不同冻干保护体系对海藻糖负载红细胞冻干保存影响的研究

本研究旨在评价冻干保护剂人血白蛋白、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮和甘油对海藻糖负载后红细胞冰冻干燥保存的影响,筛选最佳冻干保护体系。将浓缩红细胞在37℃,浓度为800 mmol/L的海藻糖溶液中孵育7 h,经PBS液冲洗3遍后制成海藻糖负载的浓缩红细胞。对照组为海藻糖负载红细胞不添加保护剂,直接冻干;实验组将人血白蛋白、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、甘油等组成的冻干保护体系与海藻糖负载浓缩红细胞混合,两组样品在常温下平衡30 min,移入-80℃深低温冰箱,预冻24 h,入冻干机冻干处理24 h。用温度为37℃,6%羟乙基淀粉40注射液快速再水化样品,用氰化血红蛋白试剂盒测定血红蛋白溶血率,计算血红蛋白回收率,同时测定干燥样品含水量。结果表明：当样品含水量在3%-4%时,对照组冻干红细胞血红蛋白回收率为（33.57±2.89）%,白蛋白组血红蛋白回收率为（51.15±1.98）%,差异有显著性意义（P〈0.05）。选用不同浓度的葡聚糖为冻干保护剂,血红蛋白回收率较对照组明显降低,随浓度增加,血红蛋白回收率逐渐升高,当浓度为36%时,血红蛋白回收率为（22.15±4.12）%,差异有显著性意义（P〈0.05）。不同浓度的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）组成的冻干保护体系,当浓度小于40%时,血红蛋白回收率明显低于对照组,差异有显著性意义（P〈0.05）。10%甘油组血红蛋白回收率为（3.93±1.80）%,差异有显著性意义（P〈0.05）。结论：人血白蛋白在海藻糖负载的冻干红细胞中发挥重要保护作用,葡聚糖与浓度小于40%PVP可削弱细胞内海藻糖的保护作用。液态的甘油不宜作为红细胞冰冻干燥保存的保护剂。     

甘油含量对冷冻干燥保存红细胞的作用

目的分析甘油含量对冷冻干燥保存红细胞的作用。方法应用不同浓度甘油（5%、10%、20%、30%和40%）作为红细胞冷冻干燥保存的保护剂,研究冷冻干燥红细胞复水后红细胞形态以及复水后完整红细胞回收情况。结果甘油预处理的红细胞冷冻干燥后复水红细胞结构完整、形态正常,尤以40%甘油最佳,复水后红细胞回收率最高。结论研究为使用甘油作红细胞冻干保存的保护剂提供了初步的理论依据。     

细胞内外海藻糖对红细胞冰冻干燥保存的影响

目的研究细胞内海藻糖对红细胞冻干保存后血红蛋白回收率及ATP水平影响。在一定条件下负载红细胞,细胞内海藻糖浓度保持恒定,研究细胞外不同浓度的海藻糖对红细胞冰冻干燥保存的影响。方法将浓缩红细胞在37℃,浓度为800 mmol的海藻糖溶液中孵育7 h,制成海藻糖负载的浓缩红细胞,对照组为PBS负载浓缩红细胞,行冻干保存,测定Hb回收率及细胞内ATP水平。将PBS液、浓度为50 mmol、200 mmol、400 mmol的海藻糖溶液与海藻糖负载浓缩红细胞按1∶1比例混匀,行冻干保存及再水化,用氰化血红蛋白试剂盒测定Hb溶血率,计算Hb回收率。结果经海藻糖负载的红细胞冻干保存,Hb回收率(44.46±5.15)%,细胞内ATP水平(1.91±0.33)μmol/gHb,对照组Hb回收率(7.71±2.71)%,细胞内ATP水平(0.88±0.25)μmol/gHb。2组相比较,P0.05,差异有统计学意义。细胞外PBS液组Hb回收率为(10.36±0.97)%,50 mmol海藻糖组,Hb回收率为(33.57±2.89)%,200 mmol海藻糖组,Hb回收率为(38.64±0.54)%,400 mmol海藻糖组,Hb回收率为(18.10±1.9)%。对照组PBS液组与50 mmol组、200 mmol组、40 0mmol组分别比较,差异有统计学意义。400 mmol组与200 mmol组、5 0 mmol组分别比较,差异有统计学意义(P0.01)。200 mmol组与50 mmol组相比较,差异无统计学意义。结论细胞内的海藻糖大大提高冻干红细胞Hb回收率且可保持冻干红细胞正常ATP水平。细胞外的海藻糖对红细胞冻干保存有保护作用,随着细胞外液中海藻糖浓度增加,冻干红细胞Hb回收率减少。     

血液细胞冷冻干燥保存的研究进展

血液细胞的冷冻干燥保存与传统的常温保存和低温保存相比，具有储存期限长、储存运输方便、输注安全等优点。本文从血液细胞冷冻干燥保存的细胞学基础，血小板、红细胞、脐带血冷冻干燥保存的现状，发展血液细胞冷冻干燥保存技术需要解决的关键问题等几个方面进行综述。     

预冻温度和冻干机搁板温度对冷冻干燥红细胞的影响

为研究预冻温度和冷冻干燥机 (冻干机 )搁板温度对红细胞冻干保存后回收率的影响 ,采用主要成分为7%二甲亚砜和 4 0 %聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)的缓冲液作为保护液 ,在不同预冻温度或搁板温度下进行红细胞的冻干保存。首先将新鲜血液离心、洗涤和平衡以制备浓集红细胞 ,然后将浓集红细胞和保护液按 1∶3混匀制备红细胞悬液 ,在不同温度 (- 2 0 ,- 35 ,- 4 5 ,- 80或 - 196℃ )下预冻后移入冻干机 (搁板温度设为 - 35℃ ,抽真空压力为2 0 0mbar)内进行真空干燥。为研究冻干机搁板温度对冻干红细胞的影响 ,将上述红细胞悬液先在 - 80℃下预冻后移入冻干机 ,在不同的搁板温度 (- 2 0 ,- 2 5 ,- 30 ,- 35 ,- 4 0或 - 4 5℃ )下抽真空干燥 ,冻干结束后用 37℃的再水化液快速水化。结果表明 :在不同预冻温度下 ,冻干后红细胞和血红蛋白的回收率均在 85 %和 75 %以上 ,各组之间差异不显著。但 - 196℃组上清游离血红蛋白浓度显著高于其他各组 (P <0 .0 1) ;当搁板温度等于或高于- 2 5℃时 ,样品无法冻干 ;当搁板温度等于或低于 - 30℃时 ,随着搁板温度的降低 ,冻干时间相应延长。再水化后红细胞和血红蛋白回收率均在 90 %以上 ,各组之间差异不显著 ;但当洗涤至等渗时 ,4组血红蛋白回收率之间差异不显著。结论 :本冻     

保存液添加氨基酸对试剂红细胞保存时间的影响

目的延长试剂红细胞在开放状态下的保存时间。方法在实验组红细胞保存液CPDA-Ⅰ中加入5%氨基酸,对照组仅为CPDA-Ⅰ保存液,并分别配制成5%的试剂红细胞,置4℃冰箱,连续观察18周:每周测定2组试剂红细胞的pH、Hb及K+的值。结果实验组在保存126 d后红细胞出现溶血,pH为(6.7±0.4)、Hb为0、K+为(1.16±0.04)mmol/L;而对照组仅保存28 d后红细胞出现溶血,pH为(6.6±0.2)、Hb为(4.8±1.0)g/L、K+为(1.24±0.12)mmol/L,2组只有Hb的差异有统计学意义(P<0.05)。结论在CPDA-Ⅰ中加入5%氨基酸可延长试剂红细胞的保存时间。     

海藻糖负载红细胞及其冻干保存研究

为了研究海藻糖负载红细胞方法的可行性及红细胞内海藻糖对冻干红细胞的影响,利用红细胞膜在37℃时细胞膜上部分脂质由固态变为液态、流动性增大和膜通透性增加的性质,将红细胞置于高浓度海藻糖负载液中孵育7小时,并以磷酸缓冲盐溶液中孵育的红细胞作为对照,对红细胞的海藻糖负载率、形态学、渗透脆性、变形性、ATP含量及2,3-DPG含量进行评价。结果表明:负载后红细胞内海藻糖含量为36.56±7.95mmol/L,实验组红细胞溶血率为(15.663±3.848)%,对照组红细胞溶血率为(5.03±1.85)%,差异显著(P<0.05);实验组红细胞变形指数是0.0289±0.00738,对照组红细胞变形指数是0.1200±0.0121,差异显著(P<0.05);负载后实验组红细胞内ATP含量为2.67±0.54μmol/gHb,对照组红细胞内ATP含量为5.22±1.10μmol/gHb(P>0.05),实验组红细胞渗透脆性降低,明显低于对照组。尽管负载组的红细胞大小不一,形态各异,但在透射电镜下绝大多数红细胞膜完整,胞内血红蛋白密度均匀,而对照组有近一半的细胞膜不完整并有漏孔,胞内血红蛋白密度变浅。实验组与对照组中2,3-DPG含量均为零。实验组红细胞冻干再水化后,血红蛋白回收率46.44±4.14%,对照组血红蛋白回收率8.33±2.34%,差异显著(P<0.001)。结论:海藻糖负载的红细胞功能符合输注标准,负载方法可行,负载入细胞内的海藻糖能够保持细胞膜的完整性,大大提高了冻干红细胞的回收率,为红细胞的冷冻干燥成功迈出了第一步。     

冷冻干燥保存血小板的研究进展

血小板是血液中的一种重要组成成分,它主要参与血栓形成和凝血过程.在大量失血和化疗、放疗等处理后造成的血小板减少症患者的治疗过程中,需要进行血小板输注.因此,保证足够的血小板贮备和供应显得尤为重要.目前,临床应用血小板存在供应不足和浪费问题,主要是血小板保存技术在方法学上的局限性所造成的.血小板的保存方式有以下三种:①常温(22±2℃)保存,此条件下保存的血小板由于部分活性的丧失和微生物的污染,根据美国药品监督管理局规定最多只能保存5天;②冰冻保存,这种保存方法可以大大延长血小板的保存时间,临床实验证明冻-融血小板聚集功能仅为新鲜血小板的50%～60%,而且需要笨重的冰箱和存储设备;③冷冻干燥保存,冷冻干燥血小板可以在常温下长时间保存,不需要冷冻存储设备.在此,本文对冷冻干燥保存血小板(简称冻干血小板)进行综述.     

再水化液因素对冰冻干燥保存后红细胞回收率的影响

目的　寻求一种能有效提高冰冻干燥 (简称冻干 )保存后人红细胞回收率的再水化体系。方法　测定1 0 %聚乙烯吡咯烷酮 (PVP)、6 %羟乙淀粉 (HES)、5 %羧甲基淀粉钠 (CMS)、生理盐水、0 75mol/L葡萄糖、等渗缓冲液及高渗缓冲液 (5×Buffer)的晶体渗透压和胶体渗透压 ;将浓缩红细胞和保护液混匀 ,预冻后移入冻干机内作冻干处理 ,冻干完毕后 ,用不同种类或不同温度的再水化液快速水化洗涤样本。结果　人红细胞冻干再水化后 ,6 %HES组、1 0 %PVP组和 5 %CMS组的红细胞回收率分别为 (93.6 5± 6 .1 8) %、(88.80± 9.4 9) %和 (91 .34± 8.1 3) % ,血红蛋白回收率分别为 (93.4 8± 4 .6 7) %、(89.0 2± 4 .6 7) %和 (88.79± 5 .35 ) % ,均极显著高于其他 4组[(1 5 .5 6± 1 2 .0 2 ) %～ (2 7.77± 6 .4 8) % ,(1 7.78± 1 0 .80 ) %～ (4 1 .5 0± 6 .4 3) % ) ](P <0 .0 1 ) ;不同温度的 6 %HES的再水化效果表明 ,再水化后 3个温度组的红细胞回收率无显著差异 ,但 37℃和 2 5℃组的血红蛋白回收率分别为(87.4 8± 5 .84 ) %和 (91 .37± 3.94 ) % ,均极显著高于 4℃组 (73.1 0± 5 .90 ) % (P <0 .0 1 )而且上清游离血红蛋白浓度也显著低于 4℃组。结论　再水化液的胶体渗透压对冻干保存后红细胞的保护作     

海藻糖负载对人红细胞冷冻干燥保存影响的实验研究

目的初步探讨红细胞冻干长期保存的有效方法,并比较冻干前海藻糖的负载与否对红细胞冻干保存效果的影响。方法实验设实验组(负载海藻糖冻干-复水后红细胞):37℃,红细胞负载海藻糖7h后,采用主要成分为含有15%聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和150mmol/L,海藻糖的缓冲液作为保护液,在设定的降温程序下冻干保存红细胞;对照组:未负载海藻糖冻干-复水后红细胞。冻干结束后用37℃的再水化液快速水化,检测2组的各项理化指标。结果实验组红细胞冻干再水化后RBC和Hb回收率要高于对照组(P<0.05);ATP酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢镁(G-6-PD)活性水平显著差异有统计学意义(P<0.05))。结论胞内海藻糖对红细胞冻干具有明显的保护作用,红细胞在37℃孵育7h的条件负载海藻糖后冻干-复水后能保持细胞的理化稳定性。     

生物膜的保护剂海藻糖在冻干红细胞中的应用

海藻糖作为一种稳定的非还原性双糖，在细胞冷冻、干燥、冻干过程中对细胞活性有着良好的保护作用并已广泛应用于人血细胞的冻干．海藻糖以其异常的水合能力、独特的玻璃化转换和晶体转变行为及抗高温潮湿的特性受到密切关注，并成为细胞保存研究中首选的一种保护剂。海藻糖对细胞的保护机制、海藻糖导入哺乳细胞的实验方法以及红细胞对海藻糖负载的可能作用机制部是近几年细胞保存研究的热点，本文就以上几方面的进展详细进行论述.     

人红细胞对糖类摄取的规律性研究

人红细胞冰冻干燥保存在临床应用中具有重要意义.一些糖类,特别是海藻糖,能提高一些低等生物或细胞对干燥环境的耐受性,但如何将糖类导入细胞内又是一个挑战.本研究探讨人红细胞对糖类摄取的规律性.于不同温度（4、25和37℃）、不同浓度（0、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mol/L）及不同培育时间（1、3、5、7、9小时）条件下检测了红细胞对海藻糖和葡萄糖的吸收率及游离血红蛋白量,并测定了红细胞变性指数.结果表明：随着温度的上升和细胞外糖浓度的增加,红细胞的糖吸收率也随之上升,细胞内的海藻糖和葡萄糖浓度分别可以达到30 mmnol/L和40 mmol/L以上.但孵育时间对海藻糖和葡萄糖的吸收率影响不同,随着时间的延长,细胞内海藻糖浓度呈先升高而后降低的趋势,而葡萄糖吸收率则呈稳定上升的趋势.但是糖吸收过程对红细胞的游离血红蛋白和变形性产生不利的影响,尤其是海藻糖,这主要来源于渗透压伤害.结论：红细胞的糖吸收率与孵育温度、外源糖浓度和孵育时间的关系密切,而且在一定条件下的糖吸收效率也较高,但此过程对红细胞有一定的伤害,这可能会影响糖类在红细胞冰冻干燥保存研究中的应用前景.今后的研究工作应集中于如何处理细胞伤害和糖吸收效率的关系.     

冰冻干燥红细胞超微结构的分析

本研究的目的是探讨冰冻干燥红细胞在电镜下的形态变化。全血采自健康献血者 ,实验分为 3组。组 1:新鲜红细胞 ,4℃保存不超过 2 4小时 ;组 2 :红细胞中加入终浓度为 35 %的甘油 ,- 80℃保存 2 4小时 ;组 3:红细胞经过预处理 ,冰冻干燥 16小时。对解冻红细胞或水化重悬冰冻干燥的红细胞进行计数 ,电镜下观察 3组红细胞超微结构 ,并对电镜下红细胞平均直径、平均光密度及积分光密度进行图像分析。平均光密度及积分光密度代表细胞内血红蛋白的相对含量。结果表明 ,冰冻干燥后红细胞回收率为 5 3% ,红细胞具有圆盘状的结构。组 1红细胞平均直径(μm)、平均光密度及积分光密度分别为 4 .7± 0 .4 ,0 .14± 0 .0 2 ,1.5 8± 0 .4 6 ;组 2红细胞平均直径 (μm)、平均光密度及积分光密度分别为 4 .6± 0 .7,0 .14± 0 .0 2 ,2 .35± 0 .6 4 ;组 3红细胞平均直径 (μm)、平均光密度及积分光密度分别为 4 .4± 0 .4 ,0 .17± 0 .0 5和 2 .35± 0 .4 6。对电镜下红细胞平均直径、平均光密度及积分光密度数据进行统计学处理 ,三元方差分析的Wilks′Lambda检验显示 ,组 3与组 2之间无显著差异 ,组 3与组 1相比较差异显著。结论 :冰冻干燥红细胞具有相对完整的超微结构 ,平均直径及血红蛋白的含量与冰冻保存红细胞相     

苯甲醇对红细胞冻干前海藻糖负载红细胞影响研究

为研究苯甲醇对海藻糖负载红细胞的影响,在4℃条件下将红细胞孵育在浓度分别为10、30、50、100mmol/L的苯甲醇-海藻糖溶液中24小时,用氰化血红蛋白试剂盒测定海藻糖负载红细胞的溶血率,用硫酸-蒽酮法检测红细胞内海藻糖浓度水平。结果表明：在100mmol/L苯甲醇-海藻糖溶液组,其红细胞内海藻糖浓度为72±12.98mmol/L,与其它各组相比,有显著统计学差异（p=0.000）;溶血率为17.99±3.75%,与其它各组相比,有显著统计学差异（p=0.000）。结论：苯甲醇可提高海藻糖负载红细胞的负载率,随着苯甲醇浓度的升高红细胞海藻糖负载率也提高,100mmol/L的苯甲醇浓度为可用浓度。     

人红细胞冰冻干燥保存研究的进展

目前红细胞临床保存方法主要有低温（4℃）和深低温（-80℃或-196℃）保存。4℃保存时间短，而且容易受到细菌污染；深低温保存大大延长了红细胞保存时间，但需要笨重的低温设备，而且由于保护液中含有甘油等渗透性保护剂，解冻后需要反复洗涤。这些缺陷限制了常规红细胞保存方法在一些特殊情况，例如在战争和自然灾害条件下的应用。相对于常规保存方法而言，冰冻干燥具有以下优势：重量大大减轻，便于运输，适合室温保存。易于再水化。本文就冰冻干燥保存红细胞研究的进展和所面临的挑战，尤其是最近海藻糖在冰冻干燥保存过程中的应用以及其作用机制进行了综合讨论，从而为发展一种安全、简单和有效的红细胞冰冻干燥保存方法提出理论指导。     

人血浆对红细胞保存的影响

为了研究人血浆对保存的红细胞结构和功能的影响，对悬浮红细胞、洗涤红细胞以及添加不同量血浆的红细胞成分血在不同保存时间内的红细胞的功能指标，包括pH值、K^＋浓度、Na^＋浓度、渗透脆性、血浆游离血红蛋白、乙酰胆碱酯酶活性、ATP含量、2．3-DPG、P50含量进行了比较。结果证明，血浆有利于保存血液维持其高pH值、低K^＋浓度和高Na^＋浓度，有利于保存红细胞维持其ATP含量、携氧能力和红细胞变形性，但对保存血液维持低渗透脆性，对保存血液的血浆游离血红蛋白、乙酰胆碱酯酶活性、ATP含量和2．3-DPG含量无影响。结论：在红细胞成分血中加入一定量的血浆可能有利于红细胞的长期保存。     

海藻糖用于血细胞冻干保存中的研究进展

冰冻干燥方法是保存血细胞最佳的方法，因为冻干的血细胞制品能在常温下保存，性能稳定，保存时间长．便于运输，保存费用低廉等优势，解决了目前血细胞保存的局限性。然而，在冻干过程中血细胞膜的损伤、细胞功能的降低是一个重要的问题。目前，研究者多以海藻糖为保护剂，将海藻糖导入血细胞内，对血细胞进行冻干。本文主要综述冻干对血细胞损伤机理，海藻糖对血细胞冻干过程中的保护机制及海藻糖在血细胞冻干保存中的研究现状。     

海藻糖和葡萄糖联合负载红细胞的效果评价

目的探讨海藻糖和葡萄糖联合负载红细胞的效果,为冷冻干燥红细胞提供新的保存剂。方法分别采用0、0．125、0．25、0．5和1mol／L的海藻糖、葡萄糖以及海藻糖联合葡萄糖37℃负载红细胞6h。分别检测负载后红细胞内海藻糖和葡萄糖的浓度。结果负载液中糖类浓度为0．125、0．25和0．5mol／L时,联合负载组与海藻糖或葡萄糖组负载后红细胞内的海藻糖和葡萄糖浓度的差异无统计学意义（P〉0．05）。而负载液糖类浓度达到1mol／L时,联合负载组红细胞内海藻糖和葡萄糖的浓度明显低于海藻糖和葡萄糖单独负载组,差异有统计学意义（P〈0．05）。结论浓度小于1mol／L时,海藻糖联合葡萄糖负载红细胞并不影响海藻糖和葡萄糖进入红细胞内,可以满足红细胞冷冻干燥的要求。