中国长白山乌苏里蝮蛇降纤酶基因克隆和结构分析

目的 :克隆乌苏里蝮蛇 ( Gloydius ussuriensis)降纤酶 ( Difibrase)基因 ,为用基因工程方法生产降纤酶打下基础。方法 :从乌苏里蝮蛇毒腺制备总 RNA,经 RT- PCR扩增、克隆和顺序测定。结果 :降纤酶 c DNA开框读码序列全长 70 2个核苷酸 ,编码 2 34个氨基酸 ,推测其活性中心为His41、Asp86和 Ser180 ,含有 6对二硫键。结论 :确定乌苏里蝮蛇降纤酶 c DNA顺序 ,推导出其氨基酸顺序和活性中心结构。     

短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白β亚基的基因克隆和序列分析

目的：克隆短尾蝮蛇毒磷脂结合抗凝蛋白（PBAP）β亚基基因,并对该基因进行序列分析。方法：从短尾蝮蛇的毒腺中提取总RNA,设计引物并采用RT-PCR技术进行体外扩增PBAPβ亚基cDNA序列,将PCR扩增产物克隆至载体PMD-19T,通过PCR进行鉴定后,提取阳性克隆菌体质粒进行测序。结果：序列分析结果显示：PBAPβ亚基cDNA序列长度为441bp,编码框由146个氨基酸组成,其中包括由23个氨基酸的信号肽,以及123个氨基酸组成的成熟肽。结论：PBAPβ亚基基因及其氨基酸序列和已报道的一些蛇毒凝集素β亚基的基因以及氨基酸序列相比较,有88%～99%的同源性。     

中华眼镜蛇毒腺cDNA表达文库的建立和分析

目的: 为研究开发眼镜蛇毒药用基因工程产品,筛选克隆及表达相关药用功能基因,构建中华眼镜蛇毒腺cDNA表达文库. 方法:一步法提取总RNA,Oligo(dT)纤维素层析柱纯化mRNA,逆转录PCR合成双链cDNA,分级分离除去小片段后,收集大于500 bp的cDNA片段,取10 ng cDNA与质粒载体pSPORT1连接、转化. 结果:获得克隆总数为2×105的眼镜蛇毒腺cDNA表达文库,重组率97%. 利用PCR技术从该文库扩增了心脏毒素-3(CTX-3)和磷脂酶A2(PLA2)基因的cDNA. 通过对文库克隆的序列测定和初步生物信息学分析,获得24个中华眼镜蛇毒腺EST序列. 结论:所建立的毒腺cDNA表达文库质量较高,可用于进一步筛选、克隆蛇毒药用功能新基因.     

人早幼粒细胞cDNA文库的构建及其鉴定

目的：构建人早幼粒细胞HL60的cDNA文库,阐明文库内相关基因在急性早幼粒细胞白血病（APL）发生发展中的相关机制。方法：采用Trizol法提取HL60细胞总RNA,离心柱法分离纯化样本中的mRNA,逆转录PCR法合成cDNA第一链,酶促法直接合成cDNA第二链,胶回收目的长度的cDNA片段后将其与pPR3-N载体连接,通过同源重组方法在酵母Y187菌株中构建人早幼粒细胞cDNA文库。将培养的菌液涂布于LB平板进行库容量鉴定,PCR法鉴定插入片段大小及分布。结果：提取到的HL60细胞RNA条带清晰无降解且弥散度低,以纯化后的细胞mRNA为模板成功合成cDNA,经胶回收cDNA片段后顺利将其与pPR3-N载体连接。将重组载体转化至酵母菌株Y187,通过同源重组方法在菌株中成功构建人早幼粒细胞cDNA文库。在原始电转化菌稀释100倍后取10 μL涂板,共长约250个克隆子,库容量为2.5×10⁶ CFU·mL^-1,转化后原始菌液共计5 mL,总库容量为1.25×10⁷ CFU。文库的插入片段电泳检测,平均插入片段大于1200 bp,阳性率为100%。结论：成功构建人早幼粒细胞的cDNA文库,为白血病的发病机制及治疗机制的研究奠定了基础。     

贵阳腐霉Pr2蛋白酶cDNA片段的克隆与分析

目的 克隆贵阳腐霉、Pr2蛋白酶的cDNA片段,改造贵阳腐霉基因.方法 用几丁质诱导培养基培养贵阳腐霉24 h,然后抽提菌丝的总RNA,反转录合成cDNA第1链,根据Pr2蛋白酶的氨基酸保守序列设计合成简并引物,以cDNA第1链为模板,采用降落PCR技术扩增,将扩增的产物纯化、连入pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α...     

卡地腐霉Pr1蛋白酶cDNA片段的分离和克隆

目的：分离和克隆灭蚊真菌卡地腐霉（Pythium carolinianum(Pr1)蛋白酶（subtilisin-like protease)的cDNA片段。方法：用1%的几丁质悬液诱导培养卡地腐霉菌丝30h，然后按下述流程操作；抽提菌丝的总RNA；逆转录合成cDNA第一链；根据Pr1的保守氨基酸序列设计合成一对简并引物，以cDNA第一链为模板，用MOPAC方法（Mixed oligonucleotides primed amplification of cDNA)扩增cDNA；将扩增产物纯化，连入pGEM-T载体，转化大肠杆菌DH5α用于测序。结果：所获片段中，1个530bp的cDNA片段与枯草杆菌类蛋白酶基因有较高的相似性，尤其与真菌Aphanomyces astaci(卵菌纲，水霉目）的Pr1在核苷酸序列及翻译得到的氨基酸序列水平有较高的相似性。分别为59%和49%，此序列已登录Genbank数据库，检索号；AF499006，P.carolinianum与A.astaciPr1部分cDNA序列的比对亦登录Genbank数据库，检索号：AY094976，AY094977。结论：这-DNA片段可能是卡地腐霉Pr1蛋白酶的一条cDNA片段。更进一步的工作是设法获得全长cDNA片段，并加以证实。     

逆转录聚合酶链反应检测小鼠MN/CA9基因的表达

目的：克隆、分析ICR小鼠MN/CA9基因序列,并检测MN/CA9基因在ICR小鼠各组织中的表达。方法：分别取ICR小鼠小肠、肝、肾、脾、胃、胸腺、心脏、卵巢、肺、胰腺、肌肉、皮肤、子宫和膀胱新鲜组织,采用胍尼啶异硫氢酸呱酚氯仿提取法（GIT）提取总RNA。合成cDNA的第1链和第2链,连接EcoRⅠ载体,EcoRⅠ末端磷酸化,XhoⅠ消化,将cDNA构建到ZAP express vector进行包装、种植培养,筛选、切取噬菌体,使用引物扩增后进行DNA 序列分析。用逆转录聚合酶链反应检测小鼠MN/CA9基因在上述组织中的表达。结果：使用人类MN/CA9基因片段做探针,用放射性同位素 ³² P 标记探针,筛选1.47×10³大肠埃希菌落,杂交后发现一阳性cDNA信号,序列测定确定其含1 671 bp核苷酸序列（已在GenBank 登录,登录号AB086322）,这个序列与人类的MN/CA9 (基因序列号Z54349)有69.1％的同源性。在引物P521-P1193区间,MN/CA9基因在小鼠小肠、子宫、肌肉、胰腺、心脏、肺、胸腺、脾、肾、卵巢、胃和膀胱组织表达均较强,在皮肤和肝脏不表达。结论：MN/CA9基因在ICR小鼠组织中的表达与人类基本相同,可以用ICR小鼠进行MN/CA9基因的研究。     

杜氏盐藻cDNA文库的构建及KCBP基因的克隆

目的：构建杜氏盐藻cDNA文库并从该文库中筛选类驱动蛋白钙调素结合蛋白（KCBP）基因cDNA序列。方法：取对数生长期的杜氏盐藻细胞,提取总RNA并分离纯化mRNA,反转录合成双链cDNA,连接到pAP3neo载体上,采用电转化法将重组质粒转化大肠杆菌DH10B。计算平板上单菌落数,测定文库的滴定度和重组率。运用PCR法筛选含有KCBP基因特异片段的质粒。结果：文库滴定度为5.6×106pfu/mL,重组率在90%左右,插入片段长度在0.4～6.0kb,平均长度为1.9kb。利用PCR法从该文库中筛选到了含有新基因KCBP特异片段的单菌落,经测序与cDNA末端快速扩增（RACE）-PCR获得的杜氏盐藻KCBP基因cDNA序列相符,此序列属于kine-sin-14家族。结论：成功构建杜氏盐藻cDNA文库,并从该文库筛选出一个kinesin样cDNA序列。     

桂北五步蛇金属蛋白酶原基因800bp片段的克隆和序列分析

目的：扩增桂北五步蛇金属蛋白酶原基因,并对其进行序列分析,方法：从广西桂北山区五步蛇毒腺中抽提蛇毒总RNA,采用一步法（RT－PCR和PCR在同一试管内进行）扩增金属蛋白酶原基因,对其进行电泳检测,得到3条特异的DNA条带,大小分别为1．5kb,1.3kb,和800bp,利用平端连接方法将800bp克隆至pGEM-T载体,挑选白色菌落,用酶切和PCR法对其进行鉴定,提取阳性菌落进行测序并推导编码的氨基酸序列。结果：信号肽和前肽和已报道的皖南五步蛇金属蛋白酶很相似。同源性为97．9％,但仅含有部分金属蛋白酶成熟肽的氨基酸序列。结论：推测此800bp片段为广西五步蛇金属蛋白酶原基因的一部分。     

桂北五步蛇金属蛋白酶原基因1137bp片段的克隆和序列分析

目的：克隆桂北五步蛇金属蛋白酶原基因,并对其进行序列分析。方法：采用一步法抽提广西桂北山区五步蛇蛇毒总RNA,经RT-PCR扩增纤溶酶金属蛋白酶原基因,将扩增产物克隆至pGEM-T Easy载体,挑选白色菌落。用酶切和PCR法对其进行鉴定。直接利用纯化PCR产物或提取阳性菌落进行测序并推导其编码的氨基酸序列。结果：RTPCR和PCR扩增得到一约1137bp产物,并将其克隆及测序。结论：和已报道的皖南五步蛇纤溶酶金属蛋白酶氨基酸序列相比较,二者之间有91％的同源性。     

斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段的克隆和序列分析

目的：克隆斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段，获得其序列，并进行序列分析。方法：利用简并引物，进行RT-PCR，扩增斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱氨酸蛋白酶cDNA片段。TA克隆装入pUCm-T载体，进行鉴定、测序；利用DNASIS程序推导其所编码的氨基酸序列，并与相关虫种半胱氨酸蛋白酶进行氨基酸序列的同源性分析。结果：RT-PCR扩增出了-500bp左右的cDNA片段，对阳性克隆测序后获得其核酸序列，长498bp。推导出的氨基酸序列长166；氨基酸序列的同源性分析显示，该序列与相关虫种半胱氨酸蛋白酶存在着很高的同源性，组成半胱氨酸催化三联体的半胱氨酸、组胺酸和天冬酰胺残基高度保守。结论：本实验克隆获得了斯氏狸殖吸虫囊蚴半胱近酸蛋白酶cDNA片段。     

桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶基因的克隆和序列分析

目的：克隆桂北五步蛇纤溶酶金属蛋白酶基因,并对其进行序列分析。方法：从桂北五步蛇毒腺中抽提总ＲＮＡ,采用一步法（ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ在同一管内进行）扩增出纤溶酶金属蛋白基因,利用平端连接的方法将ＰＣＲ扩增产物克隆至ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体,挑选白色菌落,用酶切和ＰＣＲ法对其进行鉴定,直接利用纯化ＰＣＲ产物进行测序或提取阳性菌落进行测序。结果：ＲＴ－ＰＣＲ和ＰＣＲ扩增得到一６００ｂｐ产物,并被克隆     

长白山白眉蝮蛇毒类凝血酶的分离纯化

目的 建立一种分离纯化长白山白眉蝮蛇蛇毒类凝血酶的方法.方法 将长白山白眉蝮蛇蛇毒溶解后离心,取上清进行阴离子交换层析,所得蛋白进行分子筛层析.提纯的蛋白用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定及相对分子量测定.测定酶的N-末端氨基酸序列.结果 经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳呈单一区带,相对分子量为35.5kDa.N-末端氨基酸序列分析表明其N-末端氨基酸序列与立止血中巴曲酶N-末端氨基酸序列基本一致.提取率约为5mg类凝血酶/g蛇毒.结论 用上述方法可制得高纯度的类凝血酶.     

尖吻蝮蛇毒素组双向电泳和二维液相色谱研究

目的：初步研究尖吻蝮蛇蛇毒的蛋白质组分及其活性。方法：利用双向电泳和二维色谱（IEX＋HPLC）分析尖吻蝮蛇蛇毒蛋白质组，并制备分离样品研究蛇毒中酶和毒素活性。结果：双向电泳分离检测得到128种蛋白质，其中24种蛋白质丰度较高，73种为酸性蛋白质，加种为碱性蛋白质。二维色谱展现58种蛋白质，其中26种蛋白质丰度较高。初步活性研究表明，尖吻蝮蛇蛇毒蛋白质多数属于丝氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和磷脂酶A2家族，部分蛋白质可能属于去整合素家族。结论：双向电泳和二维色谱相互结合．有效分析了尖吻蝮蛇毒的蛋白盾组成和生物活性．     

梅花鹿两个管家基因部分 cDNA序列的克隆

目的 :开发吉林双阳梅花鹿的基因资源 ,在分子水平上揭示鹿药材的药理作用。方法 :从鹿脾脏细胞中提取总 RNA,逆转录成 c DNA,构建 c DNA质粒文库 ,从中克隆 2个管家基因并进行序列分析。结果 :成功克隆的管家基因的一个核酸序列及其对应的氨基酸序列与人、大鼠和小鼠蛋白酶体 α3型亚单位 c DNA序列及对应的编码氨基酸序列高度同源 ;另一个管家基因的序列及对应的氨基酸序列与人、大鼠和小鼠转录激活因子 - 4部分 c DNA序列及对应的编码氨基酸序列高度同源。结论 :新发现的双阳梅花鹿蛋白酶体α3型亚单位部分 c DNA序列和转录激活因子 - 4部分c DNA序列 ,已在 Genbank中登录 ( BG67371 3,BG67371 4 )。     

尖吻蝮蛇蛇毒纤溶酶的分离纯化及氨基酸序列测定

目的:从尖吻蝮蛇蛇毒中分离纯化出高纯度的纤溶酶并对其进行初步性质研究和氨基酸序列分析。方法:采用DEAE-Sepharose FF离子交换和两次Superdex75PG凝胶过滤,从尖吻蝮蛇蛇毒中纯化出可直接溶解纤维蛋白原的蛋白酶。结果:分离到的纤溶酶相对分子质量为25kD,HPLC分析纯度在97%以上,氨基酸序列分析其N末端为MSTEF QRYME IVVNHS MVKKY NGDSD KIKAW。结论:采用此工艺可从尖吻蛇毒中分离出高比活的纤溶酶,为进一步研究其药理作用奠定了基础。