16S rRNA、16S-23S rRNA基因测序分析检测主要血流感染病原菌比较

目的比较细菌16S rRNA、16S-23S rRNA 基因测序分析在血流感染病原菌检测中的作用。方法提取临床上血流感染常见的金黄色葡萄菌、表皮葡萄球菌、大肠埃希菌、粪肠球菌、肺炎链球菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、洛菲不动杆菌、肺炎克雷伯杆菌、化脓性链球菌、奇异变形杆菌、潘尼变形杆菌、屎肠球菌、粘质沙雷菌、宋内志贺菌、产气肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森菌、腐生葡萄球菌基因组 DNA,运用 16S rRNA、16S-23S rRNA 基因进行 PCR 扩增。扩增产物经测序后在美国国家生物技术中心(NCBI)上进行比对分析,确定菌种。结果在所分析的 19 种临床血流感染常见细菌中,16S rRNA 基因测序分析可将除粘质沙雷菌外的细菌鉴定到种的水平,但无法完全区分近缘种属;16S-23SrRNA 成功鉴定 17 种细菌,除大肠埃希菌、宋内志贺菌外所有细菌均成功鉴定到单一种的水平。结论 16S-23S rRNA 基因可作为血流感染细菌检测较好的分子靶标。     

16S rRNA基因PCR对细菌感染的分子生物学研究

细菌核糖体小亚基ＲＮＡ（１６Ｓ ｒｉｂｏｓｏｍａ ＲＮＡ，１６Ｓ ｒＲＮＡ）为所有的细菌共有，其编码的基因具有高度的保守性，通过１６Ｓ ｒＲＮＡ基因保守区引物进行ＰＣＲ扩增，可早期、快速判断细菌的存在与否，并通过序列分析，进一步鉴定菌种和进行种系发生学分析。本文就细菌１６Ｓ ｒＲＮＡ基因的特点、ＰＣＲ扩增后对细菌感染的判断、菌株耐药性和流行病学研究等方面作一概述。     

16S rRNA基因测序在医院环境微生物群落分布特征分析中的研究进展

16S rRNA基因测序技术可以有效识别医院内物体表面、水体、医疗设备等各种环境中微生物的群落结构,帮助追踪医院环境中微生物分布及传播关系。本文主要介绍16S rRNA基因测序在医院环境微生物群落分布特征分析中的研究进展,以期为院内感染传播研究和控制策略提供一些思路。     

安徽地区家畜嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因检测和序列分析

目的了解安徽农村地区散养家畜自然感染嗜吞噬细胞无形体状况和基因特征。方法应用巢式PCR对怀远、明光和广德县采集的148份家畜全血样本进行嗜吞噬无形体16S rRNA基因检测,并对扩增产物测序,应用生物软件MEGA4.0进行序列分析。结果 148份家畜全血样本中检测出山羊、牛和犬嗜吞噬细胞无形体16S rRNA基因阳性率分别22.1%、25.0%和40.0%。26份PCR阳性扩增产物测序成功,序列分析结果表明：检出序列可归为4群,I群优势株占分析序列的66.7%,与北京、浙江和湖北等地检测序列同属一个分支。目的基因测定序列与参考序列同源性达97.0~99.0%。结论安徽调查地区农村家畜动物存在嗜吞噬细胞无形体感染,山羊是该地区嗜吞噬细胞无形体的重要宿主动物之一。     

16S rRNA基因测序分析技术在食品污染菌监测中的应用

目的 将16S rRNA基因测序分析技术应用于食品安全风险监测中非目标(相似、少见或非典型)致病菌的鉴定,为食源性疾病防控提供更多病原学证据。方法 采集18份畜类、18份禽类和9份鱼类共45份生鲜样品,目标致病菌按照GB4789标准检测,非目标菌进行16S rRNA基因测序,将全长序列在GenBank中比对确定细菌种属,通过MEGA6构建细菌16S rRNA基因进化树,判定细菌种属间的亲缘关系。结果 45份生鲜样品中检出19株目标致病菌,包括沙门氏菌、空肠弯曲菌、单增李斯特菌和副溶血弧菌,而34株非目标菌16S rRNA基因全长序列能分别比对出13种细菌,其中8种19株菌属于致病或条件致病菌,包括霍乱弧菌、溶藻弧菌、结肠弯曲菌、奇异变形杆菌、粪肠球菌和铜绿假单胞菌,以及在深圳乃至省内首次报道的布氏弓形菌和海藻希瓦氏菌。结论 深圳市售生鲜食品受到多种食源性致病菌污染,特别是非目标检出的致病菌,对此认为16S rRNA基因测序分析技术是一套有效的细菌监测适宜技术,能提高食源性疾病和食物中毒的防控水平。     

16S rRNA基因检测在新生儿败血症早期诊断中的应用

目的 建立基于16S rRNA基因的聚合酶链反应(PCR)细菌学检测方法,以指导临床快速诊断新生儿败血症.方法 以细菌16S rRNA基因为靶序列,利用计算机软件设计合成所有细菌保守区共有的一对通用引物,通过PCR扩增已知10株实验室保存菌株、人类基因组DNA、巨细胞病毒、白色假丝酵母菌和空白对照,并对其灵敏度和特异性作一评价.结果 对所测已知10株实验室保存菌株均获得920 bp扩增产物,其与人类基因组DNA、巨细胞病毒和白色假丝酵母菌无交叉阳性反应;PCR阳性率为26.8％,血培养阳性率为11.3％,两者比较有差异有统计学意义(P＜0.05),PCR灵敏度高于血培养.结论 与血培养比较,PCR具有检测速度快、特异性及敏感度高等特点.     

基于16S rRNA和gyrB基因串联DNA特征序列的副溶血性弧菌鉴定

[目的]建立基于16S核糖体RNA(16S rRNA)和DNA促旋酶亚基B(gyrB)基因串联DNA特征序列的副溶血性弧菌鉴定方法,为菌株鉴定和分类提供研究思路和方法依据.[方法]选择副溶血性弧菌、溶藻弧菌以及弧菌属的其他代表性菌株,分别以16S rRNA和gyrB基因为研究靶点,设计引物进行特异性核酸序列扩增和核酸测...     

黏液玫瑰单胞菌16S rRNA基因序列及耐药性分析

目的对常规方法不易鉴定的一株临床细菌进行16S rRNA基因序列分析,并探讨该细菌的耐药性。方法菌株分离培养后进行常规的鉴定及药物敏感性分析,同时选择细菌的16S rRNA基因为靶序列,进行PCR扩增并测序,测序结果与GenBank比对。结果 API 20NE板条(法国生物梅里埃公司)将该菌鉴定为嗜中温甲基杆菌;细菌的16S rRNA基因序列与黏液玫瑰单胞菌相似性为99.5%;细菌的药敏试验显示对三代头孢耐药性高。结论黏液玫瑰单胞菌引起的感染比较罕见,菌株对三代头孢的高耐药应引起临床重视;16S rRNA基因序列分析方法可以较好地鉴定常规方法难以鉴定的不典型及罕见菌株。     

循环游离DNA联合16S rRNA基因检测在糖尿病烧伤脓毒症早期诊断中的作用

目的探讨循环游离DNA(cf-DNA)联合16S核糖体RNA(16S rRNA)基因检测在糖尿病烧伤脓毒症患者早期诊断中的作用。方法选择2016年3月-2018年5月山东省滨州市人民医院烧伤科收治的糖尿病烧伤可疑脓毒症患者65例,采取常规血培养及16S rRNA基因检测PCR法进行细菌分离鉴定,并检测患者外周血炎症指标及血糖变化。分析PCR、血培养结果与各指标关系。结果 16S rRNA基因检测PCR法检出65例标本,阳性30例,阳性率46.15%,血培养阳性18例,阳性率27.69%(P<0.05);PCR法检测所需时间低于常规血培养(P<0.05)。PCR法检出革兰阴性菌19株(占63.33%)、革兰阳性菌11株(占36.67%);血培养检出革兰阴性菌13株(占72.22%)、革兰阳性菌5株(占27.78%)。PCR检测阳性患者cf-DNA、C-反应蛋白(CRP)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、空腹血糖(FBG)以及餐后2 h血糖(2h PG)均高于PCR阴性患者(P<0.05)。患者cf-DNA水平与外周血CRP、TNF-α、IL-6水平呈正相关关系(P<0.05)。血培养阳性患者cf-DNA、CRP、TNF-α、IL-6、FBG以及2hPG均高于血培养阴性患者(P<0.05)。结论 16S rRNA基因PCR检测可快速诊断糖尿病烧伤脓毒血症患者感染病原菌,联合cf-DNA运用,有助于糖尿病烧伤脓毒血症患者的早期诊断。     

鼠疫耶尔森氏菌16S-23S rRNA基因间区的酶切位点分析

目的：了解鼠耶尔森氏菌１６Ｓ－２３ＳｒＲＮＡ基因间区的酶切位点分布情况。方法：ＰＣＲ扩增及限制性内切酶分析。结果：对ＥＶ菌及不同来源的１０３株鼠疫耶尔森氏菌１６Ｓ－２３ＳｒＲＮＡ基因间区进行了扩增,选用限制性内切酶Ｔａｑ、１ｅｙ Ｍｓｐ１对扩增产物进行酶切分析,结果发现所用鼠疫耶尔森氏菌该间区扩增产物及酶切图谱一致,选用Ｔａｑ１＋Ｍｓｐ,Ｈｉｎｆ１＋Ｍｓｐ１对ＥＶ菌１６Ｓ－２３ＳｒＲＮＡ基因间区扩     

双位点保守基因特异性PCR-CE-RFLP快速鉴定病原菌的实验与临床研究

[目的]初步建立一个临床常见病原菌的标准PCR-CE-RFLP数据库,为临床快速鉴定病原菌奠定基础。[方法]选取临床分离的病原菌共167株,筛选16S rRNA基因和16S-23S rRNA间区基因的合适引物,分别用FAM和JOE两种荧光素标记,调整PCR反应条件,让两种引物能同时在同一条件下反应,所得产物先用普通琼脂糖凝胶电泳,再分别用限制性内切酶HaeIII进行不完全酶切,酶切产物50倍稀释后进行毛细管电泳(PCR-CE-RFLP),测定酶切片段长度差异。[结果]针对16S rRNA基因的RFLP谱数据只能将病原菌鉴定到"科"的程度,而单纯应用16S-23S rRNA间区基因的RFLP谱数据虽能区分绝大多数细菌,但个别种属内仍然出现相似的谱型。经过双位点PCR-CE-RFLP分析后,则可将所有细菌鉴定到"种"的程度。[结论]利用16S rRNA基因和16S-23S rRNA间区基因PCR-CE-RFLP进行细菌鉴定简便快捷,能将传统方法需要十几个小时甚至几十小时的鉴定工作缩短到几个小时,是一种极有临床应用价值的快速诊断方法。     

PCR产物直接测序快速识别病原菌

[目的]结合PCR和DNA测序技术,建立一种适用于传染性疾病预防控制的快速准确地识别病原细菌的分子检测方法.[方法]以布鲁氏菌为例,利用PCR分别从纯培养物、模拟标本中扩增布鲁氏菌16S和31kd基因,并对扩增产物测序,与数据库进行比对,根据比对结果确定扩增产物是否来源于布氏菌.[结果]从纯培养物和模拟标本成功扩增特异产物,测定序列与数据库比对,能很快准确确定病原的种类,优于单纯的PCR扩增.[结论]结合PCR扩增和产物测序的分子检测方法切实可行,为疾病预防控制体系中病原菌的快速识别提供了一个快速、高效和准确的方法.     

O139群霍乱弧菌16S rRNA基因分型分析

[目的]研究北京市O139群霍乱弧菌的分子生物学特征。[方法]对北京市1998～2000年的30株O139群霍乱弧菌进行PCR霍乱肠毒素（CT）基因检测,以16SrRNA为探针对菌株DNA进行Southern杂交后对图谱进行核糖体基因（RT）分型分析。[结果]对30株霍乱弧菌RT图谱进行分析,共存在5种16SrRNA核糖体基因型,其中CT阳性的O139群霍乱弧菌为RT1型,CT阴性的O139群霍乱弧菌为RT2-RT5型。[结论]北京市不同年份的O139群霍乱弧菌CT阳性菌株核糖体基因型较为单一,CT阴性菌株基因型具有明显的多样性。提示北京市O139群霍乱弧菌CT阳性菌株和CT阴性菌株遗传发生上相距较远。     

沙门菌变性高效液相色谱法鉴定和分型研究

[目的]建立PCR与变性高效液相色谱(DHPLC)相结合的方法,对沙门菌进行鉴定和分型。[方法]针对16S rRNA基因或16S-23S之间序列保守区设计3对引物S1、S2和S3,PCR扩增产物或杂交产物用变性高效液相色谱仪鉴定。[结果]柱温50℃时,引物S1产物在不同血清型沙门菌显示为特异DHPLC图谱;柱温61.4℃时,引物S2杂交产物在不同血清型沙门菌显示为特异DHPLC图谱;引物S3可用于沙门菌的特异鉴定,但不能区分血清型;同一血清型内各菌株基因高度保守。[结论]PCR-DHPLC方法适用于不同血清型沙门菌的分型,但不适于同一血清型内的菌株分型。     

单增李斯特菌鉴定方法比较研究

[目的]对单增李斯特菌鉴定方法进行研究。[方法]分别用API检测方法、16SrRNA序列分析法和焦磷酸测序法对17株单核细胞增生李斯特菌进行检测。[结果]3种方法均能准确鉴定单增李斯特菌。[结论]焦磷酸测序方法检测单增李斯特菌特异性强、经济、操作简便、检测快速,为单增李斯特菌的快速、高通量检测提供了一种新的手段。     

快速提取细菌DNA方法的研究

目的:研究快速、有效可以应用于压电基因传感器对病原微生物的快速检测的DNA的提取方法。方法:采用沸水浴法,酚、氯仿法,chelex1 0 0法和试剂盒法提取金黄色葡萄球菌ATCC2 5 92 3、铜绿假单胞菌ATCC 2 785 3和大肠杆菌ATCC 2 5 92 2的DNA对产物进行纯度和产量测定,并对1 6SrDNA区域利用通用引物进行扩增。初步应用自行研制的压电基因传感器检测金黄色葡萄球菌ATCC2 5 92 3的PCR产物。结果:除沸水浴法,其他3种方法均能抽提出3种细菌的DNA与1 0 0法和酚、氯仿法抽提产物的纯度和产量差异无显著性(P >0 .0 5 ) ,但chelex1 0 0法操作更为简单、成本低;试剂盒法抽提出的产物纯度和产量明显高于酚、氯仿法、chelex1 0 0法P <0 . 0 5 ) ,但成本高,操作繁琐。结论:chelex1 0 0法操作简便、省时、成本低,适宜用于压电传感器样本的预处理。     

基因芯片快速检测常见水中致病菌的初步应用研究

目的：利用基因芯片技术，尝试对从实际样品中分离的几种常见致病菌进行快速检测鉴定。方法：通过PCR扩增检测靶基因，采用基因芯片与扩增产物在一定条件下进行杂交，杂交结果通过ScanArray 3000芯片扫描仪读取并与标准杂交图谱比较，从而判定样品中细菌的种属。结果：对分离的20株细菌进行了基因芯片的杂交检测，并用传统方法对这些菌株进行了鉴定，基因芯片检测结果与传统方法鉴定结果的一致性为95％(19／20)。结论：基因芯片技术检测水中常见致病菌具有快速、准确、易于操作等优越性，值得推广应用。     

Copy number of the 16S rRNA gene in Coxiella burnetii

Coxiella burnetii is an obligate intracellular bacterium with a doubling time of 5–7 hours. Chromosomal DNA from C. burnetii was digested with various restriction enzymes previously determined to not cut within the genomic 16S rRNA gene, or with a combination of these noncutting enzymes in conjunction with AflIII, a restriction enzyme that cuts twice within the 16S rRNA gene. Restriction fragments were resolved electrophoretically and probed with a radiolabeled DNA fragment containing the 3 AflIII portion of the C. burnetii 16S rRNA gene. Only a single DNA fragment in these digests hybridized to the probe, indicating that there is a single genomic copy of the 16S rRNA gene in C. burnetii and thus only a single copy of the rRNA operon.     

PCR—Dotblot杂交法直接检测临床病原菌的报告

目的为了寻找临床病原菌系统，检测和鉴别的有力手段。方法用真细菌保守的１６ＳｒＲＮＡ基因为模板，以ＰＣＲ－Ｄｏｔｂｌｏｔ杂交的方法检测临床病原菌。结果它将１６ＳｒＲＮＡ基因的广谱性和变异性并存之特点和ＰＣＲ－Ｄｏｔｂｌｏｔ杂交的敏感性结合起来，对该法的建立进行了探讨，并初步用于临床感染的检测。结论为细菌通用检测法的建立提供了基础。     

P16基因启动子在脑胶质瘤患者中的异常甲基化及意义

目的探讨脑胶质瘤患者肿瘤与血浆标本P16基因启动子区CpG岛的甲基化状态及其与临床的关系,分析脑胶质瘤的可能发生机制及早期诊断方法。方法用甲基化特异性PCR对40例脑胶质瘤患者肿瘤及血浆标本P16基因启动子区进行甲基化检测。结果 40例脑胶质瘤标本的P16基因启动子区异常甲基化率为35%(14/40),相应血浆标本的P16的异常甲基化检出率为25%(10/40),两者相比差异无显著性(p>0.05)。20例对照组脑组织标本的P16基因甲基化率为5%(1/20),与胶质瘤标本比较差异具有统计学意义(p<0.05)。P16基因启动子区的异常甲基化与患者年龄、性别、肿瘤病理类型、恶性程度的差异无统计学意义(p>0.05)。结论 P16基因启动子区CpG岛的异常甲基化在脑胶质瘤的发生中起着重要作用,检测血浆标本的P16的异常甲基化对于脑胶质瘤早期诊断具有重要意义。