乙型肝炎病毒多聚酶基因在重组杆状病毒系统中的表达

目的利用杆状病毒一昆虫细胞表达系统制备乙型肝炎病毒多聚酶重组蛋白。方法构建含有乙型肝炎病毒多聚酶基因的杆状病毒转移载体pFastbac Dual—polymerase，转化大肠杆菌DH10Bac进行转座，提取重组Bacmid转染昆虫细胞获得含有HBVpol基因的重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染昆虫细胞进行蛋白表达，用SDS—PAGE电泳分析表达情况。结果将所得Bacmid行PCR鉴定，结果表明成功构建了的含乙型肝炎病毒多聚酶基因的重组杆状病毒，SDS-PAGE分析表明该病毒能在昆虫细胞中高效表达重组的多聚酶蛋白。结论利用杆状病毒表达系统，构建的重组杆状病毒在昆虫细胞中高效表达乙型肝炎病毒多聚酶，为进一步的乙型肝炎病毒多聚酶的体外功能研究奠定了基础。     

CCHFV S基因的重组杆状病毒的构建及鉴定

目的　利用杆状病毒表达系统（baculovirus expression vector systems, BEVS）构建含有克里米亚-刚果出血热病毒（Crimean-Congo hemorrhagic fever virus, CCHFV）S基因的重组杆状病毒,并在sf9昆虫细胞中表达出核衣壳蛋白（nucleoprotein, NP）。方法　将合成的CCHFV S基因定向克隆入杆状病毒转移载体pFastBac? Dual,获得重组的转移载体pFastBac? Dual-CCHFV-S。将其转化到E. coli DH10Bac?感受态细胞中,筛选得到重组杆状病毒杆粒rBV-Bacmid-S。用Cellfectin? II试剂将rBV-Bacmid-S转染入sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒rBV-CCHFV-S。通过IFA和Western blot检测CCHFV S基因的表达。结果　构建了含有S基因的rBV-CCHFV-S,在sf9昆虫细胞中成功表达CCHFV NP。结论　利用BEVS 可以成功表达CCHFV NP,这为研究CCHFV NP的生物学特性,研制特异性的治疗药物和预防控制疫苗奠定基础。     

汉滩病毒核蛋白部分片段与囊膜糖蛋白G1在昆虫细胞中的融合表达

目的　应用Bac -to -Bac杆状病毒表达系统融合表达汉滩病毒囊膜糖蛋白G1与核蛋白部分片段。方法　构建含有汉滩病毒G1S0 7嵌合基因的杆状病毒表达载体 pFBD -G1S0 7,转化DH10Bac致敏菌 ,利用其含有的细菌Tn7转座系统将嵌合基因重组至穿梭质粒Bacmid上 ,快速筛选出含有G1S0 7嵌合基因的重组杆状病毒 ,在昆虫细胞中表达该融合蛋白 ,利用间接免疫荧光、ELISA和免疫印迹对表达产物进行检测。结果　构建的含G1S0 7嵌合基因之重组杆状病毒可在昆虫细胞中表达出融合蛋白 ,该蛋白可被抗汉滩病毒核蛋白及糖蛋白G1特异性单抗所识别 ,表达产物主要集中在细胞内。结论　在昆虫细胞中表达出具有生物学活性的G1S0 7融合蛋白 ,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础     

以人乳头瘤病毒16 L1为载体的流感通用疫苗初步研究

目的 构建以人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16 L1为载体的甲型流感病毒M2基因胞外区(M2e)通用疫苗杆粒,利用昆虫细胞杆状病毒表达系统,进行初步的蛋白表达.方法 利用PCR技术将甲型流感病毒M2e基因序列与HPVl6 L1相连.经酶切、酶联将融合基因插入pFastBacHTA载体,在DH10Bac细胞中进行同源重组,经测序鉴定后构建M2e-HPV16 L1杆粒,脂质体转染sf9昆虫细胞,收获并扩增含有M2e-HPV16 L1的杆状病毒,经扩增后获得高效价的重组杆状病毒,用SDS-PAGE、免疫荧光法和电镜检测目的蛋白的表达.结果 构建了以HPV16 L1为载体的M2e通用疫苗杆粒,通过转染sf9昆虫细胞得到初步M2e-HPV16 L1融合蛋白表达.结论 成功构建了HPV16 L1与甲型流感病毒M2e融合蛋白的病毒样颗粒,为流感通用疫苗的研制奠定了基础.     

日本血吸虫翻译控制肿瘤蛋白基因的杆状病毒表达载体构建和在昆虫细胞中的表达

目的构建日本血吸虫的翻译控制肿瘤蛋白(SjTCTP)基因的杆状病毒重组供体质粒pFASTA-TCTP,用该重组转移质粒转化含有杆状病毒表达载体以构建BacmidGFP-TCTP,感染昆虫细胞进行表达。方法将已克隆的SjTCTP基因与线性化的pFASTA进行连接为pFASTA-TCTP,使pFASTA-TCTP与DH10BAC感受菌进行转座重组,利用抗性及蓝白斑筛选重组BacmidGFP-TCTP克隆,提取BacmidGFP-TCTP转染昆虫细胞Sf9获得有感染力的病毒,利用病毒感染Sf9细胞进行蛋白表达,通过荧光镜观察、RT-PCR、SDS-PAGE和Western-Blotting检测表达情况。结果获得了重组SjTCTP的杆状病毒,细胞能表达出与SjTCTP单抗结合的、分子量为23kDa左右的融合有组氨酸标签的目的蛋白。结论SjTCTP能在昆虫细胞中获得良好表达,为其的分子生物学活性研究奠定了基础。     

昆虫细胞偏爱密码子优化的HPV16L1基因在昆虫和哺乳动物细胞中的表达

目的获得有效表达人乳头瘤病毒16型（HPV16）L1基因的重组杆状病毒和腺病毒，为研究HPV的免疫保护机制提供材料。方法按照昆虫细胞密码子偏爱优化并合成HPV16LI基因，利用Bac—to-Bac昆虫表达系统获得表达HPV16L1基因的重组杆状病毒，利用AdEasy腺病毒载体系统获得表达HPV16L1基因的重组腺病毒载体。通过间接免疫荧光和Westernblot对HPV16L1基因表达进行鉴定，利用负染电子显微镜观察病毒样颗粒（VLP）的形成。结果获得了稳定表达HPV16L1蛋白的重组杆状病毒和重组腺病毒载体，在Sf9细胞和293细胞中可有效表达能被抗HPV16L1单克隆抗体识别的L1蛋白，分子质量单位为56ku，在Sf9细胞中可观察到VLP的形成。结论按照昆虫细胞密码子偏爱进行优化的HPV16L1基因，在昆虫细胞和哺乳动物细胞内均可有效表达。     

狂犬病毒核蛋白基因的克隆表达及其免疫原性

目的构建狂犬病毒核蛋白(NP)基因的重组杆状病毒表达载体,在昆虫细胞中表达出具有免疫原性的抗原,用于狂犬病的检测及诊断。方法应用RT-PCR方法扩增ERA株狂犬病毒NP基因后克隆到PCR2.1TA载体,转化OneShortTMTOP10感受态细胞构建TA克隆载体,并与pFastBacTM1转座质粒载体分别用KpnΙ和NotΙ双酶切,用T4连接酶连接,构建pFast ERA-NP重组转座质粒,经双酶切、PCR扩增及插入序列方向鉴定后,转化到DH10BacTME.coli感受态细胞,经三抗培养基筛选和PCR扩增鉴定后获得重组Bacmid质粒,将重组Bacmid质粒转染Sf9昆虫细胞制备重组杆状病毒毒液,并继续扩增重组杆状病毒,以第三代毒液感染Sf9昆虫细胞,96h收获细胞,用直接免疫荧光(DFA)、SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行检测和分析。结果构建了含有ERA NP基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中获得表达。结论本研究成功表达出了具有免疫原性的狂犬病毒核蛋白。     

丙型肝炎病毒NS3蛋白酶结构域在昆虫细胞中的表达及鉴定

目的　利用杆状病毒 昆虫细胞表达系统制备丙型肝炎病毒 (HCV)丝氨酸蛋白酶结构域 (proteasedomain)的重组蛋白。方法　构建含有HCV丝氨酸蛋白酶结构域基因的杆状病毒转移载体 pFBCNS3N ,转化大肠杆菌DH10Bac进行转座 ,提取重组Bacmid用Lipofectamine法转染昆虫细胞Sf9包装成重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染昆虫细胞进行蛋白表达 ,用SDS PAGE电泳和免疫印迹实验分析表达情况 ;利用去垢剂十二烷基肌酸钠溶解重组蛋白后以Ni NTAagrose柱亲和纯化重组蛋白 ;以重组蛋白NS5ab(包含NS5A羟基端部分和NS5B氨基端部分的重组蛋白 )为底物检测丝氨酸蛋白酶的酶切活性 ;以间接ELISA法分析重组蛋白的抗原性。结果　HCV丝氨酸蛋白酶结构域基因在昆虫细胞中获得高水平表达 ;重组蛋白能够部分溶解于含有去垢剂十二烷基肌酸钠的缓冲液 ;从 5× 10 7细胞中总共获得 0 .2mg重组蛋白 ,纯度大于 90 %;重组丝氨酸蛋白酶能够将NS5ab切割成两个片段 ;血清学实验证实该蛋白抗原性很好。结论　昆虫细胞表达的HCV丝氨酸蛋白酶结构域为膜结合型蛋白 ,具有良好的酶学活性以及抗原性。     

重组人干扰素α-2b/免疫球蛋白G4 Fc融合蛋白在杆状病毒昆虫系统中的表达

目的 利用杆状病毒昆虫系统表达人干扰素(IFN) α-2b/免疫球蛋白(Ig)G4Fc融合蛋白(IFN/Fc),为长效干扰素的抗病毒治疗探索新方法.方法 利用分子克隆技术获得人IFN α -2b及IgG4 Fc基因cDNA,构建杆状病毒穿梭载体,在DH10 Bac菌株中转座获重组杆粒,转染昆虫细胞High five,Western blot检测目的蛋白表达,细胞病变抑制法检测生物学活性. 结果 穿梭载体在DH10 Bac中转座成功,获得重组杆粒Bacmid-IFN/Fc ; High Five细胞在病毒感染后72 h蛋白表达较好.病毒感染48 h即有少量目的蛋白表达,72 h表达量较高.Western blot结果显示在45×103处有特异性蛋白条带,体外抗病毒活性为580 IU/ml.结论 利用杆状病毒昆虫系统成功表达重组IFN/Fc融合蛋白,为新型长效干扰素研制及慢性病毒性肝炎治疗提供实验依据.     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因在大肠杆菌和昆虫细胞中的表达

目的构建大肠杆菌表达载体pET-NS1和昆虫杆状病毒转移载体pFast-NS1,将H5N1亚型禽流感病毒NS1基因分别在大肠杆菌和昆虫细胞中进行表达,表达产物用Western blot进行检测分析。方法酶切含有NS1基因的质粒pUC-NS1,分别克隆进大肠杆菌表达载体pET-28a(+)和杆状病毒转移载体pFastBac HT A中,分别获得表达载体pET-NS1和pFast-NS1。将pET-NS1转化大肠杆菌BL21,以异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达;将pFast-NS1转化DH10Bac感受态细胞,提取重组Bac-NS1DNA,以M13为通用引物作PCR鉴定,阳性Bac-NS1用脂质体转染sf9细胞,72h后收集感染细胞。大肠杆菌表达产物和细胞表达产物分别裂解后作SDS-PAGE和Western blot分析。结果成功构建了大肠杆菌表达载体pET-NS1和昆虫杆状病毒转移载体pFast-NS1,大肠杆菌和昆虫细胞中表达的融合蛋白Western blot都能检测到特异性条带。结论NS1基因在大肠杆菌和昆虫细胞中得到成功表达,为获得大量NS1蛋白进行功能研究及抗体制备奠定了基础。     

猴B病毒gB基因在昆虫细胞中的表达

为了研发猴B病毒ELISA检测试剂盒中替代全病毒的抗原。根据已报道的猴B病毒E2490株gB蛋白基因序列（genbank登录号：AF533768）人工合成gB基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将gB基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTA,经PCR、酶切、测序鉴定后,成功构建了携带gB基因的重组质粒pFastBacHTA-gB。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10BAC感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bacmid-gB。在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,细胞变大变圆细胞核扩大,收获重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白。通过SDS-PAGE和Western bloting及间接免疫荧光检测,结果表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物活性,大小约为98kDa。实验结果表明已成功构建了携带目的基因的重组质粒pFastBacHTA-gB和转座的杆粒Bacmid-gB,转染后在sf9昆虫细胞上得到表达。此研究结果为下一步以表达的gB蛋白为诊断抗原,替代现阶段以病毒作为抗原的猴B病毒ELISA检测试剂盒的研制奠定了基础。     

蛋白磷酸酶2A Cα在昆虫杆状病毒中的表达及活性

目的利用昆虫杆状病毒系统表达蛋白磷酸酶(PP)2A Cα亚基并进行活性分析。方法先将PP2A Cα构建进入昆虫杆状病毒表达载体,然后将其转染到昆虫细胞Sf9中并进行蛋白表达,最后检测PP2A Cα的功能。结果 Western印迹结果表明PP2A Cα蛋白已经在昆虫细胞成功表达;PP2A活性检测和GST pull-down实验结果表明PP2A Cα蛋白既有生物学功能,又有结构学功能。结论昆虫杆状病毒载体系统可以成功表达有活性的PP2A Cα蛋白。     

猪流感H1N1亚型NP基因杆状病毒表达载体构建及其在昆虫细胞中的表达

目的获得研发A型猪流感病毒ELISA检测试剂盒和制备NP蛋白单克隆抗体的抗原物质。方法根据已报道的猪流感病毒H1N1亚型NP基因序列(GenBank登录号:GQ422386)人工合成NP基因,通过XbaⅠ和EcoRⅠ特异性酶切,将NP基因克隆于昆虫杆状病毒表达载体pFastBacHTB,经PCR、酶切、测序鉴定后,获得携带NP基因的重组质粒pFast-BacHTB-NP。该重组质粒转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞,经抗生素、PCR筛选,获得转座的杆粒Bac-mid-NP。在脂质体介导下转染sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒,再感染细胞,收获目的蛋白。结果通过SDS-PAGE和Westernblotting分析表明该蛋白得到表达,且具有良好的生物活性,大小约为57KD。结论实验结果表明已成功构建了携带NP基因的重组质粒pFastBacHTB-NP和转座的杆粒Bacmid-NP,转染后在sf9昆虫细胞上成功的表达。     

流感病毒HA球状头部结构域在昆虫杆状病毒表达系统的表达及鉴定

目的通过昆虫杆状病毒表达系统获得具有良好免疫原性的流感病毒蛋白。方法将Hemagglutinin [Influenza A virus (A/California/09/2009(H1N1))进行截短,取57-271球状头部结构域氨基酸序列,在前面加Igκleader信号肽(METDTLLLWVLLLWVPGSTGD),设计H1HAHead基因。将基因序列按照昆虫细胞密码子偏好性进行优化、合成,通过EcoRI和HindIII双酶切克隆至pFastBAC HTA载体上,获得含有目的基因的重组质粒pFastBAC HTA-H1HAHead。利用热激法将重组质粒转化至大肠埃希菌DH10 Bac~(TM)感受态细胞,蓝白斑筛选获得重组杆状质粒rBacmid-H1HAHead。在脂质体的介导下,将重组杆状质粒转染至SF9细胞,对病毒进行拯救,转染后120 h,收取上清病毒液,盲传3代,获得SF9细胞,运用间接免疫荧光法(IFA)和Western blot检测目的蛋白的表达。结果经双酶切鉴定成功插入长度为762 bp的目的基因H1HAHead,通过脂质体介导长度为3 192 bp的重组杆状质粒rBacmid-H1HAHead构建成功。杆状病毒系统可表达目的蛋白,其分子质量单位28.25 ku,与预期一致。Western blot鉴定该蛋白能与特异性标签His-tag发生反应,IFA鉴定感染重组病毒的SF9细胞外源蛋白表达。结论通过昆虫杆状病毒表达系统成功表达目的蛋白,该蛋白有反应性,为流感抗体检测和新型疫苗的开发奠定了基础。     

弓形虫主要抗原基因（SAG1）在昆虫细胞中表达的研究

用PCR技术从弓形虫DNA扩增出一段长约902bp编码弓形央主要膜蛋白抗原（SAG1）的基因，将SAG1基因插入带有转座子供体的pFastBacl质粒，得到重组质粒pFT9，pFT9转化含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态细胞，通过转座重组作用使SAG1基因整合到杆状病毒载体上，将两株转座重组子BaC101和Bac304DNA分别转染Sf9昆虫细胞，用弓形虫免疫血清所作的免疫印迹试验证实这两株重组杆状病毒的昆虫细胞株均表达了SAG1蛋白。本文首次报告弓形虫SAG1蛋白在昆虫细胞中的表达。     

重组犬α干扰素在昆虫细胞中的高效表达与抗病毒活性鉴定北大核心CSCD

目的利用杆状病毒表达系统制备犬α干扰素(Canine interferon-α,CaIFN-α)。方法根据昆虫细胞密码子偏爱性优化CaIFN-α基因,构建含双拷贝CaIFN-α优化基因的载体pFastBacDual-CaIFNα-CaIFNα,转化DH10Bac感受态后获得重组基因组rBacmid-CaIFNα-CaIFNα,转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα,接种Sf9细胞表达rCaIFN-α。采用PCR和透射电子显微镜鉴定重组杆状病毒的外源基因与病毒形态,采用间接免疫荧光染色法检测rCaIFN-α蛋白的表达,采用细胞病变抑制法测定rCaIFN-α抑制水疱性口炎病毒(VSV-GFP)在MDCK细胞的复制能力。结果重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα构建成功,rCaIFN-α在rBac-CaIFNα-CaIFNα感染的Sf9细胞中表达,其抗病毒活性为8.73×105 IU/ml。结论构建的杆状病毒表达系统能高效表达rCaIFN-α,该干扰素具有高效抗病毒活性,这为犬干扰素制剂的研究奠定了基础。     

重组犬α干扰素在昆虫细胞中的高效表达与抗病毒活性鉴定

目的利用杆状病毒表达系统制备犬α干扰素(Canine interferon-α,CaIFN-α)。方法根据昆虫细胞密码子偏爱性优化CaIFN-α基因,构建含双拷贝CaIFN-α优化基因的载体pFastBacDual-CaIFNα-CaIFNα,转化DH10Bac感受态后获得重组基因组rBacmid-CaIFNα-CaIFNα,转染Sf9细胞获得重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα,接种Sf9细胞表达rCaIFN-α。采用PCR和透射电子显微镜鉴定重组杆状病毒的外源基因与病毒形态,采用间接免疫荧光染色法检测rCaIFN-α蛋白的表达,采用细胞病变抑制法测定rCaIFN-α抑制水疱性口炎病毒(VSV-GFP)在MDCK细胞的复制能力。结果重组杆状病毒rBac-CaIFNα-CaIFNα构建成功,rCaIFN-α在rBac-CaIFNα-CaIFNα感染的Sf9细胞中表达,其抗病毒活性为8.73×105 IU/ml。结论构建的杆状病毒表达系统能高效表达rCaIFN-α,该干扰素具有高效抗病毒活性,这为犬干扰素制剂的研究奠定了基础。     

人纤维介素蛋白2在昆虫杆状病毒系统中的表达及活性检测

目的:利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞(Sf9细胞)中表达人纤维介素蛋白2(hfgl2)凝血酶原酶并检测其蛋白活性.方法:首先将PCR扩增的目的基因hfgl2和pENTR/D-TOPO载体连接,再将pENTR/D-TOPO-hfgl2质粒与BaculoDirectTM线性DNA进行体外基因重组,采用脂质体转染法将重组DNA转染到生长良好的Sf9细胞中进行病毒包装,经过对重组杆状病毒三轮扩增后,用RT-PCR和Western blotting从基因和蛋白水平检测hfgl2表达情况,一期凝固试验检测其蛋白活性.结果:重组杆状病毒感染后,Sf9细胞停止生长,体积变大,细胞开始悬浮,破裂,呈现颗粒样外观.RT-PCR扩增和Western blotting从基因和蛋白水平证实Sf9细胞能够表达hfgl2,蛋白分子量约为63kDa.同时,在细胞上清液中检测到了可溶性hfgl2的表达,蛋白分子量约为50kDa.一期凝固试验证明表达的跨膜型hfgl2具有凝血活性.结论:hfgl2在昆虫杆状病毒表达系统中成功表达并具有生物学活性,为进一步研究hfgl2跨膜型以及可溶性蛋白功能提供了工具,亦可应用于开发重型肝炎蛋白芯片或ELISA诊断试剂盒.     

恶性疟原虫pfK13-F446I基因重组杆状病毒质粒的构建及其在昆虫细胞SF9中的表达

目的构建恶性疟原虫Kelch 13-F446I(pfK13-F446I)基因重组杆状病毒质粒,并在昆虫细胞SF9中表达。方法体外合成恶性疟原虫Kelch 13野生型和F446I蛋白结构域片段碱基,定向克隆至转移载体pFastBac,构建pfK13-WT-Bac和pfK13-F446I-Bac质粒,转化大肠埃希菌DH10Bac感受态细胞后进行基因重组。提取重组病毒,PCR和Western blot验证后转染草地贪夜蛾细胞(SF9)。收集亲代重组病毒反复感染SF9细胞进行病毒扩增,优化可溶性蛋白的纯化条件,采用SDS-PAGE电泳分析重组蛋白表达情况。结果构建了含恶性疟原虫pfK13-F446I基因的重组质粒pfK13-F446I-Bac,大小约3 430 bp。转染SF9细胞后获得有感染力的重组杆状病毒,并在SF9细胞中表达pfK13-F446I蛋白,经梯度洗脱、去标签、透析等获得大小为44 ku的单一电泳条带的pfK13-F446I蛋白。结论成功构建pfK13-F446I基因重组杆状病毒质粒,并在昆虫细胞SF9中进行成功表达。     

鼠IL-2基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

目的构建携带鼠IL-2基因的重组杆状病毒表达载体。方法将目的基因鼠IL-2克隆入杆状病毒表达载体pFastBacDual中,构建重组质粒pFB-CMV-IL-2并予酶切和PCR鉴定;将pFB-CMV-IL-2转化到含杆状病毒穿梭载体Bacmid的DH10Bac感受态菌中,筛选阳性克隆,获得重组杆状病毒载体Bacmid-pFB-CMV-IL-2,抽提质粒;用脂质体转染法将Bacmid-pFB-CMV-IL-2转染Sf9昆虫细胞包装病毒;收获完整重组杆状病毒,反复感染Sf9细胞扩增病毒,提取杆状病毒基因组,用PCR验证重组杆状病毒的正确性。结果成功构建鼠IL-2基因杆状病毒表达载体。结论本试验为进一步在哺乳细胞中表达鼠IL-2基因、开发研究IL-2奠定了基础,同时亦为其他蛋白质的真核细胞表达提供了方法参考。