抑制Ezrin表达对乳腺癌细胞侵袭能力的影响

目的 观察特异性阻断Ezrin的表达对人乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的增殖和侵袭能力的影响.方法 将anti-pCR3.1-Ezrin质粒经脂质体介导,转染人人乳腺癌细胞MDA-MB-231 6、12和24 h,应用Western blot和逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测Ezrin的表达变化情况;转染质粒24h后,噻唑蓝(MTT)比色法检测抑制Ezrin对MDA-MB-231和MCF-7细胞体外增殖能力的影响,Boyden小室法检测抑制Ezrin对MDA-MB-231和MCF-7细胞体外侵袭能力的影响.结果 转染anti-pCR3.1-Ezrin后,对MDA-MB-231细胞中的Ezrin表达抑制在24 h时达高峰.MTT法比色实验结果显示,MDA-MB-231和MCF-7细胞中转染anti-pCR3.1-Ezrin组、转染空质粒组和对照组的A值分别为0.410±0.018、0.765±0.058、0.795±0.061和0.480±0.021、0.632±0.052、0.648±0.059.转染anti-pCR3.1-Ezrin组细胞的增殖受到明显抑制,抑制率分别为(47.9±3.1)%和(32.0±2.8)%(P<0.05).Boyden小室法检测结果显示,MDA-MB-231和MCF-7细胞中转染anti-pCR3.1-Ezrin组细胞的侵袭能力分别为对照组的(50.5±3.2)%和(74.8±4.6)%(P<0.05).结论 Ezrin在乳腺癌的生长和侵袭过程中发挥重要作用.     

小干扰RNA下调Notch-1基因的表达对三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞生物学功能的影响

目的 观察Notch-1信号通路在三阴性乳腺癌(TNBC)细胞MDA-MB-231增殖中的作用,并探讨其分子机制.方法 运用小干扰RNA(siRNA)转染技术,下调MDA-MB-231细胞中Notch-1 mRNA表达,应用噻唑蓝(MTT)比色法检测干扰后5d的细胞增殖,并用流式细胞术检测干扰48 h后细胞增殖、凋亡及细胞周期的变化.另外应用实时定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot法检测siRNA转染前后Notch-1、细胞周期素D1( Cyclin D1)、B细胞淋巴瘤/白血病-2基因(bcl-2)、bcl-XL mRNA变化及细胞核中核因子(NF)-κB蛋白的变化.结果 N0tch-1 siRNA可有效降低细胞中Notch-1 mRNA表达;转染后细胞增殖能力明显受到抑制,第5天的抑制率达到44.7％,细胞凋亡率由3.67％增加到13.25％,细胞周期G2期由6.27％增加到14.28％.进一步研究结果显示siRNA介导的Notch-1下调,可使细胞核内NF-κB蛋白表达降低,细胞中Cyclin D1、bcl-2、bcl-XL mRNA 表达下调.结论 Notch-1信号通路在TNBC中发挥重要作用,siRNA下调Notch-1可有效抑制MDA-MB-231细胞增殖,Notch-1是TNBC潜在的新治疗靶点.     

泛素特异性蛋白酶5调控三阴性乳腺癌迁移及增殖的机制

目的探索三阴性乳腺癌(TNBC)细胞中USP5的表达及其对细胞生物学行为的影响。方法采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测USP5在TNBC细胞MDA-MB-231和BT-549细胞中的表达。通过转染慢病毒(shRNA)敲低USP5的表达。采用免疫共沉淀(CO-IP)实验验证USP5对活化C激酶1受体(RACK1)泛素化水平的影响。采用细胞计数试剂盒(CCK-8)增殖实验检测细胞增殖能力, Transwell检测细胞迁移能力的变化。两组之间的比较采用独立样本t检验。结果 MDA-MB-231细胞和BT-549细胞中USP5的表达(3.167±1.102, 4.700±1.609), 明显高于正常乳腺细胞系MCF-10A(1.000±0.300), 差异有统计学意义(t=3.287、3.915, P<0.05)。在USP5稳定敲低的细胞系中USP5蛋白的表达(MDA-MB-231:0.160±0.012;BT-549:0.190±0.028)显著低于阴性对照细胞(MDA-MB-231:1.000±0.179;BT-549:1....     

MicroRNA 101对乳腺癌细胞运动和迁移能力的影响

目的:探讨microRNA 101(miR-101)的表达对乳腺癌细胞增殖、运动和迁移能力的影响,并初步分析miR-101影响乳腺癌细胞生物学行为的可能机制。方法:采用实时荧光定量PCR的方法检测miR-101在乳腺癌组织及乳腺癌细胞中的表达情况,再用脂质体介导转染的方法将miR-101模拟物及阴性对照转染人乳腺癌细胞株MDA-MB-231,通过细胞增殖实验(CCK8方法 )、划痕实验和Transwell迁移实验检测细胞的增殖、运动、迁移能力。通过Western印迹方法分析miR-101发挥功能的可能机制。结果:与正常乳腺上皮细胞或癌旁组织相比,miR-101在乳腺癌细胞或乳腺癌组织中表达降低。体外增殖实验显示,过表达miR-101对乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖无明显影响,但是能显著抑制细胞的运动和迁移能力(P<0.001)。Western印迹实验显示在外源性过表达miR-101模拟物的MDA-MB-231细胞中,EZH2的表达明显下降,而E-钙黏蛋白的表达升高。结论:miR-101的表达在乳腺癌组织和细胞中发生了下调。miR-101抑制乳腺癌细胞运动和迁移能力可能是通过靶向抑制EZH2,间接上调E-钙黏蛋白来实现。     

肝素酶基因siRNA表达载体的构建及序列鉴定

目的 根据基因库中的人肝素酶基因序列,构建针对肝素酶(HPSE)基因的小干扰RNA(siRNA)及其表达载体,转染MDA-MB-231细胞后观察其对HPSE基因的干扰作用.方法 设计HPSE靶向的发夹状siBNA,退火后连接人pGPU6/GFP/Neo载体,转化后进行序列鉴定,脂质体转染MDA-MB-231细胞株,并进行荧光摄像,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞的生长抑制率.结果 设计出3条针对HPSE的siRNA,将退火后的双链寡核苷酸片段连接到pGPU6/GFP/Neo载体,测序结果正确.转染MDA-MB-231细胞后,MTT法显示重组质粒转染组乳腺癌细胞的生长均受到了抑制,抑制率分别为58.25±3.42、43.70±2.44、39.40±2.38,比较空白对照组4.48±2.28明显升高(P＜0.05).结论 成功构建针对HPSE基因的siRNA载体,转染MDA-MB-231细胞后,细胞的增殖能力减弱.     

构建RNA干扰真核表达载体靶向抑制乳腺癌细胞株MDA-MB-231内的VEGF-C表达之研究

目的:通过构建RNA干扰真核表达载体人乳腺癌细胞株MDA-MB-231内VEGF-C后的生物学变化。方法:构建pGCsi-VEGF-C真核表达载体,建立VEGF-C稳定低表达的MDA-MB-231人乳腺癌细胞株,检测该细胞株的体外增殖和侵袭能力及体内移植瘤生长和淋巴结转移的变化。结果:成功构建了pGCsi-VEGF-C真核表达载体,沉默效率达90%;筛选并获得VEGF-C稳定低表达的MDA-MB-231细胞株,该细胞株的体外增殖及侵袭能力,分别下降40%和35%,体内移植瘤的生长减慢和癌细胞淋巴结转移数量明显下降(P0.05)。结论:VEGF-C的表达量下降可显著降低MDA-MB-231细胞株的增殖、侵袭及淋巴结转移能力。     

环状RNA FBXW7在三阴乳腺癌中的表达及其临床意义

背景与目的：环状RNA（circRNA）是参与多种癌症进程的重要调节因子。据报道,环状RNA FBXW7（circFBXW7）在胶质瘤中通过编码一种新蛋白发挥抑癌作用。然而,其在三阴性乳腺癌（TNBC）中的功能和机制尚不明确。本研究探讨了circFBXW7在TNBC中的作用及其临床意义。 方法：收集240例TNBC患者的新鲜癌组织及临床资料,通过qRT-PCR检测癌组织中circFBXW7的表达,用Kaplan-Meier法分析TNBC患者circFBXW7表达水平与预后的关系,并用Cox回归方法分析TNBC患者的预后因素。用CCK8实验、Transwell实验、qRT-PCR观察TNBC细胞株MDA-MB-231和HCC1806过表达circFBXW7后增殖与迁移、侵袭能力以及miR-197-3p表达的变化,在上述两种细胞中,敲除circFBXW7并转染miR-197-3p抑制剂后,用Transwell实验与克隆形成实验分析增殖与侵袭能力的变化。 结果：240例TNBC患者癌组织标本中circFBXW7的平均表达水平为1.043±0.268,以1.043为临界值分组生存分析显示,circFBXW7低表达患者的总生存期和无病生存期明显短于circFBXW7高表达患者（均P<0.05）;circFBXW7表达以及组织学分级、TNM分期为TNBC患者预后的独立影响因素（均P<0.05）。细胞实验显示,过表达circFBXW7后,MDA-MB-231和HCC1806细胞的增殖、迁移与侵袭能力以及miR-197-3p表达均明显降低（均P<0.05）;共转染miR-197-3p抑制剂可逆转由于敲除circFBXW7所致的MDA-MB-231和HCC1806细胞的增殖与侵袭能力的增强（均P<0.05）。 结论：circFBXW7的表达在TNBC中发挥抑癌作用,机制可能与其竞争性吸附miR-197-3p,从而抑制TNBC细胞的增殖与侵袭有关,FBXW7可能是一种新型TNBC预后生物标志物及潜在治疗靶标。     

人白介素-8 shRNA慢病毒载体的构建和鉴定

目的:构建携载人白介素-8(IL-8)shRNA的慢病毒并鉴定其对MDA-MB-231细胞该基因的沉默效率。方法:设计两个IL-8基因特异性siRNA靶点,与pMagic7.1慢病毒载体质粒重组,经PCR鉴定并测序,通过293T细胞实现慢病毒包装,DNA定量试剂盒分别检测两种慢病毒滴度。将这两种慢病毒分别以最佳感染复数感染MDA-MB-231细胞,通过Real-time PCR检测IL-8沉默效率。结果:PCR鉴定阳性的shRNA重组质粒测序正确,包装后两种病毒滴度分别为1.93×109 IU/mL和1.89×109IU/mL;分别以MOI=40感染MDA-MB-231细胞后,IL-8沉默效率分别为80%和90%。结论:成功构建IL-8 shRNA慢病毒并达到较高的沉默效率,为下一步研究沉默靶基因后细胞生物学功能变化提供实验基础。     

靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒的构建及鉴定

目的：构建靶向化学趋化因子受体1（CXCR1）的短发夹小干扰RNA（shRNA）质粒表达载体。方法：针对人CXCR1基因的mRNA序列,按RNA干扰靶位点的设计原则,设计并构建靶向CXCR1基因的3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经酶切和测序确认构建成功后,转染胃癌细胞MKN45,RT-PCR和Western blot检测CXCR1 mRNA和蛋白的表达。结果：经酶切和测序证实,3个靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒均构建成功;与未转染和转染阴性对照质粒的MKN45细胞比较,转染3种shRNA质粒的MKN45细胞,CXCR1 mRNA和蛋白水平均明显下调（均P<0.05）。结论：靶向CXCR1基因的shRNA真核表达质粒的成功构建,为进一步研究CXCR1在胃癌中的功能和实验性靶向治疗提供了初步的基础。

     

Biological Effects of Lentivirus-Mediated shRNA Targeting Collagen Type I on the Mesangial Cells of Rats

Aim: To investigate the effects of lentivirus-mediated shRNA targeting collagen type I on the mesangial cells of rats and the feasibility of lentivirus-mediated shRNA delivery through renal parenchyma injection. Methods: Anti-collagen type I shRNA lentiviral vector was constructed, and rat mesangial cells were transfected with transfection enhancer (control group), blank lentiviral vectors (pSC-GFP group), and pSC-GFP/Col I lentiviral vectors (pSC-GFP/Col I group). Transfection efficiency and cell cycle were determined by flow cytometry. RT-PCR and Western blot were performed to detect the mRNA and protein expressions of Col I. Cell proliferation was evaluated by 3-(4,5)-dimethylthiahiazo-3, 5-di-phenytetrazolium-romide (MTT) assay and direct counting, and apoptosis was detected using AnnexinV/PE staining. The feasibility of renal parenchyma injection of lentiviral vectors was assessed. Results: The transfection efficiency was 75.42%. The expressions of collagen type I in pSC-GFP/Col I group was markedly decreased when compared with the other two groups. PSC-GFP/Col I group was higher than pSC-GFP group in the inhibition efficiency of mesangial cell after transfection. Results revealed that pSC-GFP/Col I transfection induced apoptosis to a certain extent. The proportion of cells in G2/M phase in pSC-GFP/Col I group and pSC-GFP group was higher than that in control group after of transfection. Moreover, cells arrested in S phase were markedly increased. Our results also revealed renal injection of lentivirus-mediated shRNA was feasible. Conclusion: Lentivirus-mediated shRNA targeting collagen type I could stably and efficiently transfect rat mesangial cells and significantly suppressed collagen type I expressions with acceptable safety. Renal injection of Col I lentivirus-mediated shRNA was also feasible.     

携Jagged 2基因siRNA慢病毒表达载体的构建及其转染对胰腺癌细胞影响

目的:构建携带Jagged 2(JAG2)基因siRNA的慢病毒表达载体,并观察其转染人胰腺癌细胞生物学特性的影响。方法:采用基因重组技术构建若干携JAG2基因siRNA片段的慢病毒表达载体,将其转染经酶解法从胰腺癌组织标本中原代分离的胰腺癌细胞;选择对JAG2基因抑制效率最高的siRNA片段,通过MTT法、流式细胞术、Transwell小室实验观察其转染对原代胰腺癌细胞生长、凋亡、细胞周期及侵袭转移能力的影响。结果:所构建的携JAG2基因siRNA片段的慢病毒表达载体均能不同程度降低原代胰腺癌细胞JAG2 mRNA与蛋白的表达。JAG2 siRNA转染后,胰腺癌细胞的增殖明显降低、凋亡与S期阻滞明显增强、侵袭转移能力明显减弱(均P0.05)。结论:成功构建携JAG2基因siRNA慢病毒表达载体,其转染能有效削弱人胰腺癌细胞的恶性生物学特征。     

microRNA let-7a对胆管癌细胞凋亡和周期的影响

目的:探讨microRNA(miRNA) let-7a在胆管癌组织中的表达及其意义.方法:用Real-time PCR检测let-7a在胆管癌与正常胆管组织中的表达;将胆管癌HuCCT-1细胞分为let-7a过表达组(转染let-7a mimics),阴性对照组(转染阴性对照序列)和空白对照组(无转染),分别用Real-time PCR和流式细胞仪检测各组细胞let-7a的表达,细胞凋亡和周期情况.结果:let-7a在胆管癌组织中表达较正常胆管组织明显下调(P＜0.01);与空白对照组比较,let-7a过表达组HuCCT-1细胞的let-7a表达明显升高,细胞凋亡率明显增加(均P＜0.01),而阴性对照组与空白对照组间无统计学差异(均P＞0.05);各组间细胞周期差异无统计学意义(P＞0.05).结论:胆管癌组织中let-7a表达下调,let-7a表达下调抑制了细胞凋亡,从而可能在促进胆管癌发生与发展中起了重要作用.