体内、体外产生的小鼠桑葚胚玻璃化冻存后的发育能力

目的 探讨体内、体外产生的小鼠又椹2胚玻璃化冻存后的发育能力。方法 体内、体外产生的小鼠桑慝胚分别被含有乙烯苷醇、Ficoll和蔗糖的玻璃化溶液处理后冻存。结果 体内产生的小鼠桑葚胚单纯暴露于玻璃化溶液中,而未冻存时其发育到胚泡期的百分率为97.3%（一步法）和98.4%(二步法）,与对照组（98.1%)均无显差异（P>0.05),体外产生的小鼠桑葚胚单纯被玻璃化溶液处理后发育到胚泡期的百分率分别为81.8%(一步法）、82.4%（二步法）和83.6%（对照组）,三之间无显差异（P>0.05)。但是,体外产生的小鼠桑葚胚经玻璃化冻存融解后,发育到胚泡期的百分率为70.6%（一步法）、81.3%(二步法）和83.6%,（对照组）,一步法玻璃化组明显低于二步法玻璃化组和对照组（P<0.05),而在体内产生的小鼠桑葚胚玻璃化冻存融解后,发育到胚泡期的百分率为93.1%(一步法)和95.7%.(二步法),二之间无显差异（P>0.05)。所有玻璃化冻存的小鼠桑葚胚融解后,显微镜下观察均未见透明带破裂。结论 体内、体外产生小鼠桑葚胚胎经玻璃化冻存融解后,可保持较高的存活率和发育能力,二步法玻璃化更适合冻存体外产生的小鼠桑葚胚。     

小鼠原核胚玻璃化冷冻保存技术的研究

目的　原核胚是转基因等生物技术所必需的主要材料 ,其冷冻保存使操作不受时间和空间的限制。另外 ,冷冻保存还可以避免体外培养过程中的细胞发育阻断期。方法　在室温 (2 0℃或 2 5℃ )条件下 ,以乙二醇、DMSO为主体抗冻保护剂配制成的玻璃化溶液 (EFS、EDT、EDFS) ,不借助冷冻仪 ,对小鼠原核胚进行一步法和二步法玻璃化冷冻保存。结果　 2 0℃室温条件下 ,用EDFS4 0平衡 1min一步法冷冻解冻后的原核胚 ,经培养后囊胚发育率最高仅为 4 7% ,与新鲜原核体外培养的对照组 (75 % )的差异极显著 (P <0 0 1) ;当原核在 10 %E +10 %D溶液中预处理 5min ,移入EDFS30中平衡 30s二步法冷冻保存 ,解冻后的囊胚发育率达 6 8%。而室温升至 2 5℃ ,二步法冷冻保存后原核胚的囊胚发育率高达 77% ,与对照组差异无显著性 (P >0 0 5 )。用最佳冷冻组的原核胚或解冻后培养到囊胚移植给受体母鼠均获得产仔。结论　本研究对小鼠原核胚实施玻璃化冷冻保存 ,经体外培养和移植结果与对照组无显著性差异 ,证明了本方法的可行性     

解剖、生理和组胚学

060327两种玻璃化液冻存小鼠桑椹胚的研究/郑伏甫…∥生殖与避孕.—2005,25(8).—456～459,473将NIH小鼠优质桑椹胚,先用两种玻璃化溶液EDS-40(40%乙二醇 18%葡聚糖 0.5mol蔗糖)和EFS-40(40%乙二醇 18%聚蔗糖 0.5mol蔗糖)行毒性测试;再在20℃±5℃室温下,将小鼠桑椹胚分别加入到两种玻璃化溶液,玻璃化后装管并迅速投入液氮中,冻存2～3个月。各组均在25℃的水浴中复温,胚胎用解冻液(S-PBS)和培养液反复洗涤后移入含Ham s F12培养液培养48h,观察胚胎形态及发育。部分胚胎体外培养12～14h后行胚胎移植,观察妊娠及产仔情况。结果:两种玻璃…     

平皿-微滴法玻璃化冷冻保存小鼠胚胎

目的 :使用平皿 微滴法玻璃化冷冻小鼠 8～ 12细胞胚胎 ,检验该方法对胚胎的冻存效果。方法 :胚胎在EG2 0 中平衡 3min ,EFS4 0 中平衡 1min ,将含有胚胎的小于 0 .5 μl的EFS4 0 微滴吹于 35mm平皿上并立即直接浸入液氮保存。结果 :解冻后胚胎回收率达到 98.1% ,透明带无破损 ,冷冻后存活率为 95 .2 %。冻融胚胎体外发育和体内发育能力与对照组胚胎比较差异无显著性 (84 .3%对 90 .1% ,12 .1%对 13.5 % ,P >0 .0 5 )。结论 :小鼠 8～ 12细胞胚胎可以用平皿 微滴法有效地进行玻璃化冻存。     

颗粒细胞在玻璃化冷冻中对卵母细胞的影响

目的 采用开放式拉细麦管(open pulled straws，OPS)法玻璃化冷冻技术，探讨卵丘颗粒细胞对未成熟卵母细胞冻融后存活率及其发育能力的影响。方法 小鼠生殖泡期卵丘-卵母细胞复合物(COC)或完全去颗粒细胞后的裸卵(DO)用OPS法玻璃化冻存，复苏后行体外成熟培养(IVM)；COC直接行IVM作为对照组。结果 COC及裸卵冻融后存活率(分别为69．49％、77．90％)、成熟率(分别为56．10％、56．74％)无显著性差异，但成熟率均显著低于对照组(82．28％)。结论 在未成熟卵的玻璃化冷冻中颗粒细胞对卵母细胞冻存无保护作用。     

OPS玻璃化冷冻小鼠MII期卵效果观察

目的　以小鼠为研究模型 ,探讨MII期卵母细胞冷冻后纺锤体和染色体改变的有效观察方法。研究OPS玻璃化冻存成熟卵的可行性。　方法　运用激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM)的光学切片和三维图像重建技术 ,系统研究了OPS玻璃化冷冻对小鼠MII期卵纺锤体和染色体的影响。　结果　冷冻组卵复苏后存活率达 5 8% ,纺锤体和染色体形态正常率分别为 46%和 5 2 % ,与对照组 ( 76%和 70 % )相比 ,差异具显著性 (P <0 0 5 )。暴露组卵纺锤体和染色体结构正常率较对照组略有下降 ,但无统计学差异。　结论　LSCM能够清晰有效地观察冷冻对卵母细胞纺锤体和染色体影响。应用OPS玻璃化方法能够有效冻存卵母细胞     

两种玻璃化液冻存小鼠早期囊胚的效果分析

目的研究玻璃化液EDS-40对冻贮小鼠早期囊胚的效果。方法①EFS-40和EDS-40玻璃化溶液的玻璃化测试。②随机将小鼠早期囊胚,先10%EG中预处理2min后分别加入EDS-40和EFS-40玻璃化溶液管并迅速投入液氮中。③各组均冻存3个月,复温后,用培养液反复洗涤后移入培养孔板培养,观察胚胎存活率,囊胚培养12h后行移植,观察妊娠率及产仔率。结果两种玻璃化溶液能达到玻璃化效果;EDS-40及EFS-40冷冻复温后的存活率分别为:75.4%、64.2%,差异有统计学意义(P<0.05);EDS-40及EFS-40组冻胚移植后的妊娠率及产仔率分别为:53.33%、23.08%,45.45%,18.18%,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 EDS-40较EFS-40玻璃化溶液冻存小鼠早期囊胚效果更好。     

小鼠卵巢玻璃化冻存不同时段FSH干预对Cx43表达的影响

目的通过在玻璃化冻存不同阶段给予小鼠卵巢组织促卵泡刺激素(FSH)干预,观察FSH对缝隙连接蛋白Connexin-43(Cx43)表达的影响,从而寻找最佳的FSH干预途径。方法将4周龄C57BL/6J小鼠卵巢组织分为新鲜对照组(CG)、玻璃化冻存对照组(VCG)、0.3 IU/mL FSH干预玻璃化冻存组,包括全程添加FSH组(OG-FSH)、冻存前添加FSH组(FG-FSH)以及冻存后添加FSH组(LG-FSH)。通过形态学、免疫组织化学技术及Western-blot技术观察并分析各组卵巢组织Cx43蛋白表达情况。结果正常卵泡百分比为玻璃化冻存数量最低,全称FSH干预玻璃化冻存组最高(P<0.05),全程添加FSH组(OG-FSH)最高,而其他组间正常卵泡百分比间的比较差异无统计学意义。各组间Cx43蛋白表达量从高到低,依次为全程添加FSH组(OG-FSH)、冻存前添加FSH组(FG-FSH)、冻存后添加FSH组(LG-FSH)、新鲜对照组(CG)、玻璃化冻存对照组(VCG),且差异有统计学意义(P<0.05)。结论玻璃化冻存全程添加FSH更有利于卵巢组织形态结构的保持以及Cx43蛋白的表达。     

平皿—微滴法玻璃化冷冻保存小鼠胚胎

目的：使用平皿－微滴法玻璃化冷冻小鼠8－12细胞胚胎，检验该方法对胚胎的冻存效果。方法：胚胎在EG20中平衡3min，EFS40中平衡1min，将含有胚胎的小于0.5μl的EFS40微滴吹于35mm平皿上并立即直接浸入液氮保存。结果：解冻后胚胎回收率达到98．1％，透明带无破损，冷落后存活率为95．2％。冻融胚胎体外发育和体内发育能力与对照组胚胎比较差异无显著性（84．3％对90．1％，12．1％对13．5％，P＞0．05）。结论：小鼠8－12细胞胚胎可以用平皿－微滴法有效地进行玻璃化冻存。     

冻融后不同时期和数目胚胎移植的临床妊娠结局比较

目的 比较冻融后对不同时期和数目的胚胎进行移植的临床妊娠结局.方法 选取广东省妇幼保健院2014年7月至2015年7月期间进行玻璃化冷冻并复苏培养的胚胎作为研究对象,共992个移植周期,均对D3卵裂期胚胎进行玻璃化冷冻后复苏,培养1d后进行移植.根据移植胚胎数目和桑椹胚数目分为单个胚胎移植[非桑葚胚组(移植1个非桑葚胚,n=41)、桑葚胚组(移植1个桑葚胚,n=28)]和两个胚胎移植[桑葚胚M0组(移植2个非桑椹胚,n=290)、桑葚胚M1组(移植1个非桑椹胚和1个桑葚胚,n=378)、桑葚胚M2组(移植2个桑葚胚,n=255)],分析各组间临床妊娠率、流产率、宫外孕率以及早产率.结果 单个胚胎移植时,桑葚胚组和非桑葚胚组的临床妊娠率(28.57%vs 29.27%)、流产率(5.00%vs 33.33%)、宫外孕率(0 vs 0)和早产率(12.50%vs 8.33%)比较差异均无统计学意义(P>0.05);两个胚胎移植时,随着移植桑葚胚数目的增加(桑葚胚M0组→桑葚胚M1组→桑葚胚M2组),临床妊娠率显著增加(42.41%→53.17%→66.27%),差异均有统计学意义(P<0.05);桑葚胚M0组、桑葚胚M1组和桑葚胚M2组的宫外孕率(2.44%vs 3.98%vs 2.37%)、流产率(11.38%vs 10.06%vs 12.94%)和早产率(19.51%vs 17.41%vs 24.26%)比较,差异均无统计学意义(P>0.05).结论 进行体外受精-胚胎移植时,选择D3胚胎解冻培养至桑葚胚期再行移植,能有效提高临床妊娠率,且不增加宫外孕、流产和早产的风险.     

Study on the developing potentiality of mouse morula produced in vitro or in vivo after vitrification

Great horovement haS been made in the cryopreservation Of inalnlnalian elnbmp since wnttingham['] reported his Pioneering wold about successful cryOPreservationof mouse embryo. It results in the availability of cryOPreserVation of embryos of all stages[']. HOwever, cryopreserved embryos can not avoid the damages by ice crystal,which is a major cause of cen death in the freezing andthawing ProceduresL',']. SO it is necesseq to seareh for anew and more efficient method for embryO cryOPrese…     

Comparison of Efficacy of Two Vitrification Solutions for Mouse Morulae

Objective To study the efficacy of two vitrification solutions for mouse morulae Methods Good morulaes of NIH mice were collected and used to test toxicity of the vitrification solutions EDS40 （40% ethylene glycol, 18% dextran and 0.5 tool sucrose） and EFS40 （40% ethylene glycol, 18% ficoll and 0.5 tool sucrose）. Fine vitrified morulae were packaged in 0.25 mL plastic straws and immersed into liquid nitrogen and cryopreserved for about 2-3 months. Then the straws were heated rapidly, washed in Ham＇s F12 medium and cultured. The viability was determined by morphology and blastocyst formation after being cultured for 48 h. Some embryos were transplanted to recipients after being cultured for 12-14 h. The number of pregnant recipients and young born was counted and analyzed by Chi-squared test. Results The toxicity of EDS40 solution was significantly lower than that of EFS40 （P〈0.05） and the number of embryos developed to the blastocysts after vitrification in EDS40 was significantly higher than in EFS40 （P〈0.05）. The number of zona pellucida and the number of pregnancy and birth integrated after vitrification cryopreservation had no significant difference between EDS40 and EFS40 （P〉0.05）. However, the embryo fineness rates after vitrification in EDS40 was significantly better than in EFS40 （P〈0.01）. Conclusion EDS40 solution has less toxicity and better cryoprotect effect on embryos than EFS 40.     

分割小鼠胚胎的简易方法和分割后二分胚的发育能力

本研究改进和简化了小鼠胚胎分割方法,在普通立体显微镜下用玻璃针手工切割,每切割一枚胚胎只需1min。共切割4日龄鼠胚701枚,得1346枚可用半胚,分割成功率为96.01%。半胚培养发育率达73.70%。冷冻裸半胚,装透明带半胚和装透明带后再用琼脂包埋半胚的解冻后培养发育率分别为26.67%、56.67%和64.29%。     

HBV—C转基因小鼠快速胚胎冷冻方法的建立

目的 建立用于转基因小鼠种质保存的快速胚胎冷冻方法。方法 用乙二醇作为抗冻保护剂,对携带HBV—C基因的转基因小鼠模型进行了玻璃化胚胎冷冻保存的研究。结果 发现含体积分数30％乙二醇的冷冻液可达到最佳的冷冻效果,有81．54％的冷冻胚胎在体外可进一步发育,其中69．81％达到孵化阶段,比较不同发育阶段的胚胎的冷冻效果发现,致密桑椹胚解冻后的孵化率显著高于囊胚。不同的装管方法对胚胎的回改率也有影响,五段法的胚胎回收率显著高于二段法。将解冻后形态正常的胚胎82枚移植给8只假孕母鼠,5只怀孕,怀孕率为62．5％,产下28只小鼠,产仔率为54．9％。结论 一步法玻璃化冷冻方法可用于转基因小鼠的种质保存。     

不同激光辅助孵化对玻璃化冷冻和慢速程序冷冻卵裂期胚胎移植妊娠率的影响

目的:研究分析两种激光辅助孵化方法对玻璃化冷冻和慢速程序冷冻卵裂期胚胎移植妊娠率的影响。方法:对2013年11月到2014年7月期间在我院接受冷冻胚胎移植的160例患者进行临床研究,随机分为两组,对照组为进行激光透明带打孔辅助孵化,研究组进行激光透明带薄化辅助孵化,比较组间患者的临床妊娠结局。结果:胚胎经程序冷冻后,研究组胚胎种植率(19.1%)显著高于对照组(12.3%),差异有统计学意义(P<0.05),而解冻后卵裂球存活率(82.21%vs.77.43%)与临床妊娠率(37.5%vs.32.5%)无显著差异(P>0.05);胚胎经玻璃化冷冻后,研究组和对照组解冻后卵裂球存活率(87.48%vs.87.41%)、胚胎的临床妊娠率(37.5%vs.35.0%)、种植率(17.5%vs.15.1%)相比较均无统计学差异(P>0.05);研究组中来源于两种冷冻方法的卵裂期胚胎解冻后卵裂球存活率(87.48%vs.82.21%)、临床妊娠率(37.5%vs.37.5%)和种植率(17.5%vs.19.1%)无统计学差异(P>0.05)。结论:激光透明带削薄优于激光透明带打孔用于辅助孵化,不影响患者的妊娠率,可减少对胚胎的损害。     

不同浓度冷冻保护剂乙二醇在人扩张囊胚玻璃化冷冻中的应用

目的研究不同浓度冷冻保护剂乙二醇(ethlene glycol,EG)在人扩张囊胚玻璃化冷冻中的应用。方法不同浓度EG 15%,30%,40%,联合15%二甲基亚砜(dimethylsulphoxide,DMSO),0.5 mol/L蔗糖(sucrose),采用两步法,利用改制半麦管为冷冻载体,玻璃化冷冻人扩张囊胚。比较解冻后囊胚存活率,扩张率及孵出率;并比较微吸管吹吸、辅助孵化针刺破胞膜辅助脱水及未辅助脱水对冷冻扩张囊胚的影响。结果由1原核(pronucleus, PN)发育而来的扩张囊胚玻璃化冷冻解冻后囊胚存活率15%EG组明显高于30%及40%EG组(P<0.05)。由2PN 发育成的扩张囊胚玻璃化冷冻解冻后囊胚孵出率15%EG组明显高于30%及40%EG组(P<0.05)。在冷冻过程中给予人工辅助脱水组解冻后囊胚孵出率明显高于未辅助脱水组(P<0.05)。微吸管吹吸组与辅助孵化针刺破胞膜辅助脱水组囊胚孵出率差异无显著性(P>0.05)。结论15%EG为人扩张囊胚玻璃化冷冻中有效和合适浓度。玻璃化冷冻中给予人工辅助脱水,能提高解冻后囊胚的发育潜能。     

不同品系小鼠胚胎玻璃化冷冻保存的比较研究

目的　研究甘油作为冷冻保护剂、不同基因型小鼠对胚胎玻璃化冷冻的影响。方法　采用 6 5mol L的甘油作为冷冻保护剂 ,采用二步法对CBA、NOD、C57BL 6J、ICR及CD1小鼠 3 5d的胚胎进行玻璃化冷冻 ,并比较了不同品系小鼠胚胎的复苏率及移植受孕率。结果和结论　CBA、NOD、C57BL 6J,ICR及CD1的复苏率分别为 5 7 6 %、4 8%、31 3%、86 5 %及 88% ,移植受孕率为 2 1%、2 3 5 %、11%、38%和 35 5 % ,封闭群小鼠的胚胎复苏率、移植受孕率均显著高于近交系小鼠。这提示胚胎的复苏率及移植受孕率可能与小鼠的不同基因型有关。五个品系中 ,桑椹胚及早期囊胚的体外复苏率均显著高于扩张囊胚。这说明不同基因型及胚胎的不同发育阶段对胚胎玻璃化冷冻效果有影响     

复苏周期单囊胚移植的影响因素分析

目的研究玻璃化复苏囊胚移植后的妊娠结局与冷冻前囊胚质量、发育速度的相关性,探讨单囊胚移植的可能性。方法回顾分析105例复苏周期单囊胚移植患者的临床资料,观察发育速度、囊胚质量、内细胞团(ICM)/滋养外胚层(TE)评分对妊娠结局的影响。结果第5、6天囊胚间复苏后存活率、移植后妊娠率的差异均无统计学意义(98.0%,54.5%vs 97.0%,52.5%)。优质囊胚移植后妊娠率(44/70,62.9%)显著高于非优质囊胚(12/35,34.3%)。ICM评分为A、B级的囊胚移植后妊娠率差异无统计学意义(70.6%vs 58.0%),但均显著高于C级胚胎(21.1%)。TE评分越低,妊娠率有下降趋势但差异无统计学意义。结论复苏周期单囊胚移植妊娠率与囊胚质量有关,与囊胚发育速度无关。ICM评分而非TE评分与妊娠结果显著相关。复苏周期单个优质囊胚移植后妊娠率高,提示单囊胚移植可行。