丙型肝炎病毒核心区基因的克隆，表达及抗原活性分析

本文通过逆转录（RT）－聚合酶链式反应（PCR）从一份来自甘肃武威地区献血员HCV阳性血中扩增并克隆到573bp的HCV核心基因全自段,用T－A克隆载体法将此片段接入克隆载体pUC19中,进行核苷酸序列测定后发现,武威地区分离株与HCV I型株HCV－I和HCV－II型株HCV－Hebei在该基因区段的核苷酸／氨基酸序列同源性分别为89．6％／95．4％和97．3％／97．4％。利用原核高效表达载体pTrCHisA在大肠杆菌中有效地表达了带有6个组氨酸的C区融合蛋白,通过中和抑制ELISA和Western-blot对占菌体总蛋白15％以上的表达产物进行了鉴定,有Probond resin column对表达产物进行了亲和层析纯化,纯化产物用于检测HCV阴阳性血清标本,初步表明该抗原有很好的免疫反应性和特异性,与日本东燃公司C11抗原活性和特异性基本一致。     

携带p16基因真核表达质粒载体的构建

p16基因定位于9p21,编码一个16kD的蛋白质,此蛋白质是一种细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）的抑制因子（CDK4I）。有研究发现将全长p16基因的cDNA导入无p16基因的人类胶质瘤细胞中可显抑制其生长。因此,构建p16真核表达载体,针对恢复p16基因功能的基因治疗策略,将对肿瘤的治疗产生积极的意义。     

乙型肝炎病毒PreS/S基因真核表达质粒的构建

目的克隆乙肝病毒PreS/S基因及构建真核表达质粒。方法以HBSAg阳性患者DNA为模板PCR法扩增PreS/S基因,PCR产物测序分析正确后克隆至真核表达载体pcDNA3.1。结果酶切鉴定和序列分析证实构建质粒含PreS/S基因。结论 PreS/S基因克隆及其真核表达质粒构建成功可用于肝癌发生发展的分子生物学研究。     

仙台病毒HN基因真核表达质粒对幼鼠免疫效果的评价

目的：评价仙台病毒HN基因真核表达质粒pcDNA3.HN对幼鼠的免疫效果.方法：使用去内毒素的构建质粒肌内注射免疫幼鼠,设立阳性对照和阴性对照组,观察靶器官的变化和免疫应答效果.结果：仙台病毒HN基因可以很好地诱导实验小鼠的细胞免疫和体液免疫,能够很大程度地保护肺组织免受随后仙台病毒的攻击.结论：仙台病毒HN基因真核表达质粒良好的免疫效果为今后开发基因疫苗提供了理论和实践依据.     

野生型DPP Ⅳ真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建野生型DPP Ⅳ真核表达质粒。方法将野生型DPP Ⅳ基因定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建成重组质粒pcDNA3 DPP Ⅳ;然后用限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定。结果经酶切和DNA序列测定鉴定证实重组质粒构建正确。结论真核表达质粒pcDNA3DPP Ⅳ构建成功,为进一步研究DPP Ⅳ基因在卵巢癌细胞中的表达和生物学作用奠定了基础。     

江苏地区丙型肝炎病毒基因分型研究

我们对江苏地区76例慢性丙型肝炎患进行了丙型肝炎病毒(HCV)基因分型,以了解江苏地区HCV基因型／亚型的分布状况及其在传播途径、疾病临床轻重程度之间的差异性。     

SP-D基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的构建并鉴定含肺表面活性蛋白D(SP-D)基因的重组真核表达质粒。方法提取A549细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增含SP-D基因的cDNA,将产物克隆进真核载体pGEFP-N1内,构建含SP-D基因的重组真核表达质粒。将pGEFP-N1-SP-D重组质粒和pGEFP-N1空载体分别转染293T细胞,Western blot法检测SP-D的蛋白表达。结果双酶切鉴定及核酸序列分析证实,SP-D已成功插入真核载体pGEFP-N1内。转染pGEFP-N1-SP-D的293T细胞中检测到高表达的SP-D蛋白。结论成功构建含SP-D基因的重组真核表达质粒,并能在293T细胞中高表达。     

SLPI基因真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建并鉴定含分泌型白细胞蛋白酶抑制蛋白(SLPI)基因的重组真核表达质粒。方法以HeLa细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出SLPI基因cDNA,将产物克隆进真核载体pcDNA3.1(+)内,构建含SLPI基因的重组真核表达质粒。将pcDNA-SLPI重组质粒和空载体pcDNA分别转染HeLa细胞,Western blot检测SLPI蛋白表达。结果核酸序列分析及双酶切鉴定SLPI已成功插入pcDNA3.1(+)载体中,转染pcDNA-SLPI的HeLa细胞中检测到高表达的SLPI蛋白。结论成功构建了含SLPI基因的重组真核表达质粒。     

尿激酶受体反义RNA真核表达质粒的构建

目的构建尿激酶受体(UPAR)基因pcDNA3.1(-)真核表达质粒,为进一步研究通过UPAR干预类风湿关节炎的发生发展提供实验基础。方法取冰冻保存的小鼠肝癌组织,应用TRIzol法提取总RNA,琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA浓度和纯度。使用一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒获得目的基因(UPAR)cDNA片段。用CaCl2法诱导感受态细胞。将真核载体pcDNA3.1(-)在多克隆位点处用HindⅢ、BamHⅠ双酶切线性化,切胶纯化回收;将纯化回收的pcDNA3.1(-)线性化载体和UPAR基因片段定向及反向连接,构建以pcDNA3.1(-)为载体的反义UPAR基因表达质粒;转化JM109大肠杆菌;酶切证实的阳性克隆行测序分析。结果琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性,见28S,18S条带完整,而且28S条带亮度为18S的1倍左右,认为RNA完整性良好,并用紫外分光核酸蛋白分析仪测定RNA纯度A260/A280=1.9051,认为RNA纯度良好;RNA浓度为450mg/L;阳性克隆经双酶切后行10g/L琼脂糖电泳,在DNAMarker500bp和5.3bp附近可见两条明显条带,与所需目的片段大小相符,证实为阳性克隆,重组质粒构建成功;DNA测序结果与预期目的片段序列一致。结论反义UPAR真核表达重组质粒构建成功。     

E2F6基因真核表达质粒的构建与鉴定

目的 构建含E2F6基因的重组pFLAGCMV10质粒并进行鉴定.方法 以人全血细胞的总RNA为模板,用RT-PCR方法 扩增出E2F6基因.将PCR产物克隆进真核载体pFLAGC-MV10内,构建含E2F6基因的重组真核表达质粒.重组质粒转染293T细胞,用Western blot方法 检测E2F6在293T细胞中的表达.结果 核酸序列分析的结果 表明,克隆的E2F6基因与GenBank中已登记的E2F6基因序列100%同源.Western blot结果 显示,在约35-kD位置有目的 条带,与预期的重组E2F6蛋白大小一致.结论 成功构建了含E2F6基因的真核表达质粒.     

E3泛素连接酶HECTD3真核表达质粒的构建

目的：克隆E3泛素连接酶（homologous to the E6-associated protein carboxyl terminus domain containing 3, HECTD3）基因及构建真核表达质粒。方法提取人卵巢癌细胞SKOV-3细胞RNA,并逆转录为cDNA,以此作为模板PCR法扩增HECTD3基因,将其克隆至真核表达载体pcDNA3.1（＋）,测序验证构建质粒中包含HECTD3基因。结论 HECTD3基因克隆及真核表达质粒构建成功,可以用于后续卵巢癌发生发展的分子生物学研究。     

HCV Core基因真核表达载体构建及其对HeLa细胞自噬的影响

目的 构建丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白（Core）真核表达载体,并研究其对人宫颈癌 HeLa细胞自噬功能的影响。方法 以 HCV复制子质粒 pJFH1为模板,PCR法扩增 HCV Core 基因片段,经纯化回收后与 PLVX-IRESZsGreen1载体用同源重组法相连,构建 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,并经测序验证其序列的正确性。转染宫颈癌 HeLa细胞,并设 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组、PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组以及未转染质粒空白对照组,通过免疫印迹法验证 HCV Core蛋白在 HeLa细胞中的表达,并用免疫荧光（IF）和免疫印迹检测自噬生物标记物微管相关蛋白 1轻链 3（LC3）的表达水平。结果 获得 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒,测序结果表明构建的重组质粒序列完全正确,HCV Core重组蛋白可在 HeLa细胞中有效表达;免疫荧光和免疫印迹结果表明,HCV Core过表达细胞 LC3焦点和 LC3 Ⅱ蛋白表达水平明显增多,PLVX-IRES-ZsGreen1-Core重组质粒转染组的细胞 LC3 Ⅱ水平（1.069±0.049）高于 PLVX-IRES-ZsGreen1空载体转染对照组（0.776±0.047）,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 成功构建了 PLVX-IRES-ZsGreen1-Core 重组质粒,HCV Core 蛋白过表达可诱导 HeLa 细胞自噬。     

含绿色荧光蛋白及人胰岛素基因的真核表达载体的构建

目的构建含绿色荧光蛋白(GFP)基因与人胰岛素基因的重组真核表达载体。方法将人胰岛素基因插入到真核表达载体pIRES2-EGFP的EcoRⅠ和BamHⅠ位点中,构建重组质粒pIRES2-EGFP-INS。酶切鉴定,测序证实。结果重组真核表达载体pIRES2-EGFP-INS经限制性内切酶EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,电泳后显示360bp的INS的目的片段和5.3kb的pIRES2-EGFP载体片段,进一步测序并证明重组质粒连接正确。结论成功构建了pIRES2-EGFP-INS重组质粒,为简便快速了解胰岛素基因的转染效率奠定了基础。     

变形链球菌重组质粒作为防龋基因疫苗安全性的研究

目的　本研究将已构建的重组质粒pcDNA3-pacA和pcDNA3-pacP经颌下腺区注射免疫wistar大鼠 ,观察基因重组质粒对机体的影响。方法　重组质粒pcDNA3-pacA、pcDNA3-pacP和pcDNA3-pacA与pcDNA3-pacP联合使用作为基因疫苗经颌下腺区皮下注射免疫定菌鼠 ,观察并记录实验前后各实验组大鼠的体重变化。结果　重组质粒免疫组大鼠的体重变化与阴性对照组和空白对照组的差异无统计学意义 (P>0 .0 5 )。结论　重组质粒pcDNA3-pacA和pcDNA3-pacP免疫后 ,对机体发育无影响 ,具有可靠性和安全性     

组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体的构建和鉴定

目的利用pEGFP-N1真核表达载体构建组蛋白去乙酰化酶3真核表达载体pEGFP-Hdac3,并鉴定其在大鼠肝癌细胞系CBRH-7919中的表达。方法利用大鼠肝脏cDNA为模板,聚合酶链反应(PCR)获取目的基因Hdac3;用HindⅢ、BamH I双酶切真核表达载体pEGFP-N1和目的基因Hdac3,用T4 DNA连接酶连接纯化后的酶切产物;连接产物转化DH5α大肠杆菌感受态细胞并挑选阳性克隆,并通过PCR、双酶切、DNA测序鉴定构建的重组质粒。利用测序正确的重组体转染CBRH-7919细胞,检测Hdac3和PPAR-γ的mRNA表达。结果利用基因克隆技术获得组蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3重组质粒。PCR,双酶切,DNA测序证实目的基因H-dac3已成功插入pEGFP载体中。用重组质粒转染大鼠肝癌细胞系CBRH-7919后Hdac3 mRNA表达显著升高、而PPAR-γmRNA表达明显降低。结论本研究成功构建了蛋白去乙酰化酶3的真核表达载体pEGFP-Hdac3。     

pmRNA IRWS-hKDR重组质粒的构建、表达及鉴定

目的利用基因工程技术构建pmRNA IRES-hKDR重组质粒载体,为肿瘤的基因治疗研究奠定基础.方法利用本实验室保存的pDC520 hKDR用XbaⅠ和NcoⅠ顺序酶切,pmRNA IRES-Luc亦用XbaⅠ和NcoⅠ顺序酶切,通过分子生物学技术构建了pmRNA IRES-hKDR重组质粒,用PCR、酶切鉴定,然后用脂质体转染Hepall-6细胞,用G418筛选后通过ELISA和Western blot检测该融合蛋白.结果重组质粒中含有pmRNA IRES-hKDR基因,转染Hepall-6细胞后,其表达产物能分泌到肿瘤细胞外,分泌到细胞外的产物用Westem blot检测证明能与特异性hKDR抗体结合.结论成功构建含pmRNA IRES-hKDR真核表达重组质粒,有助于进一步研究其抗肿瘤作用.     

环氧化酶2特异性siRNA真核表达质粒的构建与鉴定

目的 构建环氧化酶2(COX-2)特异性小干扰RNA(siRNA)真核表达质粒,研究其对人结肠癌细胞COX-2的阻抑作用.方法 设计短发夹结构的COX-2 siRNA对应模版DNA序列,退火处理后克隆至pGPH1-GFP-Neo质粒,构建重组质粒pGPH1-GFP-Neo-COX-2.将重组质粒转染人结肠癌HT-29细胞,采用RT-PCR、Western blot分别从mRNA和蛋A水平检测COX-2表达.结果 酶切及测序证实质粒pGPH1-GFP-Neo-COX-2构建成功.转染重组质粒72h后可以显著抑制HT-29细胞COX-2mRNA和蛋白表达(P<0.05).结论 成功构建的COX-2siRNA真核表达质粒pGPH1-GFP-Neo-COX-2可以抑制人结肠癌HT-29细胞COX-2基因表达.     

靶向血管内皮生长因子和神经生长因子的shRNA真核表达载体的构建与鉴定

目的利用RNA干扰（RNAi）技术,构建靶向血管内皮生长因子（VEGF）、神经生长因子（NGF）双基因的短发夹RNA（short hairpin,shRNA）真核表达载体用于胶质瘤基因治疗。方法分别设计并体外合成靶向基因VEGF、NGF的特异性编码shRNA序列的寡核苷酸,克隆到经BglⅡ—HindⅢ酶切线性化的pSUPER质粒H1启动子下游,构建shRNA重组质粒,进而脂质体介导瞬时转染胶质瘤细胞系U251,半定量RT-PCR检测VEGF mRNA、NGF mRNA表达。结果重组质粒经过酶切鉴定和测序,插入片段的序列大小、位点和方向均与已合成的寡核苷酸的序列完全一致,在瞬时转染胶质瘤细胞后下调了VEGF mRNA、NGF mRNA的表达。结论成功构建靶向基因VEGF、NGF的shRNA真核表达载体,为进一步应用RNAi技术,研究其对胶质瘤的抑制作用奠定基础。     

构建能与pZ189系列穿梭质粒配套适用的真核细胞表达载体

为有效分离实验系统中同时存在于哺乳类细胞中的两种质粒, 利用插入失活对真核细胞表达质粒的抗性进行改建. 以具有编码氨苄抗性基因的pREP9质粒和同时有编码氨苄和卡那抗性基因的pMAMneo质粒为起始模板得到无氨苄抗性而具有卡那抗性的真核细胞表达质粒: pREP9-amp^-和pMAMneo-amp^-. 前者可用于外源基因在细胞内的持续表达而后者对外源基因表达受地塞米松的诱导. 当细胞中同时转染有其他抗性的质粒时,可以通过抗生素抗性的不同而使两种质粒得到有效地分离和筛选, 并能与pZ189穿梭质粒配套应用于突变研究.