甲基化特异PCR方法对p16肿瘤抑制基因的研究

目的：研究肺癌、结肠癌组织中p16肿瘤抑制基因甲基化状态及其临床意义。方法：采用甲基化特异性聚合酶链反应（MSP）方法,特异扩增分析甲基化和非甲基化两种状态。结果：p16基因在人胚肺组织处于非甲基化状态;在人肺巨细胞癌细胞系（PLA801-D）呈甲基化状态;在检测的肿瘤标本中,60%肺癌组织及70%结肠癌组织出现甲基化状态。结论：p16基因的甲基化状态是肺癌、结肠癌组织中p16基因异常形式之一,有可能成为肿瘤分子诊断的重要标志,MSP方法有临床普及应用前景。     

p16基因甲基化检测在肺癌诊断中的意义

目的:探讨在进行肺癌诊断过程中,p16基因甲基化的检测意义。方法:通过MSP(甲基化特异性聚合酶链反应)方法对134例疑是肺癌患者的痰液、外周血血浆、胸腔积液、BALF(支气管肺泡灌洗液)与活检组织中p16基因当前的甲基化状态进行详细检测。结果:对于84例确诊患者,其每个标本具有的阳性率差异无统计学意义(P>0.05)。对于50例确诊为出现良性病变的患者,除了在患者血液、胸腔积液以及活检标本中发现异常甲基化的1例患者之外,在剩余的标本中都没有出现异常甲基化的情况,两组差异有统计学意义(P<0.05)。结论:利用MSP对有关标本中的甲基化状态进行检测,针对肺癌患者的辅助诊断具有极其重要的意义;同时对不同标本的p16基因甲基化状态进行检测,能够有效将肺癌患者诊断的敏感性提高。     

宫颈癌p16基因甲基化研究新方法

目的建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测宫颈癌p16基因甲基化的方法，以期达到早期诊断宫颈癌。方法正常基因组DNA经修饰后进行PCR，构建含有DNA甲基化β-aetin的重组质粒，克隆阳性质粒作为标准品用SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR进行检测，建立检测的标准曲线。利用建立好的方法进行检测临床60例宫颈癌组织中p16基因启动子区域5’CpG岛甲基化状态。结果结果显示正常对照组织及癌旁p16基因无甲基化，60例宫颈癌标本的甲基化率为28．33％（17／60）。结论SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR用于p16基因甲基化检测为宫颈癌的早期诊断提供了一种有效的方法。     

甲基化特异性PCR检测胃癌p16基因甲基化及其临床意义

目的初步探讨甲基化特异性聚合酶链反应（MSPCR）在胃癌临床诊断中的应用价值。方法选取47例胃癌患者的癌组织及配对的癌旁组织，11例远离肿瘤的正常胃黏膜组织。标本经一般处理，PCR扩增后，产物经电泳EB染色，紫外灯下观察。结果47例胃癌组织标本中，22例（46．2％）在p16基因的启动子区域呈现异常甲基化；47例癌旁组织标本中，28例（58．6％）也检测出甲基化存在；11例正常胃黏膜组织标本中均未检测出p16基因甲基化存在。结论MSPCR技术对胃癌患者组织标本中的异常甲基化检测具有高度特异性，是一项具有潜力的胃癌早期诊断新技术。     

胃癌组织中p16基因甲基化分析

目的：探讨抑癌基因p16在胃癌组织中是否存在甲基化异常及其与胃癌发生发展的关系。方法：对20例胃癌组织及相应正常胃粘膜组织应用于甲基敏感酶（HpaⅡ）和甲基非敏感酶（MspⅠ）酶切,结合PCR扩增技术,对p16基因外显子1、外显子2的二核苷酸胞嘧啶特定序列5‘-CCGG-3‘位点甲基化进行检测。结果：20例胃癌组织中,p16基因外显子1、2异常甲基化分别为5例（25％）和9例（45％）,正常组织未发现甲基化异常;14例高甲基化标本中,中分化胃癌4例,低分化7例,高分化1例,有2例存在外显子1、2同时甲基化异常,二者均为低分化胃癌,进展期胃癌（Ⅲa,Ⅳ期各1例）中1例呈现泳动易位;外显子2甲基化异常多发生于晚期肿瘤患者（P＜0．05）。结论：p16基因甲基化异常可能会造成基因功能丧失,从而失去了对细胞增殖的负性调控作用,导致胃癌发生与进展;外显子2高甲基化与临床进展有关,可能为晚期事件。     

巢式甲基化特异性PCR检测p16基因的研究

目的检测p16基因启动子区异常甲基化发生情况,探讨p16基因异常甲基化作为结直肠癌临床辅助诊断分子生物学标志物的可能性.方法应用巢式甲基化特异性PCR技术(Nested-MSP)及甲基化特异性PCR(MSP),检测了结直肠癌患者肿瘤组织中p16基因的异常甲基化情况;比较MSP及Nested-MSP两方法的灵敏度.结果应用MSP方法,Dukes A、B期病人和Dukes C、D期病人p16启动子区甲基化率分别为23.8%和59.4%;应用巢式-MSP方法,甲基化率上升至52.4%和84.4%.结论巢式-MSP的灵敏度明显高于普通的MSP技术,分析患者DNA的p16基因异常甲基化有可能成为辅助结直肠癌诊断的有效方法之一.     

肝细胞癌中p16基因及其甲基化的检测与意义

目的　研究P16、P16甲基化在肝细胞癌 (Hepatocellularcarcinoma ,HCC)与癌旁组织中的表达特点 ,探讨其与HCC生物学行为的关系。方法　分别以免疫组化及PCR技术检测 3 3例人肝细胞癌及其癌旁组织中p16基因表达及其甲基化的水平 ,并结合临床资料进行分析。结果　肝癌的p16基因表达率 (63 64 % )明显低于癌旁组织 (10 0 % ) (P <0 0 5 ) ;p16基因阳性表达率在无转移的肝癌中为 85 7% ,有转移组为 2 5 0 % ;高、中和低分化的肝癌分别为 5 2 4% ,2 8 6%和 19 1%。p16基因阳性表达在肝癌患者高分化与中和低分化比较有显著性差异 (P <0 0 5 ) ,转移与非转移组比较有非常显著性差异 (P <0 0 1)。 3 3例HCC组织中 11例发生p16甲基化 ,均伴肿瘤转移 ,其中高、中和低分化肿瘤各占 2、4、5例 ;相应癌旁组织中未发现p16基因甲基化。结论　p16基因异常表达及其甲基化在肝细胞癌的发生、发展过程中起重要作用。     

卵巢癌组织中p16基因甲基化的研究

目的 探讨抑癌基因p16基因5’端CpG岛甲基化在卵巢癌癌变过程中的作用。方法 应用甲基化特异性PCR(MSP)分别检测17例卵巢癌样本中p16基因启动子区域(M1／U1)以及启动子和第—个外显子5’端部分(M2／U2)的甲基化状态。结果 在我们检测的17例卵巢癌样本中，有3例M1阳性，阳性率为17．65％(3／17)，这些病例恶性度较低。无1例M2阳性。结论 抑癌基因p16基因5’端CpG岛甲基化参与卵巢癌特别是恶性度低的卵巢癌的癌变过程，它可能与其它抑癌基因协同作用。     

癌组织中p16基因甲基化分析

目的探讨抑癌基因p16在胃癌组织中是否存在甲基化异常及其与胃癌发生发展的关系.方法对20例胃癌组织及相应正常胃粘膜组织应用甲基敏感酶(HpaII)和甲基非敏感酶(MspI)酶切,结合PCR扩增技术,对p16基因外显子1、外显子2的二核苷酸胞嘧啶特定序列5'-CCGG-3'位点甲基化进行检测.结果20例胃癌组织中,p16基因外显子1、2异常甲基化分别为5例(25%)和9例(45%),正常组织未发现甲基化异常;14例高甲基化标本中,中分化胃癌4例,低分化7例,高分化1例;有2例存在外显子1、2同时甲基化异常,二者均为低分化胃癌,进展期胃癌(Ⅲa、Ⅳ期各1例)中1例呈现泳动易位;外显子2甲基化异常多发生于晚期肿瘤患者(P<0.05).结论p16基因甲基化异常可能会造成基因功能丧失,从而失去对细胞增殖的负性调控作用,导致胃癌发生与进展;外显子2高甲基化与临床进展有关,可能为晚期事件.     

p16基因甲基化在肺癌诊断中的研究进展

肺癌是目前发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一,约占所有肿瘤的12.4%,且5年生存率低于15%[1].目前80%的肺癌患者在明确诊断时已失去了手术治疗的意义,因此,早期诊断是目前大幅度提高肺癌治愈率和患者生存率的有效手段,但目前尚未找到一种较为满意的方法.随着相关研究的发展,现已证实肿瘤抑制基因p16基因因其外显子区域的甲基化而致基因的失活与肺癌的发生发展密切相关[2],此为肺癌的早期诊断提供了一种新的可能路径.本文就此作一综述.     

p53基因突变和p16基因缺失与肝癌的相关性

目的:检测肝癌患者血浆中p53基因突变和细胞核中p16基因缺失的机率,研究与疾病发生、发展的相关性并探讨其意义.方法:实验采用聚合酶联链式反应(PCR)扩增p53基因外显子5～8和免疫组织化学方法SP-p16,对其突变和缺失进行分析.结合临床患者有无肝组织以外转移来对比差异性.结果:33例肝癌患者中,有17例结果显示血浆循环核酸p53基因突变;有转移病灶组18例的突变率高于无转移病灶组15例.结论:血浆p53基因突变和p16基因缺失与肝癌的发生、与疾病的轻重及病灶转移有相关性,突变机率在临床鉴别诊断和治疗预后中有参考价值.     

膀胱癌细胞p16抑癌基因失活的研究

目的 探讨膀胱癌中p16基因失活情况。方法 采用PCR、PCR—SSCP和DNA甲基化分析技术等方法对25例膀胱癌组织中p16基因进行检测。结果 25例膀胱癌标本中有6例存在p16基因纯合性缺失，缺失率为24％；无1例出现点突变；16例出现异常甲基化，检出率为69．6％(16／23)。结论 外显子2的纯合性缺失在安徽区域发生的膀胱癌中可能不是一个较频繁发生的事件；通过CpG岛异常甲基化失活可能是膀胱癌p16基因失活的主要机制。     

p16和p53抑癌基因在肾母细胞瘤中的表达及与预后关系

目的 探讨p16、p53抑癌基因在肾母细胞瘤中的表达及与临床预后的关系。方法 应用免疫组织化学方法S-P和ABC法检测p16和p53基因的表达。结果 20例肾母细胞瘤标本p16蛋白染色阳性7例，阳性率为35％；其中上皮型10例，阳性4例(占40％)；间叶型5例，阳性1例(占20％)；胚胎型3例，阳性1例(占33％)；混合型2例，阳性l例(占50％)。p53蛋白阳性染色5例，阳性率为25％。其中上皮型及混合型12例中，p53阳性2例(占16．7％)；而间叶型及胚胎型8例中，阳性3例(占37．5％)。结论对肾母细胞瘤患同时进行p16和p53检测更能准确地判断其病理性质和预后。     

p16和p15基因在子宫内膜癌中的表达

目的：探讨抑癌基因p16及p15在子宫内膜癌、子宫内膜不典型增生及正常子宫内膜组织中的表达及其与子宫内膜癌的关系。 方法：应用免疫组化技术检测57例子宫内膜癌、8例子宫内膜不典型增生、7例子宫内膜增生过长及7例正常增生期子宫内膜组织中抑癌基因p16、p15的表达。 结果：p16在子宫内膜癌组织及非癌子宫内膜组织中表达率分别为40.4%和77.3%,二者表达率差异有显著性(P<0.05),在子宫内膜癌中p16表达与病理类型、病理分级及手术-病理分期有关,与肌层浸润无关;p15在子宫内膜癌及非癌子宫内膜组织中表达率分别为47.4%和86.3%,二者比较差异有显著性(P<0.05),在子宫内膜癌组织中p15的表达与病理分级有关,与病理类型、肌层浸润及手术-病理分期无关,子宫内膜癌组织中p16与p15表达呈正相关（r=0.91,P<0.05）。 结论：p16和p15表达缺失在子宫内膜癌的发生发展过程中发挥一定作用,其中以p16更为显著;p16和p15的表达具有一致性,功能上有一定的互补作用。     

p16及p15基因预测葡萄胎恶变的价值

①目的 探讨p16、p15基因及蛋白缺失与葡萄胎恶变的关系。②方法 应用PCR和免疫组化技术检测40例葡萄胎和25例早孕正常绒毛中p16、p15基因的纯合性缺失及蛋白表达情况。③结果早孕绒毛中p16、p15基因、蛋白表达均为阳性。葡萄胎中p16、p15基因及蛋白表达缺失率均高于早孕绒毛组织,差异有显著性（χ^2=11．152、14．388,P〈0．05）。葡萄胎恶变组P16、P15蛋白表达联合阴性率高于无恶变组（χ^2=4．675,P〈0．05）;葡萄胎恶变组中,伴随清官前子宫大于妊娠月份、同时发生黄素囊肿且大于6cm、清宫后HCG持续2个月才消退者,其P16、P15蛋白表达联合阴性率均高于非恶变组,差异有显著性（χ^2=4．412,P〈0．05;P=0．014、0．038）。④结论 葡萄胎的发生、发展与p16、p15基因、蛋白表达缺失有关。葡萄胎中P16、P15蛋白表达缺失可望成为预测葡萄胎恶变倾向的指标。     

基因甲基化与急性淋巴细胞白血病的关系

目的：探讨p16基因甲基化在急性淋巴细胞白血病(ALL)发生机制中的作用。 方法：采用限制性内切酶酶切结合多聚酶链反应方法检测82例ALL患者白血病细胞p16基因部分启动子和外显子1 CpG岛甲基化的情况。 结果：31例ALL患者存在p16基因的甲基化,1例p16基因纯合缺失;p16存在甲基化与纯合缺失的患者初次化疗完全缓解率和平均生存时间低于p16基因正常表达者。 结论：p16基因甲基化在ALL发生机制中有一定的作用,可作为评估ALL预后的一个指标。     

p16/MTS1基因缺失在急性淋巴细胞白血病发病中的作用

目的 探讨多肿瘤抑制基因缺失在急性淋巴细胞白血病（ＡＬＬ）发病中的作用。方法 采用ＰＣＲ方法,对３０例完全缓解的ＡＬＬＰ１６／ＭＴＳ１基因的缺失情况进行了研究,并结合患者的临床结果进行分析。结果 １５例ＡＬＬ患者有Ｐ１６基因缺失,并发发现高危组患者Ｐ１６基因缺失发生率明显增加,Ｐ１６基因缺失的高危绷带 高的复发率,结论提示Ｐ１５６基因缺失和ＡＬＬ患者的预后相关。     

原发性肝细胞癌中p16、p15基因启动子区甲基化状态检测

目的研究原发性肝细胞癌中p16、p15基因启动子区甲基化状态及其与原发性肝细胞癌发生发展的关系。方法用特异性甲基化PCR（MSP）法检测30例原发性肝细胞癌肿瘤组织和5例正常肝脏组织中p16、p15基因启动子区甲基化状态，并进行统计分析。结果30例原发性肝细胞癌肿瘤组织中p16和p15基因启动子区分别有53．3％（16／30，P〈0．05）和46．7％（14／30，P〉0．05）甲基化，5例正常组织中未发现甲基化。两基因甲基化与原发性肝细胞癌临床病理及HBsAg之间无明显相关性（P〉0．05），两者在原发性肝细胞癌发生中有协同性（相关性和一致性）。结论p16、p15基因启动子区异常甲基化在原发性肝细胞癌中发生频率很高，可能对肝细胞癌发生发展起重要作用。     

INK4系列抑癌基因(p16、p15、p18、p19)在白血病中的甲基化

目的 探讨p16基因家族失活与白血病发生、发展及预后的关系，进一步阐明白血病发病机制，监测发病过程。方法 采用甲基化敏感限制内切酶Hpa Ⅱ或Msp Ⅰ结合PCR技术研究白血病患者p16、p15、p18、p19基因甲基化状况：(1)研究不同类型、不同阶段白血病p16基因家族外显子1和／或外显子2纯合子缺失，(2)用REP-PCR分别对上述病例中无外显子1缺失的病例进行甲基化研究，探讨甲基化发生频率，分析与白血病发病关系。结果 p16、p15基因外显子1在急性白血病(AL组)甲基化率分别为35．29％，48．65％，急性非淋巴细胞白血病(ANLL组)为25％，37．5%，急性淋巴细胞白血病(ALL组)为60％，69．23％，初治AL组为29．09％，42．10％，复发AL组为61．54％，70．59％，慢性粒细胞白血病(CML)慢性期、急变期、白血病完全缓解(CR-AL)、对照组均无甲基化。p18、p19基因无论在AL组、ALL组、ANLL组、复发AL组、初治AL组，或是在CML的慢性期、急变期、CR-AL、对照组均无甲基化。结论 (1)在p16基因家族中，p16、p15基因甲基化在AL的发生频率较高，ALL甲基化率明显高于ANLL，以复发ALL组最高。p18、p19基因在AL组中未见甲基化。(2)在ALL中，p15甲基化率高于p16甲基化率，在ANLL中，p16、p15基因的甲基化率高于对照组。(3)p16、p15基因甲基化可作为AL病程进展、复发、预后的指标之一。(4)p16、p15基因甲基化在CML病程中(慢性期、急变期)意义不大。     

肾母细胞瘤组P16蛋白的表达

目的探讨肾母细胞瘤中抑癌基因p16蛋白的表达及其意义。方法应用S-P免疫组织化学方法对53例肾母细胞瘤中抑癌基因p16蛋白的表达进行观察。结果24例肾母细胞瘤呈p16阳性表达,阳性率为45.29％,其阳性率与肿瘤的病理分类,临床分期及预后等密切相关。结论p16基因在抑制肾母细胞瘤发生、发展中起重要作用。