日本血吸虫精氨酸酶的cDNA序列分析

目的 对获得的日本血吸虫（Schistosoma japonicum,Sj)精氨酸酶基因cDNA序列进行二级结构预测。方法 采用生物信息学等技术对获得的Sj精氨酸酶编码基因序列进行开放读框（ORF）的寻找,编码氨基酸的推导,蛋白质同源性比较以及二级结构的预测。结果 获得的cDNA序列为1061bp,含有一个840bp的阅读框,编码279个氨基酸,属精氨酸酶家族,与国际蛋白质库中酵母、蛙、人和大鼠精氨酸酶序列的同源性分别为44％,50％,51％,53％和54％。Sj精氨酸酶氨基酸序列的β转角、亲水性、平均可塑性和无规则卷曲的分布主要出现在N－末端AA残基30－50,70－90和180－200等3个区域,是潜在抗原表位。结论 推测Sj精氨酸氨基酸酶具有较好的抗原性。     

编码日本血吸虫线粒体大亚基核糖体基因的亚克隆、测序及同源性分析

目的筛选日本血吸虫成虫 cDNA 文库,得到基因克隆并测序。方法体外将以阳性克隆为模板的 PCR 产物和 pGEM-T 载体连接,转染大肠杆菌 XL1-blue,经抗生素及生色底物 X-gal 初筛,再用限制性内切酶酶切法进一步鉴定为重组质粒后,DNA 自动测序仪测序。序列送blast 基因服务站进行同源性分析。结果构建三个含日本血吸虫 cDNA 基因片段的重组子,其中一个阳性克隆序列为编码日本血吸虫线粒体大亚基核糖体的基因序列。结论获得编码日本血吸虫线粒体大亚基核糖基因片段,为分析其作为候选重组疫苗分子的潜能打下基础。     

运用生物信息技术分析日本血吸虫Z88基因cDNA序列

目的通过基因序列分析，寻找日本血吸虫新的基因，为日本血吸虫病防治筛选新的候选疫苗抗原。方法从已构建的日本血吸虫成虫cDNA文库中挑取已知克隆(克隆号为Z88)，测定其全长cDNA序列后，再运用生物信息学方法以及相关软件对此基因进行分析。结果通过测定以及分析可知此基因的cDNA序列为1303bp，编码349个氨基酸，为DnaJ-相似蛋白，与果蝇、鲐、人及鼠的DnaJ-相似蛋白有一定同源性。二级结构分析预测提示其具有一定抗原性。结论Z88基因为日本血吸虫DnaJ-相似蛋白基因，可能参与蛋白折叠、装配和运输等功能。     

日本血吸虫乙醛脱氢酶全长基因编码序列的预测、 验证与分析

目的 利用生物信息学和实验相结合的方法, 补平已知拼接序列中的缺失片段, 获得日本血吸虫乙醛脱氢酶全长基因编码序列。 方法 通过生物信息学方法从已公开发布的日本血吸虫转录组数据库中提取乙醛脱氢酶表达序列标签(EST)序列数据, 与其他物种的同源基因进行多序列联配, 寻找分别与同一蛋白氨基酸序列的N端和C端配对的序列; 设计引物, 用RT?鄄PCR扩增得到全长基因中间的缺失片段并测序。最终获得全长基因序列, 并分析该蛋白的理化性质。 结果 找到日本血吸虫乙醛脱氢酶基因的可能EST序列片段8条, 对其中的1对EST序列(AAW27891和AAW27047对应的氨基酸序列, 中间缺少约80个氨基酸)进行blastn比对结果, 预测为同一基因的2条片段。根据这两对EST序列设计正、 反向引物, 通过PCR扩增、 对扩增产物进行测序及序列的生物信息学鉴定, 找回了缺少的核酸序列, 并与预测序列大小大致吻合(430 bp)。组合成1条完整的日本血吸虫乙醛脱氢酶基因的编码序列(提交GenBank, 其登录号为EF503564)。ORF全长为1 596 bp, 编码531个氨基酸, 编码的蛋白相对分子质量理论值为Mr 573 30.7, pI值为7.94,此序列的290～297位氨基酸与乙醛脱氢酶的模式序列［LIVMFGA］-E-［LIMSTAC］-［GS］-G-［KNLM］-［SADN］-［TAPFV］相匹配。 结论 利用生物信息学和实验相结合的方法, 可以补平已知拼接序列中的缺失片段, 获得日本血吸虫乙醛脱氢酶的全长基因编码序列。     

日本血吸虫(大陆株)成虫表达序列标签的获取及电子延伸

目的获取日本血吸虫(Schistosoma japonicum，Sj)新基因。方法从Sj(大陆株)成虫cDNA文库中随机挑选单个重组克隆进行部分测序以获取表达序列标签(expressed sequence tag，EST)，用其提供的BLAST程序和Genebank数据库进行序列比较和同源性分析；建立电子拼接的方法，对所获EST进行电子延伸，并对Sj延伸后序列进行同源性分析。结果在Sj成虫cDNA文库中，随机挑选182个单个重组克隆，获取53个有价值EST序列，并在Genebank中登录，获得53个EST的延伸序列及分析结果。结论Sj表达基因EST测序、同源性分析及EST的电子延伸是获取Sj新基因的有效对策。     

日本血吸虫酪氨酸羟化酶基因的克隆和序列分析

目的 克隆并鉴定日本血吸虫酪氨酸羟化酶(TH)基因，探讨其他信号蛋白在信号传导中对TH的调节及其之间的分子作用机制，从而为血吸虫新型疫苗的设计和药物开发开辟新的途径。方法 以曼氏血吸虫的TH cDNA为模板设计引物，以日本血吸虫成虫mRNA为模板逆转录合成cDNA链，将扩增出的日本血吸虫TH蛋白编码基因序列，克隆入pGEM-T easy载体，用单酶双切法和DNA测序进行鉴定，并与曼氏血吸虫的TH基因序列进行同源性比较。结果 自日本血吸虫RNA经逆转录得到一长度为480bp的DNA片段，经测序与曼氏血吸虫TH的同源性为87％。结论 成功扩增出日本血吸虫TH的中间编码区域，为进一步扩增日本血吸虫TH基因全长以及后续实验奠定了基础。     

用特异性抗体筛选日本血吸虫基因组DNA基因库

用酶免疫测定法筛选日本血吸虫(S.j.)基因组DNA基因库,先将λ噬菌体(λgt11),重组体噬菌斑的表达抗原转移至硝酸纤维(NC)膜,然后用经导入λgt11的大肠杆菌Y1090细胞裂解液吸收的感染兔血清(IRS)检测。结果,从97只平板初筛出8个可能阳性噬菌斑,经再次筛选,8个中2个仍为阳性。其中1个阳性克隆经纯化后导入Y1089细胞扩增,其表达产物经ELISA复筛进一步证实S.j.抗原阳性。表明该克隆编码S.j.抗原,该克隆的表达产物能被IRS识别。该免疫筛选方法能有效地分离单个编码S.j.抗原的克隆,且筛选效率高(每次可筛选1×10~5噬菌斑形成单位),结果可靠、特异,不需要同位素标记技术,操作简便,为进一步筛选编码诱导S.j.保护性免疫力的抗原的基因打下基础。     

日本血吸虫尾蚴弹性蛋白酶结构的生物信息学分析

目的分析日本血吸虫尾蚴弹性蛋白酶（SjCE）的结构,为药物靶标、疫苗研究提供参考。方法用Prot-param、SignalP、DNAMAN、SOSUI、Emini、BepiPred、MLRC、Geno3d等软件对SjCE的蛋白质理化参数、亲水性、可溶性、表面可及性、二级结构、三级结构、抗原表位等进行分析及预测。结果 SjCE由263个氨基酸残基组成,理论分子质量单位为28.5 ku,等电点为6.94,属于可溶蛋白;有6个表面可及性区域;BepiPred 1.0 Server预测有7个抗原表位;二级结构以无规则卷曲为主;三级结构分子建模显示,该蛋白含有丝氨酸蛋白酶活性部位,位于裂隙区的中间。结论 SjCE具有丝氨酸蛋白酶活性位点,是可溶性蛋白。该蛋白有6个潜在的抗原表位,是潜在的疫苗候选分子和药物作用靶标。     

日本血吸虫SjBT基因的获得与生物信息学分析

目的从日本血吸虫(Schistosoma japonicum，Sj)成虫cDNA文库中获得并分析日本血吸虫新基因，为防治日本血吸虫病提供药物靶标或候选疫苗。方法构建日本血吸虫成虫cDNA文库，用序列标签法随机挑取重组阳性克隆进行测序，对部分序列进行步移法测序获取其全长cDNA，并进行生物信息学分析和登录。结果获得了1个日本血吸虫新基因，全长1439bp，编码443个氨基酸，与肝片形吸虫微管蛋白基因具有79％的同源性。编码蛋白的理论分子质量为7．2198ku，等电点为9．12；抗原表位可能位于cDNA序列373～396处。结论表达序列标签法、步移法测序和生物信息学技术有利于发现日本血吸虫新基因。     

日本血吸虫尼克酰胺磷酸核糖转移酶的生物信息学分析

目的对日本血吸虫尼克酰胺磷酸核糖转移酶（SjNAMPT）基因序列及蛋白序列进行生物信息学分析,为该基因的克隆表达和开发应用奠定基础。方法利用Internet在线分析程序和相关工具软件分析SjNAMPT基因的开放阅读框,分析基因编码蛋白的理化性质、结构域,并预测其空间结构和功能。结果 SjNAMPT蛋白由179个氨基酸组成,分子量为19.63kDa,理论等电点为7.64,为稳定性蛋白,无跨膜区和螺旋卷曲结构,不含有信号肽,含有多个磷酸化位点,该蛋白属于磷酸核糖转移酶保守结构域家族,亚细胞定位于细胞质,二级结构以无规卷曲为主,SjNAMPT蛋白序列与其他物种同种蛋白序列相似性较低。结论 SjNAMPT蛋白为日本血吸虫特异性蛋白,具有一定酶活性,可能与日本血吸虫嘌呤代谢和糖代谢有关,值得进一步研究。     

中国大陆日本血吸虫地理株间成虫蛋白质组分的差异

目的分离、鉴定中国大陆日本血吸虫不同地理株间成虫差异表达蛋白。方法分别收集、制备日本血吸虫不同地理株成虫可溶性蛋白,经固相pH梯度双向凝胶电泳分离,凝胶银染,并用PDQuest8.0凝胶图像分析软件进行比较分析,筛选出差异表达蛋白点并采用基质辅助激光解析离子飞行时间质谱仪进行鉴定。结果湖南株、江西株和江苏株雄虫分别检出698±10、650±19、629±23个蛋白点,雌虫分别检出670±12、682±22、625±28个蛋白点,约90%蛋白点分子量处于20～90kD范围内,蛋白等电点在5～8之间。不同地理株雌虫与雄虫分别两两比较,雄虫发现14个差异点,雌虫发现18个差异点。对其中7个雄虫差异表达蛋白及3个雌虫差异表达蛋白经MALDI-TOF-MS鉴定分析,获得其肽质量指纹图谱、等电点、分子量等相关信息。7个雄虫差异表达蛋白分别为:SJCHGC00821蛋白、SJCHGC00475蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶、谷胱甘肽转移酶片段、谷胱甘肽-S-转移酶、D-核酮糖-5-磷酸-3-表异构酶、G蛋白α亚基AgGq1,3个雌虫表达蛋白分别为:预测蛋白、GAF型传感器信号转导组氨酸激酶、组织蛋白酶B样半胱氨酸蛋白酶前体。结论中国大陆日本血吸虫不同地理株虫体间蛋白质存在差异,部分蛋白表达差异与虫体对吡喹酮敏感性密切相关。     

日本血吸虫乳酸脱氢酶(SjLDH)结构与功能的生物信息学分析

目的 应用生物信息学分析软件预测日本血吸虫乳酸脱氢酶（SjLDH）氨基酸序列的结构与功能。 方法 应用NCBI、Expasy等在线生物信息学网站及Vector NTI、PCgene等软件包分析SjLDH与其他物种的同源序列，进行多序列同源比对，分析相同的保守位点及催化活性位点，构建分子进化树；预测二级结构、拓扑结构；同源模建预测三级结构；预测主要抗原表位等。 结果 SjLDH与其他物种的同源序列含相同的保守位点及催化活性位点，与华支睾吸虫LDH（CsLDH）同源性最高为75％，与阴道毛滴虫LDH（TvLDH）同源性最低为17%，与人LDH（HsLDH-A，-B，-C）的同源性为58%~60％； SjLDH与果蝇（DmLDH）的进化距离较秀丽隐杆线虫（CeLDH）为近，3种人LDH中与HsLDH-B、-C的进化距离较HsLDH-A为近；该蛋白具有3个跨膜区域，3个高亲水性区域，主要的线性表位98aa~106aa位于膜外，与原虫LDH相同区域差异显著，而与其他LDH有1~3个氨基酸的差异，关键催化位点之一及底物丙酮酸结合区域位于该区域，蛋白质同源模建分析表明该区域位于蛋白表面形成环状结构，3个关键催化位点位于该区域或在其附近。 结论 生物信息学预测结果提示LDH是研究物种分子进化理想的分子；SjLDH可能是免疫诊断、药物作用及疫苗潜在的靶分子。     

日本血吸虫童虫cDNA文库的免疫筛选及其生物信息学分析

目的筛选新的可能具有诊断意义的血吸虫蛋白分子,并对其进行生物信息学分析。方法以血吸虫病人血清筛选日本血吸虫15d肝期童虫cDNA文库,对阳性克隆插入片段的核苷酸进行序列分析,将结果通过Internet送入NCBI GenBank进行同源性比较并利用蛋白质分析软件进行生物信息学分析。结果经3轮筛选,共获15个阳性克隆,对其进行测序,获得11个基因,其中5个为编码日本血吸虫线粒体的基因,1个为编码日本血吸虫肌球蛋白的基因,其他5个分别为编码SjCHGC05315、SjCHGC01371、SjCHGC04782、SjCHGC05166、SjCHGC09769的基因。结论从日本血吸虫肝期童虫cDNA文库中筛选到一批日本血吸虫基因,为血吸虫病新的诊断候选分子的研究提供了材料。     

日本血吸虫SjGrpE蛋白的表达 纯化 及多克隆抗体制备

目的　分析日本血吸虫核苷酸交换因子（SjGrpE）蛋白生物学特性,表达与纯化重组SjGrpE蛋白并测定其免疫原性。方法　采用生物信息学方法预测SjGrpE蛋白的氨基酸组成、分子量、亲/疏水性、跨膜区、信号肽、定位、磷酸化位点、泛素化位点、糖基化位点、二级和三级结构及B细胞表位。以日本血吸虫cDNA为模板,PCR扩增SjGrpE基因,将其双酶切后连接到pET28a载体得到重组质粒pET28a?SjGrpE。将pET28a?SjGrpE转化大肠埃希菌BL21,用IPTG诱导目的蛋白表达,并用镍离子亲和层析法纯化蛋白。将重组SjGrpE蛋白免疫小鼠,分离血清并鉴定获得的抗多克隆抗体。结果　 SjGrpE蛋白分子量约为24.3 kDa,是一种亲水性蛋白,无跨膜区、无信号肽,定位在线粒体;该蛋白含有18个磷酸化位点和2个泛素化位点,无糖基化位点,含有5个B细胞表位。SjGrpE基因全长为660 bp,成功构建重组质粒pET28a?SjGrpE并纯化获得重组SjGrpE蛋白。重组SjGrpE蛋白能够刺激小鼠分泌高滴度抗体。结论　成功制备重组SjGrpE蛋白,该蛋白具有良好免疫原性,为后续研究其作为日本血吸虫病疫苗候选分子的价值奠定了基础。     

日本血吸虫未知基因的获得、鉴定和编码区的克隆

目的：寻找日本血吸虫未知基因,并对其进行鉴定和编码区克隆。方法：运用表达序列标签（EST）法寻找日本血虫未知基因。对获得的表达序列标签运用生物学软件进行分析,根据同源基因序列推测其可能的功能,并将其克隆入真核表达载体pEGFP-N3中,结果：获得1个完整的日本血吸虫cDNA序列（JAYL0230）,氨基酸同源性分析发现与其他生物的抗凋亡因子1具有同源性,构建了重组克隆pEGFP-N3-JAYL0230,结论：FST法是一种快速发现和鉴定日本血吸虫未知表达基因的有效方法,有助于加速其全长cDNA的克隆。     

重组日本血吸虫铁蛋白的表达纯化及诱导小鼠保护性免疫研究

目的　表达、纯化重组日本血吸虫铁蛋白 ,观察其免疫小鼠后抗日本血吸虫的免疫保护作用。方法　用基因重组技术 ,将日本血吸虫铁蛋白基因亚克隆至表达载体 pGMC上 ;在IPTG诱导下 ,重组日本血吸虫铁蛋白得到高效表达 ;用电泳层析法分离纯化日本血吸虫铁蛋白 ;用SDS -PAGE和Western -blot鉴定表达纯化产物 ;用纯化的重组铁蛋白免疫小鼠三次 ,分别在 0、2、4周进行。第 6周每鼠经腹部感染 4 0± 1条日本血吸虫尾蚴。 4 2天后剖杀冲虫 ,计数虫数及肝卵数。结果　纯化的重组铁蛋白分子量为 4 0kD ,具有较好的免疫原性 ,能被日本血吸虫感染兔血清识别。与对照组相比 ,纯化重组铁蛋白免疫小鼠组的减虫率为 2 4 5 % ,减卵率为 4 5 8%。结论　重组日本血吸虫铁蛋白不仅在大肠杆菌中得到高效表达 ,而且纯化的铁蛋白分子能诱导抗日本血吸虫病的保护性免疫。     

日本血吸虫与曼氏血吸虫的致病差异

曼氏血吸虫和日本血吸虫是全球范围内两种主要的肠道血吸虫病病原体,所致基本病理均为虫卵引起的肝脏肉芽肿和纤维化,但两者在产卵方式以及肉芽肿的组成细胞等方面均存在明显差异。 目前,我国的血吸虫病研究主要以日本血吸虫病为对象,国外主要以曼氏血吸虫病为对象,而介绍两种血吸虫致病差异的综述较少。 为更好地理解两种血吸虫的致病差异,本文从血吸虫的基因组和进化路径、幼虫迁移、成虫寄生位置及产卵方式、局部组织病理、肉芽肿的形成机制以及肉芽肿的细胞组成等 6 个方面对日本血吸虫和曼氏血吸虫的致病差异进行了综述。