外源性P73基因对WtP53型人肺腺癌细胞A549化疗敏感性的影响

目的 研究外源p73基因转染wtp53型人肺腺癌A549细胞对其化疗药物敏感性的影响。方法 用脂质体介导的转染技术。将含有全长人野生型p73α cDNA和野生型p53 cDNA的真核表达重组质粒分别导入A549细胞，观察基因转染前后肿瘤细胞对化疗药物顺铂和阿霉素敏感性的变化。结果 A549-p73α细胞可以稳定地表达P73α蛋白，其生长速度较未转染p73α和转染wtp53基因的A549细胞明显减慢，克隆形成数下降，凋亡细胞明显增多。与未转染组比较，在原本没有抑制和杀伤作用的化疗药物浓度作用下A549-p73α细胞生长明显受到抑制，顺铂和阿霉素的IC50值分别降低为约1／6和／70。结论 研究显示外源性p73基因的导人增加了wtp53型人肺腺癌A549细胞对顺铂和阿霉素等化疗药物的敏感性，为p73基因用于治疗wtp53不能发挥作用的恶性肿瘤提供实验依据。     

p53反义RNA对人肺癌细胞表型和顺铂敏感性的影响

目的 研究外源p53反义RNA对有p53基因248密码点突变的人肺癌细胞系恶性表型和顺铂敏感性的影响。方法 构建p53反义RNA真核细胞表达载体PEGFP－p53（AS),经酶切图证明反向联结质粒。Lipofectin介导转染有p53基因248密码点突变的人肺癌细胞系801D，经G418筛选获耐受克隆。稀释法建立单细胞克隆系，应用PCR检测外源基因，荧光显微镜检测细胞绿色荧光蛋白表达，p53单抗免疫组化染色检测p53突变蛋白表达，体外集落形成实验检测细胞生长，流式细胞仪检测细胞周期，MTT法检测细胞对顺铂药物敏感性。结果 酶切图证明了p53-cDNA反向联结于质粒，构建了PEGFP－p53(AS),并建立了转染单细胞克隆系PEGFP－p53(AS)-801D及空载细胞系PEGFP－801D。PCR检测外源p53基因和neo基因存在于转染细胞系，而荧光显微镜下发现其胞浆有绿荧光蛋白表达。免疫组化染色p53突变蛋白在801D细胞系为阳性，而PEGFP－p53(AS)-801D为阴性，证明外源反义p53在转染细胞稳定表达并封闭内源突变蛋白表达。与母系相比，PEGFP－p53(AS)-801D集落形成抑制率为61％（P＜0．01），流式细胞检测该细胞系G1期细胞数明显增中，出现G1期阻滞的表现。MTT检测PEGFP－p53(AS）－801D对顺铂比母系更为敏感。结论 有p53基因248密码点突变的801D细胞恶性增殖明显，对顺铂耐药，外源p53反义RNA可封闭突变蛋白表达，抑制细胞体外恶性增殖，增加对顺铂的药物敏感性。转染p53反义RNA可抑制p53突变的恶性表型或恢复野生型p53基因功能。     

野生型p53基因转染对卵巢癌细胞生长及药物敏感性影响

目的：探讨野生型p53基因转染对人卵巢癌细胞株SKOV-3的体外生长及裸鼠体内致瘤性抑制作用。并了解p53基因与SKOV-3细胞对顺铂敏感性之间的关系。方法：利用脂质体介导,将含有人野生型p53cDNA的真核表达质粒pCB6-p53导入SKOV-3细胞中,观察该细胞体外生长和裸鼠体内致瘤性改变;应用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况,MTT法检测细胞药物敏感性改变。结果：免疫组化法证实外源性p53基因在阳性细胞克隆稳定存在;转染野生型p53基因的SKOV-3细胞体外生长速率下降,裸鼠体内致瘤性丧失;G1/G0期细胞百分比（81.5%)和凋亡细胞百分比（11%）增高;p53表达阳性的SKOV-3细胞对顺铂的敏感性明显增强。结论：野生型p53基因转染能使SKOV-3细胞出现生长抑制和对顺铂的化疗敏感性增强。     

野生型p53基因转染对卵巢癌细胞生长及药物敏感性影响

目的:探讨野生型p53基因转染对人卵巢癌细胞株SKOV-3的体外生长及裸鼠体内致瘤性抑制作用,并了解p53基因与SKOV-3细胞对顺铂敏感性之间的关系.方法:利用脂质体介导,将含有人野生型p53cDNA的真核表达质粒pCB6-p53导入SKOV-3细胞中,观察该细胞体外生长和裸鼠体内致瘤性改变;应用流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况,MTT法检测细胞药物敏感性改变.结果:免疫组化法证实外源性p53基因在阳性细胞克隆稳定存在;转染野生型p53基因的SKOV-3细胞体外生长速率下降,裸鼠体内致瘤性丧失;G1/G0期细胞百分比(81.5%)和凋亡细胞百分比(11%)增高;p53表达阳性的SKOV-3细胞对顺铂的敏感性明显增强.结论:野生型p53基因转染能使SKOV-3细胞出现生长抑制和对顺铂的化疗敏感性增强.     

p53基因对人肺癌细胞系耐药性的影响

背景与目的肺癌细胞的耐药性是影响化疗疗效的重要因素之一,已有的研究表明p53基因异常与肿瘤细胞耐药性的产生密切相关。本研究的目的是探讨不同状态的p53基因对人肺癌细胞系耐药性的影响,为临床选择有针对性的化疗药物提供依据。方法采用质粒pEGFP,分别构建含正义、反义p53cDNA的真核细胞表达载体,测序法检测外源p53基因。用脂质体介导转染人肺癌细胞系801D,建立含不同p53基因状态的单克隆细胞系,分别为pEGFP-801D、pEGFP-sensep53-801D[含有正义p53,pEGFP-p53(RS)-801D]、pEGFP-antisensep53-801D[含有反义p53,pEGFP-p53(AS)-801D]。荧光显微镜观察细胞绿色荧光,PCR法检测外源基因,MTT法检测耐药性,流式细胞术检测细胞周期与凋亡。结果测序结果显示外源p53基因分别以正向、反向连接于载体,荧光显微镜下转染细胞可见绿色荧光,PCR法检测出外源p53基因和neo基因。pEGFP-p53(AS)-801D细胞系对顺铂(Cisplatin,DDP)的IC50为0.26±0.09μg/mL,显著低于母系(0.55±0.19μg/mL,P<0.05)和空载系(0.77±0.13μg/mL,P<0.05)。pEGFP-p53(RS)-801D细胞系对DDP的IC50为0.43±0.25μg/mL,显著低于空载(P=0.000)但高于pEGFP-p53(AS)-801D(P<0.05)。pEGFP-p53(RS)-801D细胞系对紫杉醇(Paclitaxel,TAX)的IC50为2.34±0.43ng/mL,显著低于母系(8.40±1.50ng/mL,P﹤0.05),低于空载系但无显著差异。pEGFP-p53(RS)-801D细胞系对5氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5FU)的IC50为2.08±0.18μg/mL,显著低于母系(4.90±1.12μg/mL,P<0.05)和空载系(3.41±0.86μg/mL,P<0.05)。DDP能诱导pEGFP-p53(AS)-801D出现G2期阻滞,TAX、5FU诱导pEGFP-p53(RS)-801D细胞系分别出现G2、S期阻滞,DDP、TAX能诱导细胞凋亡和死亡。结论肺癌细胞中不同状态的p53基因对化疗药的耐药性有不同影响。p53突变、缺失与DDP耐受相关,p53缺失与TAX、5FU耐受相关,p53突变或缺失与长春瑞宾(Navelbine,NVB)、吉西他宾(Gemcitabine,GEM)耐药均无关。提示针对患者个体的基因情况选用敏感化疗药有助于提高疗效。     

p53缺失和突变对人肺癌细胞系恶性表型影响的比较

目的 比较研究外源正义和反义p53对所转染细胞系恶性表型的影响。方法 构建正义和反义p53cDNA真核细胞表达载体pEGFP-p53(RS)和pEGFP-p53(AS)。用Lipofectin介导转染801D细胞。PCR检测外源p53和neo基因，荧光显微镜检查转染细胞绿荧光蛋白，免疫组化染色检测突变蛋白表达。比较pEGFP-p53(AS)-801D和pEGFP-p53(RS)-801D的集落形成试验和裸鼠移植试验，用流式细胞术分析细胞周期。结果 PCR检测出外源p53和neo基因存在于细胞，细胞可见绿色荧光，免疫组化检测示pEGFP-p53(AS)-801D突变蛋白呈阴性，母系为阳性，表明反义p53能封闭突变p53蛋白表达，pEGFP-p53（RS）-801D和pEGFP-p53(AS)801D细胞集落形成率和裸鼠移植成瘤性均降低，pEGFP-p53(RS)-801D更为明显。pEGFP-p53(AS)-801D细胞周期阻滞于G1期。结论 在同一细胞背景下，p53缺失比p53突变对恶性增殖起更重要的作用。外源野生型p53在肿瘤细胞中可恢复重建其功能，外源反义p53可封闭突变蛋白表达，阻止细胞停留于G1期。     

p73基因过量表达对人肺癌细胞A549凋亡及其化疗敏感性的作用

背景与目的：部分非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）表达野生型p53基因（wild-type p53,wt-p53）,因此在基因治疗中克服这些NSCLC对wt-p53的抵抗机制就非常重要。P53基因家族的新成员p73是p53的同源体,本研究旨在探讨对wt-p53基因治疗抵抗的人肺腺癌细胞A549在外源p73基因转染或联用化疗药后凋亡程度和对化疗药物敏感性的变化。方法：将真核表达重组质粒pcDNA3-HA-p53或pcDNA3-HA-p73α转染入A549细胞,G418筛选,Western blot检测P53或P73α的表达。MTT法分析转染细胞对顺铂和阿霉素的敏感性,用流式细胞术、TUNEL法和DNA片段法分析化疗药作用下转染细胞的凋亡变化,克隆形成实验观察细胞生物学性状的改变。结果：转染p53或p73α基因的A549细胞可以稳定高表达p53或p73α蛋白。转染p73α的A549细胞在原本没有明显抑制和杀伤作用的药物浓度（6．25μmol／L的顺铂或0．25μmol／L的阿霉素）作用下生长明显受到抑制。顺铂的IC50值从22．65μmol／L降至3．75μmol／L,阿霉素的IC50值从4．20μmol／L降至0．06μmol／L。p73能使A549细胞受顺铂和阿霉素诱导的细胞凋亡增加。而p53没有明显作用。流式细胞术显示p73α基因转染后,顺铂诱导的细胞凋亡率从10．6％升高到36．8％（P〈0．01）,阿霉素诱导的细胞凋亡率从13．0％升高到41．1％（P〈0．01）。克隆形成实验显示．p73α基因转染能明显降低顺铂和阿霉素作用后A549细胞的克隆形成数（P〈0．01）。对顺铂和阿霉素的化疗增效倍数分别为2．0和2．4倍。结论：外源性p73基因的导入增加了wt-p53型A549细胞对顺铂和阿霉素等化疗药的敏感性。该作用可能与p73基因能不依赖于p53基因诱导细胞凋亡有关。p73基因可用于治疗wt-p53不能发挥作用的恶性肿瘤。     

p73基因对人肺腺癌细胞H1299化疗敏感性的影响

背景与目的:实验证明野生型p53基因能增强大多数非小细胞肺癌的化疗敏感性。p53基因的同源体p73与其在结构和功能上都具有高度的相似性。本研究拟探讨p73基因对人肺腺癌细胞株H1299化疗敏感性的影响。方法:通过脂质体介导将p73α基因导入人肺腺癌细胞株H1299,G418筛选获得稳定表达P73α的阳性细胞克隆。Westernblot检测转染细胞中P73α蛋白的表达;MTT法检测细胞存活率,观察转染细胞对阿霉素、顺铂的敏感性变化;采用流式细胞仪和TUNEL法检测.p73646化疗药诱导前后转染细胞凋亡的变化;克隆形成实验观察细胞生物学性状的变化。结果:转染p73α基因的H1299细胞可以稳定高表达P73α蛋白。MTT实验提示顺铂和阿霉素的IC50值分别减少了86.2%和99.2%,转染细胞在原本没有明显抑制和杀伤作用的药物浓度(1.25μmol/L的顺铂或0.05μmol/L的阿霉素)作用下生长明显受到抑制。流式细胞术显示p73α基因转染后顺铂诱导的细胞凋亡率从10.1%升高到38.4%(P<0.01),阿霉素诱导的细胞凋亡率从12.1%升高到49.3%(P<0.01)。克隆形成实验显示p73α基因转染能明显降低化疗后H1299细胞的克隆形成数(P<0.01),对顺铂和阿霉素的化疗增效倍数分别为1.8和2.6倍。结论:转染p73基因可以提高H1299细胞对阿霉素、顺铂等化疗药的敏感性。该作用可     

克隆肺腺癌亲代细胞A_(549)与耐顺铂细胞A_(549)~(DDP)耐药相关基因的差异表达片段

目的　克隆肺腺癌耐药相关基因。方法　以mRNA差异显示技术检测耐顺铂肺腺癌细胞A54 9DDP及其亲代细胞A54 9基因表达的差异。差异表达基因片段被克隆并经Northernblot证实。结果获得 4个基因表达的差异cDNA片段 ,经测序、同源性分析 ,其中 2个片段 (A1、D1)在GeneBank中未发现同源序列 ,一个片段 (A2 )与白介素 1β转化酶 (Interleukin 1βconvertingenzyme ,ICE) 89%同源性 ,一个片段 (D2 )与MM45srRNA(Mousemusculus 45spre rRNA)基因 10 0 %同源。A1、A2 cDNA片段仅表达于A54 9细胞 ,D1、D2 cDNA片段仅表达于A54 9DDP细胞。结论　应用mRNA差异显示技术获得 4个肺腺癌A54 9与A54 9DDP间的基因差异表达片段。 2个新的差异表达片段以及与ICE、MM45sRNA高度同源的基因片段是否与耐药相关尚需进一步研究。     

克隆肺腺癌亲代细胞A549与耐顺铂细胞A549^DDP耐药相关基因的差异表达片段

目的：克隆肺腺癌耐药相关基因。方法以mRNA差异显示法技术检测耐顺铂肺腺癌细胞A549^DDP及其亲代细胞A549基因表达的差异。差异表达基因片段段被克隆并经Northern blot证实。结果获得4个基因表达的差异cDNA片段,经测序,同源性分析,其中2个片段（A1、D1）在GeneBank中未发现同源序列,一个片段（A2）与白介素－1β转化酶（Interleukin 1 β怀脲,ICE）89％同源性,一个片段（D2）与MM45s rRNA(Mouse musculus 45s pre-rRNA)基因100％同源。A1、A2cDNA片段仅表达于A549细胞,D1、D2cDNA片段仅表达于A549^DDP细胞。结论应用mRNA差异显示技术获得4个肺腺癌A549与A549^DDP间的基因差异3表达片段。2个新的差异表达片段以及与ICE、、MM45sRNA高度同源的基因片段是否与耐药相关尚需进一步研究。     

p53C末端356～393氨基酸对人肺癌细胞恶性表型的影响

目的　研究去除C末端 3 56～ 3 93氨基酸p53对人肺癌细胞恶性增殖抑制的影响。方法利用DNA重组技术 ,构建去掉C末端 3 56～ 3 93区 3 7个氨基酸残基p53和全长p53真核细胞表达质粒[pEGFP p53 (del) ,pEGFP p53 ]。p53缺失和突变的人肺癌细胞系 80 1D为受体细胞 ,lipofectin介导质粒转染细胞。G418筛选 ,建立转染克隆细胞系。以PCR、荧光显微镜检查外源基因的表达 ;以集落形成和裸鼠移植瘤试验检测细胞体内外恶性增殖能力 ;以移植瘤或接种部位细胞团印片检查荧光蛋白表达。结果　建立了转染克隆细胞系pEGFP p53 80 1D、pEGFP p53 (del) 80 1D和pEGFP 80 1D ,证明有外源p53基因存在和外源绿色荧光蛋白基因表达。pEGFP p53 (del) 80 1D体外集落形成抑制率为 99.6% ,pEGFP p53 80 1D为 81.1% ,pEGFP p53 (del) 80 1D细胞恶性增殖能力明显低于pEGFP p53 80 1D (P <0 .0 1)。pEGFP p53 (del) 80 1D形成的少数集落也有外源p53基因和绿色荧光蛋白表达。裸鼠移植瘤试验显示 ,对照组 80 1D和pEGFP 80 1D移植瘤为阳性 (4/ 4,4/ 4) ,pEGFP p53 (del) 80 1D和pEGFP p53 80 1D移植瘤为阴性 ,接种细胞部位仍有残留细胞团存在 ,有少数表达荧光蛋白的活细胞。结论去除C末端 3 56～ 3 93氨基酸的p53 ,在体外可明显     

逆转录病毒介导p53基因对食管癌细胞株的生长抑制作用

目的观察人类野生型p53(wt p53)基因对人食管癌细胞系的抑制作用.方法用逆转录病毒为载体将外源性wt p53基因导入人食管癌细胞系ECA109,通过体外及小鼠体内实验研究转入基因的表达及对肿瘤的抑制作用.结果 p53在转染细胞ECA109/p53中表达水平提高.外源性wt p53基因的导入和表达能使ECA109细胞的生长速率减低,软琼脂集落形成能力下降,G0 G1期细胞比例增加、S期细胞比例降低,凋亡指数升高,裸鼠体内成瘤能力明显下降.结论逆转录病毒载体介导的外源性野生型p53能够抑制人食管癌细胞生长.     

外源p53对人肺癌细胞生长的抑制

目的　观察外源性野生型p53对有p53基因突变的人肺癌细胞系生长的影响。方法　用PCR SSCP及DNA测序 ,选择p53突变的人肺巨细胞癌系 80 1 D。构建野生型p53表达质粒PZiP p53。用基因枪介导外源基因。经G41 8筛选得到转染细胞系 80 1 D p53。用PCR检测外源基因 ,观察转染细胞恶性生长的变化。结果　转染细胞系 80 1 D p53体外长期传代有外源性p53基因存在 ,转染细胞生长明显受到抑制 ,集落形成抑制率达 96% ,裸鼠异种移植致瘤性降低 ,肿瘤生长明显缓慢。结论　外源性野生型p53经基因枪导入有p53基因突变的人肺癌细胞后可长期存在于转染细胞中 ,且明显抑制所转染的癌细胞的恶性生长。     

MAG-2对肺癌细胞系PLA801生长的影响及其机制的研究

背景与目的 肿瘤的发生、发展、增殖及转移是多种基因的结构、功能和表达情况改变积累的结果.MAG-2是利用抑制消减杂交技术获得的与肺癌转移相关的新基因,实验证实该基因与肺巨细胞癌细胞的转移密切相关.本研究的目的在于研究基凶MAG-2对肺巨细胞癌细胞增殖的影响及其分子机制.方法构建MAG-2的正反义表达载体,分别转染PLA801C和PLA801D,获得稳定表达相应序列的细胞株;然后利用MTT实验、流式细胞术、Fluo-3-Am荧光染料染色实验观察了这两株稳定转染细胞的细胞增殖能力、细胞周期的组成、细胞内游离Ca2 浓度变化,并用Western blot及RT-PCR实验检测MAC-2对p53、PCNA等分子的影响.结果 MAG-2正义载体转染能增加PLA801C株细胞内PCNA的转录,抑制p53突变蛋白的水平,增加s期细胞所占的比例,增加细胞内游离(Ca2 浓度,对细胞具有一定的促增殖作用;MAG-2反义载体转染可以降低细胞内游离Ca2 浓度,抑制PLA801D株细胞的增殖,但是对p53和PCNA的影响不明显.结论 MAG-2对肺癌细胞PLA801具有促增殖的作用,通过影响细胞内游离Ca2 浓度来实现对细胞增殖的调节是其可能的机制之一.     

乏氧状态下外源性野生型p53基因对肺癌细胞照射敏感性的影响

目的 将重组人外源性野生型p53(wtp53)基因的腺病毒转染人肺腺癌细胞系(A549),在乏氧状态下舰察wtp53基因对A549细胞照射后存活的影响.方法 实验分为有氧状态下单纯照射组、照射+wtp53基因转染组,乏氧状态下单纯照射组、照射+wtp53基因转染组.给予9MeV电子束照射0、2、4、6、8、10 Gy,测定克隆形成率,用多靶单击模型拟和生存曲线,计算D0、Dq值和氧增强比(OER)、p53基因照射增敏比(SER).流式细胞仪检测4个组细胞凋亡率.结果 单纯照射时OER=1.75,转染wtp53后OER=0.81.有氧状态下wtp53的SER=1.77,乏氧状态下wtp53的SER=3.84.细胞凋亡率:未转染p53基因时,乏氧照射低于有氧照射组(F=7.92,P=0.048);有氧照射时单纯照射低于照射+wtp53基因转染组(F=52.44,P=0.001),乏氧照射时单纯照射低于照射+wtp53基因转染组(F=82.50,p=0.001);有氧照射+wtp53基因转染组和乏氧照射+wtp53基因转染组的凋亡率相似(t=2.04,P=0.111).结论 乏氧能够增加肺癌细胞埘照射的抗拒性.wtp53基因可以促进乏氧状态下的A549细胞的凋亡和提高放射敏感性.     

Apoptosis-related gene expression after hyperthermia in human tongue squamous cell carcinoma cells harboring wild-type or mutated-type p53

Hyperthermia is useful for the treatment of human head and neck cancer, as it is relatively easy to perform thermoregulation when compared with deep organs. In this study, we focused attention on the p53 as a predictive indicator of hyperthermic cancer therapy. We used two kinds of cell lines of a human squamous cell carcinoma (SAS) with identical backgrounds of function except for the p53 protein. We assayed the heat sensitivity, frequency of apoptosis, and apoptosis-related gene expression after heat treatment using DNA array. The SAS/neo (wild-type p53; wtp53) cells were sensitive to heat, and the induction of Caspase-3 activation and apoptosis in the wtp53 cells was clearly high compared with the SAS/mp53 (mutated p53; mp53) cells. The gene expression of apoptosis suppressive-genes such as IL-12 p35 decreased in the wtp53 cells, and IL-12 R beta1 increased in the mp53 cells, though apoptosis-promotive genes of Caspase-9, CD30 and CD40 were induced p53-independently by hyperthermia. It is suggested that heat-induced apoptosis was suppressed by IL-12-related genes in the mp53 cells. These findings strongly imply that p53 status is a useful candidate for a predictive indicator of the effectiveness in hyperthermic therapy.