山羊骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导后成骨分化相关基因表达的变化

目的:研究山羊骨髓基质干细胞向成骨细胞诱导后成骨分化相关基因ALP、OCN、COL I mRNA表达水平的变化.方法:采用全骨髓培养法培养骨髓基质干细胞,使用成骨条件培养液体外诱导成骨细胞,通过细胞形态学观察、免疫组化染色、钙结节等检测手段进行成骨细胞鉴定,采用RT-PCR和实时定量PCR检测诱导2周后骨髓基质干细胞ALP、OCN、COL Ⅰ的表达水平,未诱导的骨髓基质干细胞作为对照组.结果:通过成骨细胞鉴定,骨髓基质干细胞成功诱导分化为成骨细胞:OCN和COL Ⅰ基因存细胞诱导组表达上调,ALP基因表达在诱导组和未诱导组间无显著差异.结论:成功诱导山羊BMSCs向成骨细胞分化,成骨分化相关基因在诱导后为适应成骨细胞的功能发生变化.     

人脂肪干细胞体外向成骨细胞定向诱导分化的实验研究

目的:探讨人脂肪干细胞(hASCs)的分离方法、体外增殖能力及定向诱导分化为成骨细胞的潜能.方法:从脂肪抽吸物中分离、培养具有多向分化潜能的脂肪干细胞,比较原代(P0)及传代第1、2、5代(P1、P2、P5)细胞的生长曲线.实验组取P2细胞.应用成骨诱导液向成骨细胞定向诱导分化,并以未诱导组为对照组,利用ALP染色,von Kossa染色、免疫荧光检测、RT-PCR等方法对细胞成骨潜能进行评价.结果:传代细胞较原代细胞增殖速度快.P1、P2、P5均具有一些共同特征,传代培养的潜伏期约为24 h,传代培养细胞的对数增殖期约为2～3 d,接种后第4～5天进入平台期;细胞诱导14d后,实验组ALP染色呈阳性反应,对照组阴性;von Kossa染色.实验组出现深棕色结节状沉积,且随诱导时间增加而加深,对照组无结节状沉积出现;免疫荧光检测,实验组和对照组均表达Ⅰ型胶原,实验组骨钙素(OCN)、骨桥蛋白(OPN)检测为阳性,对照组为阴性或弱阳性;RT-PCR检测表明,实验组诱导14d时有ALP、Osteopontin表达,对照组阴性;实验组、对照组及成骨细胞均有Ⅰ型胶原阳性表达.结论:hASCs在体外培养条件下生长良好,P2细胞在诱导培养下可向成骨细胞分化,为以hASCs为种子细胞构建组织工程骨奠定了基础.     

人牙髓干细胞体外成骨向分化的实验研究

目的：探讨人牙髓干细胞在体外成骨向分化潜能。方法：用免疫磁珠法分选人牙髓干细胞并检测其干细胞表面标志物Stro-1、CD29、CD34、CD44、CD45、CD90、CD105的表达。体外诱导人牙髓干细胞向成骨细胞分化,通过碱性磷酸酶染色和茜素红染色观察成骨诱导后细胞的成骨活性和矿化结节形成情况,通过real-time PCR分析成骨相关基因ALP、col I、RunX2、OC的表达,未成骨诱导细胞作为对照。结果：人牙髓干细胞阳性表达间充质干细胞表面标志物Stro-1、CD29、CD44、CD90、CD105,阴性表达造血干细胞表面标志物CD34、CD45。成骨诱导5d、7d、14d ALP染色阳性,21d茜素红染色仅诱导组可见明显钙结节形成,对照组为阴性。成骨相关基因ALP、RunX2和Col I mRNA在成骨诱导早期高表达,OC mRNA在成骨诱导14d表达开始逐渐升高。结论：经磁珠分选纯化的人牙髓干细胞在成骨诱导条件下可向成骨细胞分化,形成钙盐沉积和矿化结节,ALP、col I、RunX2、OC参与了成骨向分化的过程。     

柚皮苷对犬骨髓基质细胞体外增殖及成骨分化的影响

目的:研究犬骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)在柚皮苷诱导下定向成骨及成骨分化能力。方法:抽取犬骨髓,贴壁法体外培养,流式细胞仪鉴定,加入不同浓度柚皮苷(1×10-5、1×10-6、1×10-7、1×10-8、1×10-9 mol/L)诱导,以CCK-8检测药物毒性,定量检测碱性磷酸酶、von Kossa检测钙结节形成。采用SPSS20.0软件包对数据进行统计学分析。结果:经流式细胞仪检测,CD34、CD45低表达、CD90高表达分别为0.126%、0.075%和95.4%;柚皮苷浓度在10-6、10-7 mol/L时,能明显促进细胞增殖;经柚皮苷诱导后,碱性磷酸酶含量显著提高,其中,浓度为10-6 mol/L时,ALP相对值最高(P<0.05);von Kossa钙结节检测呈阳性。结论:犬骨髓基质细胞在柚皮苷诱导下能分化为成骨细胞。柚皮苷浓度为10-6 mol/L时,能明显促进骨髓基质细胞的增殖及分化。     

骨髓基质干细胞诱导内皮细胞与自体骨髓基质干细胞低氧条件下培养后的成骨能力

目的:探讨骨髓基质干细胞(BMSCs)诱导内皮细胞(ECs)与自体BMSCs低氧条件下联合培养对BMSCs成骨能力的影响.方法:体外分离培养兔BMSCs并向ECs诱导培养,用CD34免疫细胞化学染色鉴定内皮细胞表型:实验分组为BMSCs常氧成骨诱导培养组,BMSCs低氧成骨诱导培养组,BMSCs+ ECs常氧成骨诱导联合培养组BMSCs+ECs低氧成骨诱导联合培养组,持续培养7d,前6d应用PNPP法每天固定时间测定碱性磷酸酶(ALP)活性并作统计学分析;茜素红染色观察第7d矿化结节形成情况.低氧组为1.0％O2浓度.采用SPSS11.0软件包对数据进行方差分析和q检验.结果:BMSCs在一定诱导条件下可诱导为ECs,CD34免疫细胞化学染色为阳性;统计学分析表明,BMSCs+ ECs低氧成骨诱导联合培养组的ALP活性表达显著高于其他3组(P＜0.05).只有BMSCs+ ECs低氧成骨诱导联合培养组有钙化结节形成,茜素红染色呈橘红色.结论:在一定时间内,由BMSCs诱导来源的ECs与自体BMSCs低氧条件下联合培养,BMSCs的成骨活性可显著提高.     

糖基化终末产物对人牙周膜干细胞骨向分化能力影响的研究

目的:探讨糖基化终末产物(AGEs-HSA)对人牙周膜干细胞(HPDLSC)骨向分化能力的影响。方法:体外组织块法和有限稀释法克隆化培养牙周膜干细胞,流式细胞仪检测牙周膜细胞表型分子CD44、CD146、stor-1、CD90,对其进行干细胞鉴定,将培养出的牙周膜干细胞与不同浓度的AGE-HSA共同培养,并矿化诱导后茜素红染色观察钙结节形成情况、碱性磷酸酶染色观察ALP活性、实时定量聚合酶链反应(real timePCR)检测成骨基因表达情况。结果:流式细胞仪细胞表型分析CD44、CD146、stor-1、CD90表达呈阳性。成骨诱导21 d后茜素红染色,对照组和实验组均出现不同程度的矿化结节,定量分析显示1、10、100、200μg/mLAGEs组矿化能力均比对照组低,差异均有统计学意义(P<0.05);不同浓度的实验组之间矿化能力均有统计学差异(P<0.05),且随着AGEs浓度的升高,矿化能力逐渐降低。成骨诱导7 d ALP染色比较发现各实验组均比对照组减弱。成骨诱导1周后RT-PCR检测各实验组的成骨基因ALP、Runx-2、Col-1、Runx-2 mRNA表达水平均较对照组低,差异有统计学意义(P<0.05);不同浓度的实验组之间各成骨基因的表达也有统计学差异(P<0.05)。结论:AGEs能抑制HPDLSC的骨向分化,并在一定范围内呈浓度依赖性。     

人转化生长因子-β1基因转染对人牙龈成纤维细胞成骨特性的影响

目的观察并评价基因转染后牙龈成纤维细胞（GF）表达外源目的基因人转化生长因子-β1（hTGF-β1）对其分化、成骨特性的影响。方法采用碱性磷酸酶（ALP）活性检测方法检测转染对GF ALP活性的影响,免疫组化染色及图像分析评价基因转染后骨钙素（OC）、骨桥素（OPN）、骨涎蛋白（BSP）、骨结合素（ON）含量的变化,体外矿化结节形成实验检测转染后细胞成骨特性的变化。结果转染后GF的ALP活性较未转染组有显著的提高（P<0.05）,并且与牙周膜成纤维细胞（PDLCs）的ALP活性接近（P>0.05）。OC含量检测显示转染后GF的OC含量与未转染组和PDLCs组相比,其差异均无统计学意义（P>0.05）。免疫组化染色后,转染组GF所表达的OPN、ON、BSP含量均高于未转染组GF（P<0.05）,而与PDLCs间差异无统计学意义（P>0.05）。第21天和第24天时,在矿化液作用下PDLCs及转染GF在倒置显微镜下可见致密的结节形成,von Kossa染色可见紫色的矿化结节形成。未转染GF未见结节形成。而转染GF在未经矿化液诱导情况下,虽出现显著的细胞聚集,但von Kossa染色未见紫色矿化结节形成。结论转染pcDNA3-hTGF-β1后的GF可表达一定的成骨细胞特性,但这种成骨特性有限。     

Ⅰ型骨质疏松症大鼠骨髓基质细胞体外培养及分化研究

目的　研究在构建的Ⅰ型骨质疏松症大鼠动物模型中,骨髓基质细胞( BMSCs)的生物学特性及其成骨和 成脂分化能力。方法　16只6月龄雌性SD大鼠随机分为实验组和对照组,实验组行双侧卵巢切除建立Ⅰ型骨质 疏松动物模型,对照组切除卵巢周围少量脂肪组织。术后3个月处死动物,非连续密度梯度离心分离骨质疏松大 鼠的BMSCs,传代后分别在成骨及成脂培养基中诱导培养14 d,观察细胞形态,通过组织特染对BMSCs的成骨、成脂 表型进行鉴定,计数阳性染色细胞百分比。结果　构建的Ⅰ型骨质疏松大鼠模型大鼠体重及整体股骨骨矿物质密 度(BMD)与对照组比较差异有显著性(P<0.01 );诱导培养后两组大鼠BMSCs碱性磷酸酶(ALP )、Von Kossa′s染色 和油红O染色实验阳性,且两组细胞阳性染色率无明显差别(P>0.05)。结论　本实验成功建立了大鼠骨质疏松 症模型,骨质疏松症大鼠BMSCs保持分化能力。     

大鼠骨髓间充质细胞诱导成骨的体内外研究

目的研究大鼠骨髓间充质细胞(BMSCs)体内外成骨的能力。方法分离大鼠BMSCs,将原代细胞分别应用普通培养基(CM)、成骨诱导培养基(OM)诱导培养。应用碱性磷酸酶(ALP)活性和钙结节染色法检测体外成骨分化能力。建立裸鼠成骨模型,测定体内成骨能力。结果 OM组可明显诱导BMSCs成骨分化,表现出高水平的ALP活性和基质矿化能力。OM加骨粉组裸鼠培养8周后,镜下观察到广泛的新骨形成,而单纯OM组或骨粉组未见成骨。结论 OM可明显诱导BMSCs体外成骨分化,与骨粉联合应用能诱导体内异位骨形成。     

富血小板血浆对大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨影响的实验研究

目的:探讨富血小板血浆(platelet-rich plasma,PRP)对大鼠骨髓间充质干细胞(rat bonemarrowmesenchymal stem cells,rBMSC)体外成骨能力的影响。方法:体外分离、培养rBMSC,经细胞表面标记物检测和体外诱导分化鉴定后,分别采用MTT法检测PRP对细胞增殖活性的影响;细胞化学法检测PRP对成骨诱导后rBMSC碱性磷酸酶(alkaline phosphate,ALP)活性的影响;RealTime-PCR检测PRP对细胞成骨分化指标Col-3、OPN mRNA表达水平的影响;扫描电镜观察PRP对rBMSC在Bio-Oss上粘附的影响。结果:rBMSC传代后细胞生长状态相对稳定,呈梭形;细胞表面标记物CD29阳性率为88.2%,CD90阳性率为98%,CD34细胞阴性率为2.8%,CD45细胞计数阴性率为2.7%;成骨诱导21 d后,茜素红染色可见明显矿化结节;成脂诱导14 d后,油红O染色可见红色脂滴形成。MTT检测,10%PRP组在培养1、3、5、7、9 d各时间点的OD值均显著高于空白对照组(P<0.05)。ALP染色显示,无论是诱导培养7 d还是14 d,成骨诱导液+PRP组的ALP活性均明显高于单纯成骨诱导液组,差异有统计学意义(P<0.05);另外,各组不同诱导培养时间点相比还发现,无论是实验组还是对照组,在诱导7 d时,ALP活性均较低;而在14 d,ALP的活性明显升高。RealTime-PCR检测显示,单纯10%PRP诱导培养7 d和14 d后细胞Col-3、OPN mRNA水平虽稍低于成骨诱导液组,但明显高于空白对照组,而10%PRP联合成骨诱导液诱导培养7 d和14 d的Col-3、OPN mRNA的表达量更高,与其他各组相比差异均有统计学意义(P<0.05)。另外各组诱导培养14 d的Col-3、OPN mRNA水平显著高于相应的7 d组(P<0.05)。扫描电镜结果显示PRP明显促进rBMSC在Bio-Oss骨粉上的粘附与伸展。结论:PRP对rBMSC的增殖、成骨分化,以及在生物材料上的粘附能力均具有明显的促进作用。     

小肠黏膜下层组织膜与骨髓基质干细胞联合培养的实验研究

目的:检测骨髓基质干细胞(BMSCs)与小肠黏膜下层(SIS)复合培养的生物相容性及成骨能力。方法:山羊BMSCs体外成骨诱导至第3代,接种到预湿的SIS上复合培养,以单纯BMSCs相同条件下培养作为对照。通过相差显微镜、扫描电镜及改进的HE染色等方法观察细胞在材料中的生长情况。MTT法检测BMSCs在材料上的增殖活性,碱性磷酸酶(ALP)活性测定及裸鼠皮下异位成骨实验评价其成骨能力,采用配对资料t检验进行统计学处理。结果:扫描电镜及组织学观察发现,细胞材料复合后,BMSCs在SIS上能够良好地粘附和增殖;定量法检测碱性磷酸酶活性显示,细胞加材料组OD值为0.683±0.044,单纯细胞组OD值为0.696±0.039,ALP及MTT测定结果均证实,BMSCs细胞活性及成骨性能不受SIS的影响,与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。体内异位成骨实验表明,BMSCs/SIS复合物植入体内后成骨良好,以软骨内成骨方式为主。结论:SIS对BMSCs的生长和成骨功能无影响,具有良好的细胞相容性,且作为一种脱细胞基质的天然膜性材料,SIS具有构建组织工程化骨膜的可行性。     

骨髓基质细胞诱导分化修复髁突软骨面缺失的实验研究

目的:采用骨髓基质细胞(BMSCs)体内修复髁突软骨全层缺失。方法:15只山羊,9只作为实验组,将BMSCs和少量软骨细胞(7:3比例混合)按5×107/mL与生物可降解材料复合后,植入山羊髁突软骨全层缺失处;对照组6只山羊,髁突软骨全层缺失区植入支架材料,分别于术后4、8、12周每个时间段取材3只实验动物,2只对照组动物;2组分别用HE染色、Ⅱ型胶原分泌的免疫组化法进行评价。结果:实验组术后4周,山羊髁突软骨缺失区能形成成熟的软骨组织,12周时软骨未退变。对照组不能形成成熟的软骨组织。结论:骨髓基质细胞在自体软骨细胞基质的诱导下,可以修复山羊颞下颌关节髁突软骨面全层缺失。     

表面经喷砂和酸蚀及羟基磷灰石涂层的TA2纯钛种植体对富血小板血浆体外骨诱导能力的影响

目的以表面经喷砂和酸蚀(SLA)及羟基磷灰石(HA)涂层双重处理的TA2纯钛种植体(HA/SLA-TA2)为支架材料,探讨其对富血小板血浆(PRP)体外诱导骨髓基质细胞(BMSCs)向成骨细胞分化能力的影响。方法PRP分别作用于常规培养的BMSCs(对照组)和与HA/SLA-TA2联合培养的BMSCs(实验组),通过扫描电镜观察BMSCs在HA/SLA-TA2表面的生长情况,并对两组细胞的增殖指数、碱性磷酸酶活性、骨钙素含量进行比较。结果实验组细胞生长状态良好,具有成骨细胞特点,其细胞增殖指数于联合培养第5天起明显高于对照组(P<0.05),碱性磷酸酶活性以及骨钙素含量分别于联合培养第9、13天起明显高于对照组(P<0.01)。结论HA/SLA-TA2是种植体表面骨组织工程较理想的支架材料,BMSCs与HA/SLA-TA2联合培养后,可增强PRP诱导其向成骨细胞分化的能力。     

富血小板血浆PRP的体外骨诱导作用研究

目的 :探讨在体外培养中富血小板血浆 (Platelet -RichPlasma ,PRP)对骨髓基质细胞诱导成骨的影响。方法 :从自体静脉血中提取PRP ,配制成条件培养液 ,并作用于培养状态的骨髓基质细胞 ,染色检测细胞碱性磷酸酶表达情况 ,钙化结节形成率 ,放免法测定培养液中骨钙素的含量。结果 :骨髓基质细胞经诱导培养后 ,碱性磷酸酶、骨钙素表达明显增加。结论 :体外培养时 ,PRP可促进骨髓基质细胞的成骨分化。     

PLA-PEG复合支架材料体外细胞相容性的实验研究

目的:探索新型PLA-PEG(polylactic acid-polyethylene glycol block copolymers)复合支架材料体外细胞相容性。方法:支架材料分为实验组A(PEG/PLA为16∶0)、实验组B(PEG/PLA为13∶0)、对照组C,单纯聚乳酸(polylacticacid,PLA)。贴壁法培养兔骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells,BMSCs),诱导生成成骨细胞,接种于支架材料上。通过观察种子细胞在支架材料上的吸附迁移、生长增殖情况,验证各组细胞材料复合体的成骨活性,比较分析不同支架材料之间的差异。结果:兔成骨细胞在新型PLA-PEG三维支架材料表面分布较为均匀,生物学行为活跃。实验组A与B的细胞粘附及增殖能力均强于对照组(P<0.05)。结论:三种支架均具有较好的细胞相容性,但实验组A与B的细胞相容性更好,更适宜作为支架材料与成骨细胞共同培养,以获得具有成骨能力的三维立体结构组织工程骨。     

不同方法诱导的骨髓基质细胞用于修复山羊髁突软骨缺失的实验研究

目的:比较用诱导因子诱导及用部分成体软骨细胞诱导的骨髓基质细胞(BMSCs)复合生物材料修复山羊颞下颌关节髁突软骨全层缺失的效果.方法:取山羊6只,分为2个实验组及1个对照组,每组2只.实验Ⅰ组植入经诱导因子(TGF-131、IGF-1、地塞米松)诱导的BMSCs与支架(PIuronic F-127溶胶)复合物,实验Ⅱ组植入软骨细胞-BMSCs(按3:7比例混合)的细胞-支架复合物,对照组仅植入支架材料.于术后8周取材,进行颞下颌关节软骨面缺失修复的大体观察、修复组织的HE染色、Ⅱ型胶原分泌的免疫组化染色.结果:术后8周实验Ⅱ组髁突软骨缺失区由软骨样组织修复.HE染色及免疫组化染色结果均提示修复组织为成熟的软骨组织.而实验Ⅰ组及材料对照组缺损区仅由少量的纤维性组织修复,不能形成成熟的软骨组织.结论:骨髓基质细胞在自体软骨细胞基质的诱导下,可以修复山羊髁突软骨面全层缺失,二维培养诱导后的BMSCs在山羊髁突软骨缺失区难以达到修复作用.     

骨髓间充质干细胞对关节盘细胞的作用研究

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSC）对颞下颌关节盘软骨细胞的作用。方法大鼠骨髓来源的间充质干细胞三向分化鉴定其干性,大鼠关节盘软骨细胞Ⅱ型胶原免疫荧光染色,收取BMSC培养24h上清液制作条件培养基。CCK-8检测条件培养基对关节盘软骨细胞细胞增殖影响,反转录聚合酶链反应（RT-PCR）分析条件培养基培养7、14d关节盘软骨Ⅰ、Ⅱ、X型胶原基因表达。两组比较采用独立样本t检验,进行统计学分析。结果获取的大鼠BMSC具备三向分化能力．大鼠关节盘软骨细胞Ⅱ型胶原免疫荧光表达。CCK-8结果显示,培养48h后条件培养基组细胞增殖速度明显加快,差异具有统计学意义（t=10．75,P〈0．05）;RT-PCR结果显示：条件培养基组7d时抑制X型胶原表达（t=2．586,P〈0．05）,14d时促进Ⅱ型胶原表达（t=6．501,P〈0．05）。结论大鼠BMSC分泌物促进关节盘软骨细胞增殖,抑制关节盘软骨细胞肥大发挥保护作用。     

低氧诱导因子-1α对骨髓间充质干细胞成骨分化与血管生成相关因子的影响

目的 探讨低氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)在SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)中对成骨分化和血管生成相关细胞因子的影响.方法 分离并培养BMSCs,采用流式细胞术进行鉴定;分别构建上调和下...     

葛根素诱导人骨髓间充质干细胞成骨分化的研究

［摘要］ 目的 通过体外实验探讨不同浓度的葛根素诱导骨髓间充质干细胞（bone marrow-mesenchymal stem cells,BMSCs）骨组织分化的作用以及与Notch信号通路之间的关系。方法 根据葛根素的浓度,实验分为6组。取3周的SD大鼠分离培养BMSCs,传至第3代后接种细胞,改用不同分组的培养基。继续培养2~4周,测定碱性磷酸酶（ALP）与骨钙素（OC）的含量,评价葛根素的体外诱导成骨能力。用Elisa试剂盒测定Delta样配体4 （DLL4）的含量,评估葛根素的促成骨作用与Notch信号通路的关系。〖HTH〗结果〖HTSS〗 不同浓度组的细胞出现与典型成骨细胞相似的形态特征和生物学特性,ALP、OC和DLL4含量增加,但以1×10-5 mol/L组显著高于对照组,比其他浓度组要高,但是差异无统计学意义。〖HTH〗结论〖HTSS〗 葛根素能有效促进BMSCs向成骨方向分化,以10-5 mol/L浓度效果最佳,其作用机制可能与Notch信号通路有关。     

大鼠同种异体骨髓间充质干细胞联合Bio-Oss骨粉-bFGF复合物促进拔牙窝愈合的micro-CT研究

目的:观察以Bio-Oss骨粉bFGF支架联合大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)植入大鼠拔牙窝后在牙槽窝愈合过程中对牙槽骨微结构的影响.方法:取3周龄SD大鼠股骨全骨髓,自然贴壁分离BMSCs.选取36只6周龄SD大鼠,拔除上颌后牙,立即植入不同材料.按植入材料分为4组,即复合物组植入BMSCs联合Bio-Oss骨粉b...