急性白血病相关基因WIT-1的克隆及临床意义

目的：克隆白血病相关基因及白血病相关基因甲基化的临床意义。方法：应用新的分子克隆技术ＲＬＧＳ及ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ技术自急性髓细胞白血病（ＡＭＬ）骨髓标本中克隆白血病相关基因对该基因的甲基化进行检测。结果：克隆到一个长度为２２１ｂｐ因ＮｏｔⅠ酶切位点甲基化所致的ＤＮＡ片段,序列分析结果表明其来源于急性白血病相关基因（ＷＩＴ－１基因）第二外显子,ＷＩＴ－１基因甲基化发生率在原发难治性ＡＭＬ中明显     

新的癫痫相关基因的筛选及部分cDNA序列的分离鉴定

用ｍＲＮＡ差异显示技术从大鼠癫痫状态的海马分离到２０个ｃＤＮＡ差异片段，对４个ｃＤＮＡ片段进行序列分析并在基因库中进行相同性比较，发现ＥＲＧ８，ＥＲＧ１１，ＥＲＧ１２无相同性序列，ＥＲＧ１４与鼠的微管相关蛋白基因有６４％￣６９％的相同性。由于这些基因的差异表达是致痫剂马桑内酯和抗痫剂ＭＫ－８０１所致，所以，ＥＲＧ８可能是新的候选癫痫基因，ＥＲＧ１１和ＥＲＧ１２可能是新的候选抗痫基因；由于微管相关蛋     

从K562细胞中克隆新的锌指蛋白cDNA基因的初步研究

采用５＇加端ＰＣＲ从Ｋ５６２ｃＤＮＡ文库中扩增出含锌指结构域的ｃＤＮＡ基因片段，重组至ｐＧＥＭ７ＺＤＮＡ载体中。通过ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交初步从Ｋ５６２ｃＤＮＡ文库中筛选出９个含锌指基因片段的重组克隆。经ＤＮＡ序列分析和基因库检索，发现有２个克隆的序列与巳知基因差异显著，有可能为新的锌指蛋白基因片段。     

从K562细胞中克隆新的锌指蛋白cDNA基因的初步研究

采用５加端ＰＣＲ从Ｋ５６２ｒＤＮＡ文库中扩增出含锌指结构域的ＣＤＮＡ基因片段，重组至ＰＧＥＭ７ＺＤＮＡ载体中，通过ＰＣＲ及Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹杂交初步从Ｋ５６２ＣＤＮＡ文库中筛选出９个含锌指基因片段的重组克隆。经ＤＮＡ序更分析和基因库检索，发现有２个克隆的序列与已知基因差异显著，有可能为新的锌指基因片段。     

用克隆技术分析新白血病相关基因LRP16对白血病发病机制的影响

目的：探讨应用克隆技术分析新白血病相关基因LRP16对白血病发病机制的影响。方法：使用相关分子克隆技术RLGS及RACE，对急性髓细胞白血病骨髓标本中克隆出的新白血病相关基因进行研究，并探讨新白血病相关基因对白血病发病机制的影响。结果：我们在急性髓细胞白血病骨髓标本中克隆出一条长度为2450bp的DNA片段。经过国际基因验证为未知基因的一部分。我们将这个DNA片段定位于第10号染色体长臂10区，并克隆到该基因的全长。该基因的全长为860bp。我们将发现的新基因以新的人类基因LRP16收录至国际基因库中。结论：使用相关分子相关克隆技术可以有效地发现新的白血病相关基因，而且新的白血病相关基因对研究白血病的发病机制具有重要作用。此方法值得在临床上推广使用。     

人白细胞介素—6基因的克隆表达和纯化的研究

目的：研究人ＩＬ－６基因在大肠杆菌中的高效表达及表达产物的纯化。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ方法克隆了人ＩＬ－６ ｃＤＮＡ,用ｐＢＶ２２０载体对ＩＬ－６基因进行了表达调控研究,用阴离子交换柱和凝胶柱对表达产物进行纯化,用ＭＴＴ法测定ｒｈＩＬ－６的活性。结果：表达调控研究发现,当ＳＤ序列到ＡＴＧ之间的距离为６ｂｐ和１０ｂｐ时在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ胶上未见明显表达,而当距离为５ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、８ｂｐ时均有     

强化表达分泌型酵母载体YEp5101和YEp5102的构建

采用ＰＣＲ二段扩增法，从酵母基因组中获取６３５ｂｐ完整的ＭＦα（α－ｍａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）基因及１８０ｂｐ的ＵＡＳＰＧＫ（３－磷酸甘油酸激酶基因的上游激活序列）ＤＮＡ片段。首先，将４３０ｂｐ的ＭＦα基因启动子和信号序列与１８０ｂｐＵＡＳＰＧＫ片段分别克隆到ＰＵＣ１８载体上；然后，从含有ＭＦα基因启动子和信号序列的阳性重组子ｐＭＦα１与含有ＵＡＳＰＧＫ阳性重组子ｐＵＡＳ８质粒中，分别获得ＭＦα     

副溶血性弧菌耐热直接溶血毒素基因的克隆

目的探讨克隆副溶血性弧菌（Ｖｐ）耐热直接溶血毒素基因的方法。方法用ＰＣＲ技术扩增目的基因,双酶切载体 ｐＵＣ１９和目的基因 ＤＮＡ,连接并转化大肠杆菌 ＪＭ１０９。对重组质粒进行 ＰＣＲ鉴定、酶切鉴定和序列分析。结果凝胶电 泳显示,标准株Ｖｐｌ４－９０基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ产物长约６００ ｂｐ。阳性克隆的ＰＣＲ产物也为一长约６００ ｂｐ）的条带,经双 酶切可切出一约 ６００ ｂｐ的条带。 ＤＮＡ 测序结果表明与 Ｇｅｎｅｂａｎｋ中的序列有 ９９．６５％的同源性。结论利用该方法成功 克隆了目的基因,为制备用于现场检测的基因探针和Ｖｐ的保护性菌苗以及阐明Ｖｐ的致病机理奠定了基础。     

背根神经节组织中GAP-43基因克隆

目的：克隆新生大鼠背极神经节组织中生长相关蛋白－４３（ＧＡＰ－４３）基因。方法：采用ＲＴ－ＰＣＲ法,从新生大鼠背根神经节组织ｍＲＮＡ中扩增ＧＡＰ－４３基因ＣＤＳ区片段,克隆入Ｔ载体,并经序列测定。结果：ＲＴ－ＰＣＲ法扩增出一特异产物与预期长度７７８ｂｐ相符,Ｔ载体克隆测序与ＧＡＰ－４３基因１００％同源。结论：采用ＲＴ－ＰＣＲ和Ｔ载体技术获得了新生大鼠背根神经节组织中的ＧＡＰ－４３基因克隆。     

登革2型病毒NS3基因的扩增及序列测定

采用热酚法从登革２型病毒４３株（Ｄ２－４３）感染的Ｃ６／３６细胞中提取了病毒ＲＮＡ,以病毒ＲＮＡ为模板,进行Ｄ２－４３株ＮＳ３基因ｃＤＮＡ片段的反转录－ＰＣＲ扩增,片段长度为１１７６ｂｐ。将扩增的ｃＤＮＡ片段克隆到Ｔ载体ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ－ｋｓⅡ中。通过双脱氧法测定了ｃＤＮＡ片段序列,与国际标准株ＮＧＣ株序列一致。     

家族性急性髓系白血病相关新基因FAMLF cDNA全长的克隆及其生物功能分析

目的 克隆家族性急性髓系白血病(AML)相关新基因cDNA全长,在分子水平上探讨急性白血病发生发展的机制.方法 以构建的家族性AML抑制性消减文库中1个有差异表达的新基因EST序列zywb87(GenBank注册号CV973101)为基础,应用cDNA末端快速扩增法(RACE)克隆其全长cDNA,应用生物信息学对其功能进行初步分析,应用一步法半定量RT-PCR检测其在AML患者及正常人中的表达.结果 获得了家族性AML相关新基因FAMLF的cDNA全长,该基因定位于染色体lq31.3,cDNA全长2313 bp,开放读码框(ORF)为249 bp,编码82个氨基酸的蛋白质,含有信号肽,富含亮氨酸重复单位(LRR_SD22),内在固有无序结构域等功能区.Blast检索为功能未知的新基因,已被GenBank收录,并命名为FAMLF,核酸注册号为EF413001,蛋白质注册号为ABN58747.新基因FAMLF在AML患者中的表达明显高于正常人,差异有统计学意义(2.61±0.66 vs 0.97±0.51,P<0.01).结论 成功获得一个家族性AML相关新基因FAMLF cDNA全长,FAMLF基因在AML中高表达,可能是具有一定生物功能的新基因.     

新基因TMBP-1的全长cDNA克隆

目的：克隆胸腺细胞发育相关新基因。方法：本研究建立了抑制性差减杂交技术（SSH）、构建了胸腺基质细胞系cDNA差减杂交文库。应用cDNA末端快速扩增方法（RACE）进一步克隆新基因的cDNA全长序列。结果：筛选两个不同胸腺基质细胞系的差异表达基因,获得了新基因cDNA片段C91,应用RACE成功克隆新基因TMBP－1cDNA全长序列。它拥有一个969bp的开放读码框架,编码323个氨基酸。同源序列 比较发现,它编码一个未知功能的膜结合蛋白。Northem杂交分析显示,mRNA转录本长度为1．5kb;在两种胸腺基质细胞系中均有表达。新基因的cDNA全长序列。已被GenBank所接受。结论：抑制性差减杂交技术是克隆新基因片的有效方法;成功克隆新基因TMBP－1的cDNA全长序列。     

用DNA指纹技术检测儿童急性粒细胞白血病的基因重排

目的：应用DNA指纹分析技术检测儿童急性粒细胞白血病的基因重排。方法：用LE11．8、MYO和M13探针，经Southern杂交法检测12例儿童急性粒细胞白血病患者的外周血或骨髓细胞的基因重排。结果：发现初治或复发与完全缓解时的DNA指纹图相比，谱带有增加或减少。结论：急性粒细胞白血病患儿的白血病细胞存在基因重排；DNA指纹可以区别白血病细胞和正常细胞；DNA指纹技术可以检测到残留的少量白血病细胞。     

急性髓性白血病混合谱系白血病基因重排的研究

目的对急性髓性白血病(AML)患者可能出现的混合谱系白血病(mixed lineage leukemia,MLL)基因重排进行研究,并探讨其临床意义。方法在常规细胞遗传学分析基础上运用分子生物学方法-荧光原位杂交技术(FISH),采用多种位点特异性DNA探针(染色体全染、特殊位点、双色或多色易位融合探针),对58例AML患者(47例成人AML,11例儿童AML)进行分析研究。结果有6例出现MLL基因重排,分别出现MLL基因的移位,复制及丢失,阳性率占10．3％。其中4例为成人AML,2例为儿童AML,除了MLL基因重排外,5例AML患者同时合并有复杂的核型变化,分别为:47-48,XX,der(1)t(1;17)(p36．1;q23),+4,+10,der(11)t(11;17)(q23;q23),-17,-18, +20,+21?.ish+21(wcp21+),der(1)t(1;17)(wcp17+),der(11)t(11;17)(wcp11+;wcp17 +);46,XX,del(5)(q13q33),r(11)(p15q25),+r(11)(p15q25)．ishr(11)(wcp11+,MLL+),+r (11)(wcp11+,MLL+);46,XY,del(11)(q23)[2]／46,idem,add(16)(p13．1)[8]／46,XY[10]．ishadd(16)(wcp16+),rea(11)(wcp11+);55,XY,+ markers．ish 11q23(MLL×3),+21(wcp21 +);46,XY,add(11)(q23)[6]／46,idem,t(15;17)(q22;q21)[12]／46,XY[2]．ish dup(11)(MLL ++),t(15;17)(PML+,RARa+;RARa-)[24]。结论急性髓性白血病常合并有MLL基因重排,本实验组的阳性率超过10％。由于MLL基因重排的患者具有对常规化疗不敏感及预后不良的特点,对初治急性白血病患者应常规进行MLL基因重排的检查。     

人神经性耳聋多肽因子样基因克隆和表达分析

目的 克隆一个新的耳聋相关基因。方法 应用生物信息分析技术、ＲＡＣＥ以及ｃＤＮＡ文库筛选。结果 克隆了人的进行性肌萎缩／神经性耳聋多肽因子样基因（ｄｙｓｔｏｎｉａ／ｄｅａｆｎｅｓｓ ｐｅｐｔｉｄｅ ｌｉｋｅ,ＤＤＰＬ）。ＤＤＰＬ定位在１１ｑ２２．１－２２．２,具有二种不同的组织剪接形式的ｍＲＮＡ（ＧｅｎｅＢａｎｋ接受号：ＤＤＰＬ２ ＡＦ１６５９６７）,分别编码８３个氨基酸及５１个氨基酸。ＤＤＰＬ在     

白血病细胞多巴胺受体基因甲基化研究

目的：探讨多巴胺受体（ＤＲＤ４）基因第一外显子中ＮｏｔＩ酶切位点甲基化与急性非洒巴细胞白血病（ＡＭＬ）的关系。方法：应用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印记杂交与ＤＮＡ序列分析技术对ＡＭＬ患者骨髓标本进行分析。结果：在２７例白血病患者骨髓标本中１６例ＤＲＤ４基因甲基化（５９％），其中初治化疗敏感患者ＤＲＤ４基因甲基化发生率为５０％（９／１８），复发及难治患者甲基化发生率为７８％（７／９），而９例正常人骨髓标本ＤＲ     

用锅柄聚合酶链反应法克隆卡地腐霉Pr1基因的未知片段

目的：分离和克隆灭蚊真菌卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因已知片段的3′端未知序列。方法：采用PANHANDLE PCR，以基因组DNA为模板，通过链内退火及延伸形成一个类似锅柄形状的结构，经嵌套式PCR扩增得到未知目的片段。通过已知cDNA片段设计引物，PCR扩增得到该蛋白酶部分基因组序列，采用限制性内切酶BamH Ⅰ消化卡地腐霉基因组DNA，经去磷酸化处理后，在消化片段3′端连接一段与卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因5′端已知序列互补的5′端磷酸化寡核苷酸链NA，经链内退火及聚合酶延伸形成一锅柄状结构。结果：获得一大小为876bp的PCR产物，经序列分析验证，该panhandle PCR产物包含了已知卡地腐霉类枯草杆菌蛋白酶基因3′端未知的853bp核苷酸序列。结论：这种特殊的PCR方法可以高度有效地克隆和鉴定已知片段两侧的未知基因片段。     

小鼠β趋化因子受体CCR5基因的克隆

目的：克隆小鼠β趋化因子相关的受体并研究其表达。方法：使用共同引物用ＲＴ－ＰＣＲ方法，从ＢＡＬＢ／ｃ小鼠腹腔巨噬细胞的Ｐｏｌｙ（Ａ）＾＋ＲＮＡ中扩增出一０．５ｋｂ ｃＤＮＡ，再根据其序列，设计一特异引物，用Ｍａｒａｔｈｏｎ ＰＣＲ法扩增得一２．８ｋｂ ｃＤＮＡ，用Ｓｏｕｔｈｅｍ方法检测分析该ＡＤＬＤ，Ｎｒｔｈｅｒｎ方法分析其表达。结果：成功克隆出小鼠ＣＣＲ５ ｃＤＮＡ，其开放阅读框为１０６５ｂｐ，     

家族性急性髓系白血病相关新基因ELF2C cDNA全长的克隆

目的克隆家族性急性髓系白血病相关新基因全长,在分子水平上探讨急性白血病发生发展的机制。方法以构建的家族性急性髓系白血病抑制性？肖减性文库中1个有差异表达的新基因EST序列（zywb4）为基础,综合应用电子克隆和cDNA末端快速扩增法（RACE）技术克隆家族性急性髓系白血病相关新基因的全长cDNA。结果获得家族性急性髓系白血病差异表达新基因ELF2C的全长cDNA和432bp的开放阅读框（ORF）,Blast检索为一功能未知基因,被GenBank收录,注册号为DQ359746。结论成功获得一个家族性急性髓系白血病相关新基因ELF2CcDNA全长,为进一步研究其功能提供了依据。