HO-1真核表达质粒的构建及在肾小管上皮细胞中的表达

[目的]构建HO-1基因真核表达质粒,转染大鼠肾小管上皮细胞,检测其在细胞中的表达效果.[方法]从大鼠肾组织中提取总RNA,通过逆转录PCR(RT-PCR)扩增大鼠HO-1基因片段,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1( )中,运用脂质体将重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1转染大鼠肾小管上皮细胞,通过RT-PCR和Western blot分析HO-1基因细胞转染及表达的效果. [结果]成功构建了HO-1基因真核表达重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1.RT-PCR及Western blot分析显示,HO-1基因能转染大鼠肾小管上度细胞并在细胞内有效表达. [结论]HO-1基因真核表达重组质粒pcDNA 3.1( )-HO-1的成功构建及其在肾小管上皮细胞中的有效表达为深入研究其生物学作用奠定了基础.     

人卵泡抑素基因真核表达载体构建和体外表达

目的:体外构建携带人卵泡抑素基因(FS)cDNA的真核表达载体,并观察其在幼年叙利亚地鼠肾细胞(BHK21)中的表达。方法:从新鲜人卵泡抽提液细胞中提取RNA,应用RT-PCR方法扩增人FScDNA序列,克隆到pMD-18T载体中,构成pMD-FS重组克隆质粒。经测序鉴定后,双酶切得到人FS基因cDNA序列,插入到真核表达载体pEGFP-N1中,构成pEGFP-FS重组表达质粒。pEGFP-FS重组表达质粒经酶切和PCR鉴定,通过脂质体2000介导瞬时转染BHK21细胞,并检测绿色荧光蛋白(GFP)的荧光表达。结果:成功构建pMD-FS重组克隆质粒,FScDNA序列测序结果与GenBank中公布的序列(Genbank NM_013409.1)同源性为100%;成功构建pEGFP-FS重组表达质粒,将其转染BHK21细胞后,观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:本实验成功构建了人FS的pMD-FS重组克隆质粒和pEGFP-FS重组表达质粒,为进一步研究FS对哺乳动物卵泡发育的影响奠定了基础。     

SV40病毒T抗原真核载体的构建与表达

目的设计、构建SV40病毒T抗原真核表达载体,并导入真核细胞进行表达鉴定。方法采用重叠延伸拼接法,从pUC19-SV40载体中亚克隆切除内含子的SV40病毒T抗原基因全长片段,EcoRⅠ/BamHⅠ双酶切后定向克隆至pEGFP-N1真核表达载体上,酶切鉴定重组质粒;用脂质体转染的方法将构建的载体导入原代培养的正常人成纤维细胞进行表达,检测SV40病毒T抗原基因在成纤维细胞内的表达。结果SV40病毒T抗原基因成功克隆至pEGFP-N1真核表达载体中;转染成纤维细胞提取基因组DNA及总RNA,分别经PCR和RT-PCR反应扩增出288 bp的特异性片段。结论本试验构建的SV40病毒T抗原重组质粒为利用SV40T抗原进行真核细胞研究提供了稳定、可靠的分子工具。     

端粒和端粒酶相互作用蛋白在真核细胞中的表达

目的从人肝癌细胞系HepG2中获得PinX1基因,构建真核表达载体,转染Hek293细胞。方法采用RT-PCR技术从HepG2中扩增PinX1,克隆入真核表达载体pcDNA3,重组质粒转染Hek293细胞,免疫组化法检测蛋白的表达。结果RT-PCR方法扩增获得PinX1基因,构建真核表达载体pcDNA3-PinXl-vsv重组质粒转染Hek293细胞,免疫组化检测结果表明在细胞核内有PinX1表达。结论成功获得PinX1基因,构建的重组载体可在Hek293细胞内表达,为探索PinX1在端粒、端粒酶调控中的作用机制奠定基础。     

人乳腺珠蛋白基因真核表达载体的构建及其表达

[目的]构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因的真核表达载体pcDNA3.1-hMAM,并观察重组载体在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础.[方法]利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序分析后,克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM.将重组载体用脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法检测目的基因的表达.[结果]成功扩增hMAM基因,酶切测序结果表明,重组载体含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达.[结论]hMAM基因的真核表达载体构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据.     

Id1强制表达对血管内皮细胞株ECV-304增殖能力的影响

[目的]为深入研究hCASK功能,构建Id1真核表达载体并转染ECV-304细胞,筛选出Id1强制表达细胞株,观察Id1上调表达对ECV-304细胞增殖能力的影响. [方法]采用RT-PCR方法获取编码Id1的cDNA序列,并将其导入真核表达载体成功构建pIRES2-EGFP-ld1重组表达质粒.将重组质粒转染人ECV-304细胞株,经G418加压筛选,成功筛选出Id1强制表达的细胞株.用蛋白免疫印迹法鉴定转染细胞中Id1基因的表达水平.采用流式细胞技术、细胞计数的方法观察筛选出的细胞株增殖能力的变化. [结果]成功建立了Id1强制表达的ECV-304细胞株.同未转染细胞相比,Id1强制表达细胞株中G0/G1细胞比率下降约4.8%,G2M期细胞比率上升约26.3%,增殖指数明显增高,细胞增殖能力增强. [结论]Id1强制表达细胞株的成功建立和鉴定为CASK、Id1基因功能研究提供了有效手 段.Id1的上调表达可导致ECV-304细胞增殖能力增强.     

重组CKB真核表达载体的构建及其稳定转染NCI—H520细胞系的建立

目的构建pEGFP—N1－CKB真核表达载体并将其稳定转染到肺鳞癌细胞NCI—H520中,建立稳定转染的NCI—H520细胞系,为后续研究奠定基础。方法以人CKBcDNA文库为模板,用PCR扩增人CKBcDNA的编码区,并将扩增的cDNA片段与载体连接后亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中。重组子经酶切分析及测序鉴定后,用脂质体转染技术将其导入到人肺鳞癌细胞系NCI—H520,经G418筛选并建立稳定的转染细胞株,应用Westernblot检测转染前后该细胞株CKB基因的表达。结果pEGFP—N1－CKB经酶切鉴定及DNA测序证实序列完全正确,真核表达载体构建成功;经Westernblot检测,重组质粒转染株中CKB基因的表达水平明显高于对照组,证实CKB基因已稳定转染到NCI-H520细胞中并得到表达。结论成功构建了pEGFP—N1－CKB真核表达质粒,建立了稳定表达CKB的NCI-H520细胞系,为进一步研究CKB的生物学功能奠定了基础。     

人乳腺珠蛋白基因疫苗的构建及其免疫原性研究

目的:构建人乳腺珠蛋白(hMAM)基因重组质粒pcDNA3.1-hMAM,并观察重组质粒在COS-7细胞中的表达,为肿瘤DNA疫苗研究奠定基础。方法:利用PCR方法扩增hMAM基因,酶切测序后克隆入真核表达载体pcDNA3.1,构建真核表达载体pcDNA3.1-hMAM。将重组载体脂质体转染法转染入COS-7细胞,间接免疫荧光法和ELISA检测目的基因的表达。结果:成功扩增hMAM基因,酶切测序表明,重组质粒含有hMAM基因,在COS-7细胞中可检测到hMAM表达。结论:hMAM基因疫苗构建成功,为进一步进行DNA肿瘤疫苗研究提供了实验依据。     

鸭乙型肝炎病毒聚合酶结合模拟肽真核表达载体的构建

目的：构建与鸭乙型肝炎病毒聚合酶(DHBV P)特异性结合的模拟肽的重组真核表达质粒，为进一步将重组质粒转染原代培养鸭肝细胞研究模拟肽的作用奠定基础。方法：以噬菌体肽库中筛选出来的能特异性结合DHBV P的模拟肽基因为模板，扩增模拟肽基因片段，并应用基因重组技术构建其真核表达载体pEGFP-N1-模拟肽基因(pEGFP-N1-M)。结果：经鉴定，目的基因片段以正确的方向插入载体pEGFP-N1中，序列正确，对码正确。结论：成功构建了重组真核表达质粒pEGFP-N1-M。     

重组人缺氧诱导因子-1α基因真核表达载体的构建及表达

目的构建重组人缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)真核基因表达载体pSNAV-HIF-1α并观察其在原代培养海马神经细胞中的表达。方法采用基因重组技术,将pBSKhHIF 1αT7原核表达载体上HIF-1α基因序列克隆至真核表达载体pSNAV2.0,磷酸钙共沉淀法介导转染pSNAV-HIF-1α,采用Western blot检测HIF-1α蛋白。结果酶切、PCR及DNA测序结果均表明成功构建了重组质粒pSNAV-HIF-1α,磷酸钙共沉淀法介导的pSNAV-HIF-1α质粒转染显著增加了海马神经细胞HIF-1α蛋白表达(P0.05)。结论成功构建了pSNAV-HIF-1α,为进一步应用该基因进行临床基因治疗提供了实验依据。     

卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒构建与表达

[目的]构建大鼠源卡氏肺孢子虫MSG抗原基因片段真核表达质粒,进行表达。[方法]以卡氏肺孢子虫DNA为模板,应用PCR扩增MSG基因片段,连接至pGEM-T Easy载体,再克隆至PCDNA3.1( )载体。构建的重组表达质粒经酶切、PCR鉴定后转染至COS-7细胞,并进行大量增殖。RT-PCR验证转染基因的表达。[结果]重组表达质粒PCDNA3.1( )/MSG经酶切及PCR鉴定结果表明构建成功。RT-PCR结果显示MSG基因片段成功转染至COS-7细胞,并在其中进行基因表达。[结论]成功构建了PCDNA3.1( )/MSG重组质粒,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究打下基础。     

pcDNA3.1(+)TPA构建及其在人脐静脉内皮细胞的表达活性研究

目的建立TPA基因在人脐静脉内皮细胞外源性表达的方法，为缺血性心脏疾病的基因治疗及防止血管再狭窄提供理论依据和新方法。方法构建真核表达载体pcDNA3．1( )TPA，并采用脂质体法将其转入体外培养的人脐静脉内皮细胞，并现察外源性TPA表达情况。结果真核表达载体pcDNA3．1( )TPA在人脐静脉内皮细胞中获有效表达，酶联免疫吸附法TPA蛋白表达定量检测结果为568．6ng／10^6细胞／24h，未转pcDNA3．1( )TPA的人脐静脉内皮细胞测得为17．8ng/10^6细胞／24h；发色底物法测得外源性TPA活性为108．8IU／10^6细胞／24h，未转pcDNA3．1( )TPA的人脐静脉内皮细胞测得为5．6IU／10^6细胞／24h。结论pcD．NA3．1( )TPA转入人脐静脉内皮细胞后，外源性TPA基因荻有效表达，为缺血性心脏病的TPA基因治疗提供了理论依据和新方法。     

缺氧对脐静脉内皮细胞损伤及可溶性血管内皮生长因子受体-1 mRNA表达的影响

目的:探讨二氯化钴(CoCl2)诱发化学缺氧对培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells)损伤和血管内皮生长因子受体-1(soluble vascular endothelial growth factor receptor-1)mRNA表达的影响。方法:采用MTT检测缺氧时人脐静脉内皮细胞的增殖情况,检测上清中LDH量反映脐静脉内皮细胞损伤程度,RT-PCR检测sFlt-1 mRNA表达水平,观察缺氧时间与三者之间的相关关系。结果:CoCl2可诱导脐静脉细胞中sFlt-1 mRNA的表达,导致细胞损伤,降低细胞活性,三者与缺氧时间呈依赖性。结论:缺氧损伤的脐静脉内皮细胞,细胞增殖能力下降,sFlt-1 mRNA表达增加,可能促进妊娠期高血压疾病的发病。     

甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白真核表达载体的构建与表达

[目的]构建甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白真核表达载体,并在293T细胞中表达.[方法]采用RT-PCR技术,从甲型流感病毒H1N1毒株提取的病毒总RNA中,扩增NS1全长基因,将其克隆至pMD18-T Vector中构建pMD18-T-NS1质粒,双酶切pMD18-T-NS1与PXJ40-HA后,构建真核表达载体PXJ40-HA-NS1,经酶切及测序鉴定后将质粒转染到293T细胞中,通过免疫印迹法鉴定NS1蛋白的表达.[结果]酶切、测序证明重组真核表达载体PXJ40-HA-NS1构建成功,免疫印迹法可见NS1基因编码蛋白表达.[结论]成功构建甲型流感病毒H1N1亚型NS1蛋白真核表达载体PXJ40-HA-NS1,并在293T细胞中传染表达,该表达载体的构建为后期建立稳定表达NS1蛋白的细胞模型和NS1蛋白功能研究提供了材料.     

结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因真核表达载体的构建及鉴定

[目的]构建结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因的真核表达载体pcDNA3-Rv3873，并对其进行鉴定。[方法]利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因，并将其定向克隆至原核载体pGEx-4T-1中，经测序鉴定后，将重组质粒pGEX-4T-1-Rv3873中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3．1（＋），构建重组子pcDNA3．1-Rv3873，通过限制性内切酶切酶及PCR进行鉴定。[结果]克隆的Rv3873基因序列与GenBank公布的一致性为100％，限制性内切酶酶切及PCR分析表明Rv3873已成功插入pcDNA3．1（＋）中。[结论]成功构建了Rv3873基因真核表达载体，为进—步研究新型结核杆菌DNA疫苗奠定了基础。     

降血压肽对人脐静脉内皮细胞eNOS、iNOS 、ET-1 mRNA表达的影响

目的和方法:采用RT-PCR技术分析降血压肽(ACEIP)对人脐静脉内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮素-1(ET-1)mRNA表达水平的影响,从而探讨降血压肽降血压的部分作用机制。结果:与对照组比较,不同剂量的降血压肽可降低ET-1、iNOSmRNA的表达;升高eNOSmRNA的表达,均以ACEIP中剂量组效果最明显(P<0.01)。结论:降血压肽降低血压的机制可能与其降低人脐静脉内皮细胞ET-1、iNOS的基因表达;诱导eNOS基因表达有关。     

降血压肽对人脐静脉内皮细胞eNOS、iNOS、ET-1mRNA表达的影响

目的和方法:采用RT-PCR技术分析降血压肽(ACEIP)对人脐静脉内皮细胞内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、内皮素-1(ET-1)mRNA表达水平的影响,从而探讨降血压肽降血压的部分作用机制。结果:与对照组比较,不同剂量的降血压肽可降低ET-1、iNOSmRNA的表达;升高eNOSmRNA的表达,均以ACEIP中剂量组效果最明显(P<0.01)。结论:降血压肽降低血压的机制可能与其降低人脐静脉内皮细胞ET-1、iNOS的基因表达;诱导eNOS基因表达有关。