联合应用地塞米松和维甲酸诱导兔骨髓基质细胞向成骨方向的转化

目的:观察维甲酸和地塞米松对兔骨髓基质细胞的成骨诱导影响,探讨二者联合诱导兔骨髓基质细胞向成骨细胞分化的可能性和适当条件,使兔骨髓基质细胞向成骨诱导得以优化,从而为临床治疗骨缺损提供实验基础。方法:实验于2005-12/2006-3在锦州医学院附属第一医院骨科实验室完成。①体外培养兔骨髓基质干细胞。②用不同的诱导剂将其向类成骨细胞诱导。实验分非诱导组(用DMEM培养基培养),地塞米松诱导组(培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠和维生素C),维甲酸诱导组(培养基中加入维甲酸),地塞米松与维甲酸联合诱导组(培养基中加入地塞米松、β-甘油磷酸钠、维生素C和维甲酸)。③通过倒置相差显微镜对细胞的形态进行观察;于第4,6,8,10,12天定量检测其分泌的碱性磷酸酶;应用原位杂交技术检测Ⅰ型胶原的表达情况。结果:①原代和传代培养时不同组别兔骨髓基质细胞的生长情况:地塞米松诱导组细胞形态向类成骨细胞转化,维甲酸诱导组细胞与神经干细胞类似,地塞米松与维甲酸联合诱导组细胞与地塞米松诱导组细胞形态变化大体一致,但细胞更饱满,多角形细胞比例更高,部分区域细胞呈现漩涡状分布。②各组碱性磷酸酶活性检测结果:非诱导组碱性磷酸酶表达量低,随时间略有增加;地塞米松诱导组碱性磷酸酶表达呈曲线升高[6,8,10,12d依次为(265.9±47.3),(445.4±69.4),(650.3±52.0),(703.6±62.5)nkat/L];维甲酸诱导组基本无碱性磷酸酶表达;地塞米松与维甲酸联合诱导组碱性磷酸酶表达趋势与地塞米松诱导组相似,但绝对值有所增高[6,8,10,12d依次为(355.4±62.2),(631.3±84.4),(925.0±69.0),(1039.5±85.2)nkat/L]。③各组原位杂交技术检测Ⅰ型胶原结果:地塞米松诱导组和地塞米松、维甲酸联合诱导组检测Ⅰ型胶原结果发现胞浆内可见大量棕黄色颗粒,非诱导组与维甲酸诱导组为阴性。结论:适当浓度地塞米松可成功的将兔骨髓基质细胞向成骨细胞诱导,维甲酸与地塞米松联合诱导可使成骨能力进一步加强,表现为碱性磷酸酶表达明显增高,并表达Ⅰ型胶原,具体浓度条件有待进一步研究。     

骨髓基质细胞分化状态对腺病毒介导骨形态发生蛋白2表达效应的影响

目的：利用骨形态发生蛋白2腺病毒转染向成骨细胞分化的骨髓基质细胞，在体外观察骨形态发生蛋白2的表达量和反应成骨细胞特性的指标变化。方法：实验于2002-04／12在北京大学第三医院中心实验室进行。6周龄雄性BALB／c小鼠60只用于骨髓基质细胞提取，小鼠骨髓基质细胞分别用Dulbecco改良的Eagle培养基液和骨诱导培养基（含地塞米松10^-8mol／L、L广抗坏血酸50mg／L、β-甘油磷酸钠10mmoL／L Dulbecco改良的Eagle培养基液）培养。①不同量骨形态发生蛋白2腺病毒转染骨髓基质细胞的碱性磷酸酶比活性的比较：取原代培养的骨髓基质细胞，分别加入转染指数25，50．100．200骨形态发生蛋白2腺病毒，以不加骨形态发生蛋白2腺病毒的骨髓基质细胞作为对照。6d后收集细胞，测定碱性磷酸酶活性。②骨髓基质细胞诱导分化后转染骨形态发生蛋白2腺病毒的碱性磷酸酶比活性的比较：实验分5组：骨髓基质细胞组，用Dulbecco改良的Eagle培养基培养9d；骨诱导培养3d组，骨诱导培养3d改用Dulbecco改良的Eagle培养基培养6d；骨诱导培养9d组，骨诱导培养9d；骨诱导培养3d＋骨形态发生蛋白2腺病毒组，骨诱导培养3d，加入转染指数50的骨形态发生蛋白2腺病毒作用6d；骨形态发生蛋白2腺病毒组，用Dulbecco改良的Eagle培养基培养3d，加入同量骨形态发生蛋白2腺病毒作用6d。收集细胞，测定碱性磷酸酶比活性。③骨形态发生蛋白2与骨桥蛋白检测：采用免疫组织化学染色与蛋白印迹方法。实验采用拉丁方设计。结果：应用骨诱导培养基或转染骨形态发生蛋白2腺病毒均使细胞碱性磷酸酶比活性明显增加（P〈0．05）。①不同量骨形态发生蛋白2腺病毒转染骨髓基质细胞碱性磷酸酶比活性的比较：骨形态发生蛋白2腺病毒（转染指数=50）组碱性磷酸酶比活性显著高于骨髓基质细胞组和骨形态发生蛋白2腺病毒（转染指数=25，100，200）组[（7658．53&;#177;1600．32）比（1932．89&;#177;665．30），（4311．53&;#177;1108．89），（5360．90&;#177;1374．61）．划内（2661．86&;#177;653．46）nkat／（g&;#183;L），P〈0．011。②骨髓基质细胞诱导分化后转染骨形态发生蛋白2腺病毒的碱性磷酸酶比活性的比较：骨诱导培养3d＋骨形态发生蛋白2腺病毒（转染指数=50）组与骨形态发生蛋白2腺病毒（转染指数=50）组差异无显著性（P〉0．05），显著高于骨诱导培养3d组和骨诱导培养9d组（P〈0．05）。③骨形态发生蛋白2和骨桥蛋白检测结果：骨诱导培养3d＋骨形态发生蛋白2腺病毒组两指标表达量均最高。结论：单纯用诱导Dulbecco改良的Eagle培养基以及先诱导培养再加入骨形态发生蛋白2腺病毒均可促进骨髓基质细胞向成骨细胞方向分化，但是骨髓基质细胞用骨诱导培养基作用3d再加入骨形态发生蛋白2腺病毒能分泌表达更多的骨形态发生蛋白2，从而提高了目的基因表达的效应。     

转染血管内皮生长因子165基因的狗骨髓基质细胞超微结构变化及成骨能力

目的：探讨转染血管内皮生长因子165基因的狗骨髓基质细胞体外生物学特性。 方法：实验于2002—05／2005—06在华中科技大学同济医学院协和医院骨科完成。实验分为血管内皮生长因子基因转染组与对照组。从3只成人杂交犬髂骨取骨髓进行骨髓基质细胞分离培养，将重组的血管内皮生长因子165基因用脂质体介导转染狗骨髓基质细胞，用反转录聚合酶链反应方法检测血管内皮生长因子的表达；通过四唑盐、对硝基苯磷酸盐检测细胞增殖与碱性磷酸酶的活性；考马斯亮蓝法检测蛋白质含量；透射电镜观察细胞超微结构。 结果：（D重组质粒pcDNA3-人血管内皮生长因子165转染骨髓基质细胞后第7，14天，反转录聚合酶链反应方法检测有血管内皮生长因子mRNA表达。②骨髓基质细胞转染基因后，细胞的增殖能力无明显影响。③培养后第6，8，10，12天，转染血管内皮生长因子基因骨髓基质细胞与对照组细胞比较，碱性磷酸酶活性增高，蛋白质合成增多[转染组碱性磷酸酶为（428．09&;#177;96．67），（565．11&;#177;94．17），（562．94&;#177;39．17），（596．45&;#177;30．17）nkat，对照组碱性磷酸酶为（363.57&;#177;20.67），（536．44&;#177;11．42），（537．11&;#177;96．83），（548．10&;#177;92．34）nkat；转染组细胞蛋白合成为1．41&;#177;0．23，1．46&;#177;0．24，1．59&;#177;0．33，1．74&;#177;0．26；对照组细胞蛋白合成为0．82&;#177;0．11，0．83&;#177;0．09，0．85&;#177;0．06，0．91&;#177;0．091。④透射电镜可见转基因细胞内质网增多，线粒体致密，而糖原溶解与脂肪空泡则减少。 结论：血管内皮生长因子基因转染可促进骨髓基质细胞的成骨分化。     

克隆化兔骨髓基质干细胞系的建立及其生物学特性

建立克隆化兔骨髓基质干细胞系，为组织缺损修复研究寻找理想的种子细胞提供新的途径。方法：实验于2004—09／2005—12在浙江省医学科学院生物工程研究所完成。①取3个月龄新西兰白兔，无菌抽取骨髓液，经密度梯度离心和贴壁培养，获得原代培养骨髓基质干细胞。用有限稀释法进行克隆化培养，选择单细胞克隆增殖细胞，进行扩大培养和液氮冻存保种。②取对数生长期第2，15和32代克隆化骨髓基质干细胞，用四甲基偶氮唑盐法测定其吸光值（A值），绘制生长曲线。⑧取第4和32代对数生长期骨髓基质干细胞，按常规方法制作染色体标本，进行染色体分析。④取第5代对数生长期骨髓基质干细胞，用成骨诱导试验进行体外分化潜能鉴定。⑤取第5代对数生长期的骨髓基质干细胞．按常规方法测定最适细胞接种密度。结果：①克隆化兔骨髓基质干细胞系的建立结果：获得一株克隆化兔骨髓基质干细胞系，其细胞形态为均一的长梭形，体外连续传代培养至32代，细胞仍保持旺盛的增殖能力。经-196℃冻存复苏后仍保持良好的生长状态。②生长曲线：克隆化骨髓基质干细胞的第2，15和32代细胞生长曲线基本相同，细胞增殖速度没有明显的下降趋势。⑧染色体分析：第4和32代克隆化兔骨髓基质干细胞的染色体众数均为44条，结构未见异常。显示该细胞在体外经过32代培养，仍保持稳定的二倍体核型。④最适接种密度：第5代对数生长期骨髓基质干细胞，经常规方法测定，以1&;#215;10^3／cm^2的接种密度为最适接种密度。⑤体外分化潜能：第6代克隆化骨髓基质干细胞，在向成骨细胞诱导条件下，4，8，12碱性磷酸酶的表达均显著高于对照组[（375．41&;#177;13．17）比（239．38&;#177;7．33）nkat／L，（503．77&;#177;13．34）比（249．22&;#177;5．17）nkat／L，（605．95&;#177;10．84）比（298．73&;#177;8．17）nkat／L．P〈0．01]；茜素红染色显示有钙化结节形成，对照组为阴性。表明克隆化兔骨髓基质干细胞具有体外诱导分化潜能。结论：采用克隆化分离技术，成功获得了单细胞克隆的具有旺盛增殖能力和分化潜能，遗传性能稳定的兔骨髓基质干细胞系。     

雌二醇对骨髓基质细胞核结合因子α1基因及成骨细胞生成的影响

目的 研究骨髓基质细胞在向成骨细胞分化的条件培养体系中，17β-雌二醇（Ea）对其核结合因子α1(Chfα1）基因表达影响，探讨雌二醇对成骨细胞生成的作用。方法 取自1只3月龄雌性SD大鼠骨髓基质细胞在生长培养基中传代后，用1，25（OH）2D3和地塞米松（DEX）诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化。应用半定量RT-PCR技术，观察不同浓度Ea对骨髓基质细胞分化过程中核结合因子α1mRNA表达的影响，以α-磷酸套酚为底物，测定细胞碱性磷酸酶的活性，Van Gieson染色法显示Ⅰ型胶原的含量。结果 Ea能明显抑制骨髓基质细胞分化过程中Ghfα1 mRNA的表达，且呈剂量依赖性。Ea浓度为0,1&;#215;10^-10，1&;#215;10^-8和1&;#215;10^-6mmol/L时，Cbα1 mRNA表达量分别为23.4%&;#177;1.8%（t=17.8,P&;lt;0.01）。Northern blot结果显示Cbfα1 mRNA的表达量分别为4.22&;#177;0.11,2.51&;#177;0.12(t=21,P&;lt;0.01),1.88&;#177;0.10(t=31,P&;lt;0.01)和1.17&;#177;0.09(t=41,P&;lt;0.01)。ALP活性随Ea浓度增加而降低，在上述Ea浓度时，ALP活性分别为（42.6&;#177;2.5)U/g。（17.9&;#177;2.0)U/g(t=15,P&;lt;0.01),(10.8&;#177;1.5)U/g(t=21,P&;lt;0.01）和（3.6&;#177;0.7)U/g(t=29,P&;lt;0.01）。细胞Ⅰ型胶原的含量随Ea浓度增加而降低。结论 Ea能明显抑制骨髓基质细胞分化过程中Chfα1 mRNA的表达，减少成骨细胞的生成。     

不同传代倍数胎儿间充质干细胞的成骨分化能力观察

目的：观察不同传代倍数胎儿骨髓间充质干细胞定向诱导分化为成骨细胞的能力，为骨髓间充质干细胞在骨组织工程中的应用提供部分实验参数。方法：实验于2004—03／10在安阳市人民医院检验科和安阳肿瘤医院临床实验室完成。采用全髓直接接种法分离培养13～18周胎龄水囊引产新鲜胎儿股骨骨髓（获提供者知情同意标本用于此实验）。贴壁细胞达90％以上融合时消化传代。传代细胞部分以1&;#215;10^9L^-1的细胞密度接种于含体积分数为0．1的胎牛血清的L-DMEM的培养基中继续培养，传代；部分在培养基中添加成骨诱导剂地塞米松，β-甘油磷酸钠及抗坏血酸向成骨细胞诱导分化。如此连续传10代。倒置显微镜下观察细胞形态、细胞化学染色检测成熟成骨细胞的标志酶碱性磷酸酶的表达、全自动生化分析仪测定碱性磷酸酶活性，鉴定不同代次培养细胞成骨分化能力。结果：①碱性磷酸酶染色阳性百分率：传代7代以内胎儿骨髓间充质干细胞成骨分化能力无显著差异，均在87．5％以上（P〉0．05）；以第3代最强达93．4％。第8代后逐渐减弱，为72．7％～51．3％。②碱性磷酸酶活性：传代7代以内无差异（P〉0．05），以第3代最高，为（2307．1&;#177;15．0）nkat／L，第8代后逐渐降低，至第10代仅为（905．2&;#177;10．0）nkat／L。结论：不同代次的骨髓间充质干细胞诱导分化为成骨细胞的能力不同，8代以后明显减弱。提示脱离了体内环境后，骨髓间充质干细胞逐渐老化。做为组织工程的种子绌胞，骨髓间充质干细胞体外培养不宜超过7代。     

雌二醇对骨形态发生蛋白受体表达的影响

目的：研究骨髓基质细胞向成骨细胞分化过程中，雌二醇对其骨形态发生蛋白受体(BMPR)IA，IB mRNA表达的影响，探讨雌二醇对成骨细胞生成的作用，试阐明绝经后高转换骨代谢始动环节的可能机制。方法：SD大鼠骨髓基质细胞在生长培养基中传代培养后，用1，25(OH)2D3和地塞米松(DEX)诱导骨髓基质细胞向成骨细胞分化，17β-雌二醇(E2)处理培养细胞，观察E2对骨髓基质细胞分化过程中骨形态发生蛋白受体IA、IB mRNA、碱性磷酸酶(ALP)活性和Ⅰ型胶原合成的影响，β-actin作内对照半定量RT-PCR分析骨形态发生蛋白受体IA，IB mRNA的表达，以α-磷酸奈酚为底物，测定细胞碱性磷酸酶的活性，Van Gieson染色法显示Ⅰ型腔原的含量。结果：E2能明显抑制骨髓基质细胞分化过程中BMPR-IA mRNA的表达，且呈剂量依赖性，随E2浓度增加(0～1&;#215;10^3nmol／L)BMPR-IA mRNA从(27．0&;#177;3．4)％降至(17．0&;#177;1．8)％(t=5．2，P&;lt;0．01)和(9．3&;#177;1．6)％(t=9．2，P&;lt;0．01)；BMPR-IB mRNA随E2浓度增加而增加，从(2．0&;#177;0．8)％增至(4．8&;#177;1．5)％(t=3．3，P&;lt;0．05)和(17．2&;#177;2．2)％(t=13，P&;lt;0．01)。Northernblot结果显示在上述E2浓度时BMPR-IA mRNA的表达从4．21&;#177;0．36降至1．24&;#177;0．10(t=18．2，P&;lt;0．01)；BMPR-IB mRNA的表达从1．72&;#177;0．11增至3．73&;#177;0．31(t=12．2，P&;lt;0．01)。ALP活性随E2浓度增加而降低，从(42．6&;#177;2．5)U／g蛋白降至(17．9&;#177;2．0)U／g蛋白(t=15，P&;lt;0．01)，(10．8&;#177;1．5)U／g蛋白（t=22，P&;lt;0．01)和(3．6&;#177;0．7)U原蛋白(t=30，P&;lt;0．01)；细胞I型胶原的含量随E2浓度增加而减少。VanGieson染色由鲜红、淡红到黄色，红色越深，表明胶原越多。绪论：E2能明显抑制骨髓基质细胞分化过程中BMPR-IA mRNA的表达，降低ALP的活性和Ⅰ型胶原含量，增加BMPR-IB mRNA的表达)。     

比较不同来源人成骨细胞的体外培养模式及其生物学特性

目的：建立不同来源人成骨细胞的体外培养模式，比较颅骨、骨膜、骨髓来源的成骨细胞的生物学特性。 方法：实验于2002-9／2004—3在东南大学修复重建外科研究所完成。①从人4个月龄胚胎骨膜、颅骨及骨髓组织中分离培养出骨膜来源的成骨细胞，颅骨来源的成骨细胞和骨髓基质干细胞并对骨髓基质干细胞进行成骨诱导培养。②体外动态观察细胞的生长情况和形态学变化，用第2-4代细胞进行细胞鉴定和生物学特性的比较。③通过相差显微镜，Giemsa染色及透射电镜观察比较细胞的形态和超微结构，通过生长曲线，比较细胞的增殖能力。经碱性磷酸酶染色和钙结节染色比较细胞的成骨活性，并经X射线能量散射分析鉴定钙结节的元素成分。 结果：培养的颅骨、骨膜来源的成骨细胞和在诱导培养下的骨髓基质干细胞具有成骨细胞的形态、生长及功能特点。骨膜、颅骨来源的成骨细胞以功能态为主，骨髓基质干细胞以增殖态为主。①体外增殖结果：3种细胞的增殖能力依次为：骨髓基质干细胞、颅骨来源成骨细胞、骨膜来源的成骨细胞。②形态学观察：第3代后3种细胞在形态上无明显的差别，在超微结构上骨膜来源的成骨细胞和颅骨来源的成骨细胞为高分化细胞，骨髓基质干细胞为低分化细胞。③成骨功能表达：骨膜来源成骨细胞第15天，颅骨来源成骨细胞第17天光镜下可见褐色的钙化结节形成，骨髓基质干细胞在诱导液条件下培养24d时可见褐色结节：矿化结节X射线能量散射分析，其Ga／P元素含量比值，骨膜来源成骨细胞为2．16&;#177;0．17，颅骨来源成骨细胞为2．39&;#177;0．21，骨髓基质干细胞为2．57&;#177;0．15；骨膜来源成骨细胞的碱性磷酸酶染色阳性率为95．2％，颅骨来源成骨细胞为89．6％。骨髓基质干细胞（诱导后）为69．0％。骨髓基质干细胞（未诱导）碱性磷酸酶染色阴性。3种不同来源的人成骨细胞成骨能力依次为：骨膜来源的成骨细胞、颅骨来源成骨细胞、骨髓基质干细胞。 结论：采用改良的酶消化法，培养骨、骨膜来源的成骨细胞，通过加以改进的密度梯度离心法，培养骨髓基质干细胞，可得到均一性好，活性强的3种不同来源的人成骨细胞。     

鼠骨髓间充质干细胞对缺氧-复氧神经元修复的体外实验

目的：观察在体外培养条件下骨髓间充质干细胞对缺氧-复氧新生大鼠大脑皮质神经元活性的影响。方法：实验于2005—01／2006—12在兰州大学第一医院中心实验室完成。健康Wistar大鼠成鼠5只，健康新生Wistar大鼠20只，无菌条件下分离、培养、传代Wistar大鼠骨髓间充质干细胞，细胞融合达90％时更换培养基培养24h，收集细胞培养液即为骨髓间充质干细胞条件培养基；无菌条件下培养新生Wistar大鼠大脑皮质神经元，第8天随机分为正常对照组、缺氧组、间充质干细胞条件培养基处理组，即用骨髓间充质干细胞条件培养基进行缺氧神经元的修复。分别于缺氧0h、缺氧6h、复氧24h用噻唑蓝盐比色法测定吸光度值和BeckMan全自动生化仪测定培养液乳酸脱氢酶漏出量，分别检测各组神经元的活性和细胞损伤后修复的程度。结果：各实验组均全部进入结果分析。①各组神经元的活性：鼠大脑皮质神经元缺氧6h及复氧24h后缺氧组噻唑蓝明显低于正常对照组，骨髓间充质干细胞条件培养基处理组复氧24h后噻唑蓝高于缺氧组（缺氧6h：缺氧组0.42&;#177;0.14，正常对照组0．81&;#177;0.12；复氧24h：缺氧组0.35&;#177;0.15，正常对照组0.82&;#177;0．21，骨髓间充质干细胞条件培养基处理组0.74&;#177;0．25，P〈0．01或0.001）。②各组细胞损伤后修复的程度：缺氧6h和复氧24h后，缺氧组乳酸脱氢酶漏出量比正常对照组明显增多，骨髓间充质干细胞条件培养基处理组比缺氧组明显减少[缺氧6h：缺氧组（790．16&;#177;34．51）nkat／L，对照组（340．07&;#177;25．17）nkat／L，骨髓间充质干细胞条件培养基处理组（570．11&;#177;53．18）nkat／L；复氧24h：缺氧组（1790．36&;#177;252．38）nkat／L，对照组（340．07&;#177;19．00）nkat／L，骨髓间充质干细胞条件培养基处理组（860．17&;#177;40．17）nkat／L，P〈0．001]。结论：在体外培养条件下骨髓间充质干细胞能增加缺氧神经元的细胞活性，促进缺氧神经元的修复。     

强骨抗萎方对模拟失重条件下体外培养成骨细胞的影响

背景：航天环境中，失重对骨质代谢的影响被认为是对人体最严重的危害之一。目的：探讨复方强骨抗萎方对模拟失重条件下体外培养的成骨细胞的影响，拟揭示该方对抗骨丢失的分子生物学作用。设计：随机对照观察。单位：航天医学工程研究所。材料：实验于1997-04／12在北京航天医学工程研究所完成。选择SD乳鼠。药物：强骨抗萎方（熟地、骨碎补、龟板、怀牛膝等）。方法：乳鼠15只，随机分为5组，每组3只。分离乳鼠颅骨成骨细胞，体外培养后，分为正常对照、失重模型、强骨抗萎方大（2．0％）、中（1．0％）、小（0．5％）剂量5组。置回旋器，30r／min，连续回旋60h模拟失重，观察该方对回旋12，30，60h时大鼠成骨细胞碱性磷酸酶和骨钙素生成及碱性磷酸酶基因转录水平（mRNA）的影响。主要观察指标：强骨抗萎方对体外模拟失重条件下成骨细胞培养液中碱性磷酸酶活性、骨钙素含量及碱性磷酸酶mRNA表达的影响。结果：纳入的15只乳鼠均进入结果分析，实验中无脱失。①与正常对照组比较，模型组成骨细胞在回旋12，36，60h不同时间点的细胞培养液中的碱性磷酸酶活性均明显降低，其中12，60h时差异显著l（45．0l&;#177;12．50），（96．18&;#177;12．34）；（13．17&;#177;5．33），（137．36&;#177;137．86）nkat／L．P〈0．05]，碱性磷酸酶mRNA表达低微；骨钙素活性均减低，60h时差异显著[（30．3&;#177;2．75），（42．0&;#177;10．0）μg/L P〈0．05]。②与模型组比较，中药复方不同剂量组于回旋不同时间点细胞培养液中的碱性磷酸酶活性均有不同程度升高[其中60h的小、中、大剂量组分别为（143．70&;#177;123．86）．（54．5l&;#177;13．17）；（156．53&;#177;133．69）nkat／L，P〈0．051；碱性磷酸酶mRNA表达活性也较高；但骨钙素活性无明显变化。结论：该方能改善模拟失重条件下成骨细胞的功能，缓解其分化抑制状态，促进骨基质的形成和成熟。