SARS冠状病毒N基因的扩增与克隆

目的 RT—PCR扩增、克隆SARS冠状病毒N蛋白基因。方法 根据GenBank数据库中TOR2株的全基因组序列，利用Primer Premier5．0软件设计引物RT-PCR巢式扩增SARS冠状病毒的N基因，PCR产物克隆后进行测序鉴定。结果 序列分析表明。pMD18-T载体中已成功重组了N基因。结论 N蛋白基因的扩增、克隆成功，为N蛋白的表达、N蛋白结构与功能的研究奠定了基础。     

SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因克隆和变异分析

目的:获得SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因的克隆.方法:将SARS病毒RNA基因组逆转录合成cDNA,PCR得到阳性条带,将其亚克隆到pUCm-T载体中进行酶切及测序分析,并与Genbank中核苷酸序列进行同源性分析.结果:阳性克隆经酶切鉴定,目的基因片段长度为1905 bp,与Genbank中另外45株的SARS病毒株的S蛋白S1片段基因比较,共有13个位点发生突变,其中有8处为同义突变,5处为错义突变.结论:成功克隆SARS冠状病毒S蛋白S1片段基因,为该基因的表达及功能研究奠定了基础.     

SARS冠状病毒PUMC2株N蛋白cDNA的克隆、表达和纯化

目的 原核表达并纯化SARS冠状病毒N蛋白。方法 用RT-PCR技术克隆SARS冠状病毒PUMC2株N蛋白全长cDNA,cDNA经序列分析鉴定后,克隆到pET32a表达载体,转化E．coli BL21进行原核表达并纯化出SARS冠状病毒N蛋白。结果 实现了SARS冠状病毒N蛋白的表达及纯化。结论 用基因重组方法表达的SARS冠状病毒N蛋白可为其进一步功能研究提供条件。     

SARS冠状病毒PUMC_2株N蛋白cDNA的克隆、表达和纯化

目的原核表达并纯化SARS冠状病毒N蛋白。方法用RT-PCR技术克隆SARS冠状病毒PUMC2株N蛋白全长cDNA,cDNA经序列分析鉴定后,克隆到pET32a表达载体,转化E.coliBL21进行原核表达并纯化出SARS冠状病毒N蛋白。结果实现了SARS冠状病毒N蛋白的表达及纯化。结论用基因重组方法表达的SARS冠状病毒N蛋白可为其进一步功能研究提供条件。     

SARS相关冠状病毒S2基因的克隆及其DNA疫苗的免疫效果

目的：构建抗原基因为SARS相关冠状病毒(severe acute resplratory syndrome coronavtrus，SARS—CoV)S2基因的DNA疫苗，将其接种小鼠后观察病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的S2基因片段克隆至真核表达载体，随之将质粒进行小鼠肌内接种免疫，定期检测血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：疫苗接种后第2周就能检测出病毒特异性抗体，随着时间的延续，抗体水平逐步升高，而空质粒对照组未检测出明显的特异性抗体。结论：以S2为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体。     

SARS冠状病毒PUMC2株全基因组cDNA分段克隆

目的 分段克隆SARS冠状病毒PUMC2株的全基因组cDNA。方法 以SARS冠状病毒PUMC2株基因组RNA为模板,用RT-PCR扩增cDNA片段,PCR产物经纯化后,连接人pGEM-T载体中,进行序列测定。结果 获得了SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA的分段克隆。结论 SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA分段克隆的获得,为SARS冠状病毒基因功能的研究和全长有感染性cDNA的克隆奠定了基础。     

SARS冠状病毒PUMC_2株全基因组cDNA分段克隆

目的分段克隆SARS冠状病毒PUMC2株的全基因组cDNA。方法以SARS冠状病毒PUMC2株基因组RNA为模板,用RT-PCR扩增cDNA片段,PCR产物经纯化后,连接入pGEM-T载体中,进行序列测定。结果获得了SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA的分段克隆。结论SARS冠状病毒PUMC2株基因组全长cDNA分段克隆的获得,为SARS冠状病毒基因功能的研究和全长有感染性cDNA的克隆奠定了基础。     

SARS冠状病毒全基因组突变初步分析

截至2003年5月12日，世界各地向GenBank已经提交了12条SARS冠状病毒的全基因组序列(新加坡5条、香港3条，北京1条，美国1条，加拿大1条，台湾1条)。我们收集了相关的数据，并对这12条序列(表1)做了比对分析，试图考察SARS冠状病毒自SARS流行以来有无大规模的转型，是否出现比较有意义的突变。     

SARS冠状病毒的研究现状

0引言 SARS(Severe Acute Respiratory Syndrome，严重急性呼吸综合征)目前已在全世界33个国家和地区广泛流行．由于其病原体扩增较快，又是新发现的传染病，目前世界上还来不及制备疫苗，也尚未找到特效的治疗药物，迄今为止，临床暂时试用的方法，如：①使用抗病毒药；②使用糖皮质激素；③使用持续气道正压通气；④使用IgM；⑤使用中医药等，疗效均不显。     

SARS相关冠状病毒的研究进展

冠状病毒和与SARS相关的冠状病毒：第一个冠状病毒是1937年从鸡身上分离出来的。由于在电子显微镜下其形态呈现日冕状或皇冠状而得名。此后至少有15种不同的冠状病毒被发现。根据目前所知，冠状病毒科只感染脊椎动物，与人和动物许多疾病相关。引起人类疾病的冠状病毒主要表现为呼吸道和消化道感染。冠状病毒感染非常普遍，虽然人冠状病毒感染可解释30％的普通感冒，但它们极少导致下呼吸道疾病，也从未造成SARS这么严重的后果。     

人β-防御素-3基因的克隆和序列测定

目的 克隆人β-防御素－3的基因。方法 提取人皮肤组织的总RNA，反转录为cDNA作为模板，采用PCR的方法克隆人β－防御素－3基因。PCR产物连接入pGEM-T-EASY载体，转化DH－5α受感态细胞，蓝白筛选，对酶切及PCR鉴定含有目的片段的克隆进行测序。结果 获得预期大小的PCR产物，经序列鉴定证实为人β－防御素－3基因。结经 获得了人β-防御素－3基因。     

支气管哮喘患者白细胞介素-4近侧启动子区克隆和序列分析

目的 探讨哮喘患者白细胞介素-4（IL-4）过度表达的可能调控机制。方法 选取4例有明显家族史的过敏性哮喘患儿和1例正常儿童,采用聚合酶链反应（PCR）扩增IL-4近侧启动子片段,PCR产物经XbaI、HindⅢ限制性内切酶进行双酶切后,回收酶切片段,再与经过相同双酶切的载体Jx2相连接,制备重组质粒,然后经转化、筛选、酶切鉴定得到重组质粒pIL-4-Jx2,最后采用双脱氧终止法对重组质粒进行序列测定。结果 （1）正常儿童IL-4近侧启动子序列与基因库序列相同。（2）1例患儿-229位C被A所替代。该变异恰好位于正性调节元件-I之内,结论 过敏性哮喘患者IL-4近侧启动子区DNA片段被成功克隆,并发现1例患者IL-4调控元件内一未曾报道过的变异位点,这有助于对哮喘者IL-4基因异常表达调控机制的研究。     

人MAGE-3基因片段的克隆与测序

目的克隆表达人MAGE-3基因片段(210～623位碱基),以便研究其对MAGE-3阳性恶性肿瘤的生物学作用。方法为选择靶基因,采用分子生物学软件分析MAGE-3基因抗原表位;并设计MAGE-3靶区域引物。从人肺癌组织标本中提取mRNA,用RT-PCR法从中扩增出MAGE-3片段,对其进行XhoⅠⅡ酶切鉴定;将扩增片段克隆于pGEM-TEasy载体中,转化JM109,进行阳性筛选后,运用pGEM-TEasy质粒的T7/SP6作为引物对重组子鉴定,并进行DNA测序。结果抗原表位分析表明MAGE-3基因片段(210～623位碱基)为抗原决定簇丰富区段。RNA体外扩增得到的片段为414bp,并经XhoⅠⅡ酶切鉴定得到证实;pGEM-TEasy-MAGE-3经筛选鉴定正确,DNA测序结果与Genebank比较完全相同,表明靶基因成功插入pGEM-TEasy。结论该片段可用于真核及原核表达。     

人神经营养素-3全长基因克隆及序列分析

目的: 扩增人神经营养素-3(human neurotrophin-3,hNT-3)全长基因并进行序列分析。方法: 应用聚合酶链反应技术,以一个健康成人基因组DNA为模板,扩增出编码hNT-3的全长基因,并克隆至pMD18-T载体中进行基因测序。结果: 所得序列与Genbank提供的序列(M61180)对比显示,除hNT-3中第555位碱基由C→T外,余序列同已知序列完全一致,改变的碱基并不影响基因编码的氨基酸序列。结论: 成功地获得了hNT-3的全长基因,且序列与已知序列高度一致。     

SARS冠状病毒S1基因的克隆及其植物表达载体的构建

目的:为获得抗SARS的转基因植物疫苗,进行了SARS S1基因的克隆,植物表达载体构建的研究。方法:根据SARS S蛋白受体结合结构域318-510氨基酸区域,设计合成长579 bp的序列片断(S1基因)。并以之为模板,进行PCR扩增,扩增产物被克隆至pGEM-Teasy载体进行序列测定。然后将S1基因插入植物表达载体pCAMB IA2301的35S启动子和NOS终止子之间,构建植物表达载体pCS1。将重组体转化大肠杆菌E.coliXL1,并对重组体进行了鉴定。结果:酶切鉴定和序列分析显示,克隆的目的基因与设计的片断序列一致;双酶切表明,植物表达载体的构建完全正确。结论:成功地克隆了S1基因和构建了含有S1基因的植物表达载体,为进一步获得抗SARS的转基因植物疫苗打下了基础。     

人骨形成蛋白-3成熟肽cDNA的克隆、测序及表达

目的：扩增、克隆人骨形成蛋白－３（ｈＢＭＰ－３）成熟肽ｃＤＮＡ基因，利用大肠杆菌表达ｈＢＭＰ－３成熟肽．方法：ＰＣＲ方法扩增ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，双脱氧终止法测序正确后，克隆入大肠杆菌表达载体ｐＤＨ，受控于ＰＲＰＬ启动子，重组质粒ｐＤＨＢ－３ｍ以大肠杆菌ＤＨ５α为宿主菌在４２℃进行温度诱导．结果：扩增出ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，序列测定完全正确；含重组质粒ｐＤＨ－Ｂ３ｍ的工程菌诱导后在ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上出现一条新生蛋白带，分子质量为１４．５ｋｕ，与预期ｈＢＭＰ－３成熟肽分子量大小一致，约占菌体总蛋白的２８％．结论：成功扩增、克隆ｈＢＭＰ－３成熟肽ｃＤＮＡ基因，并可在大肠杆菌中得到高效表达     

小鼠Wnt-3a基因的克隆、测序与真核表达载体的构建

1 材料和方法 1.1 材料 KM小鼠,孕13.5 d,安徽省实验动物中心提供. 大肠杆菌JM109由安徽医科大学分子生物学教研室提供. Trizol试剂盒、pSecTag2/Hygro B质粒(Invitrogen). 质粒小量提取试剂盒、 RT-PCR试剂盒(Promega);Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶,DNA Marker, pMD18-T Vector,限制性内切酶(TaKaRa).     

SARS相关冠状病毒M基因片段的克隆及其DNA疫苗诱导的体液免疫

目的：构建含有SARS相关冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS—CoV)M基因片段的核酸疫苗，观察其免疫小鼠后病毒特异性抗体产生情况。方法：将合成的M基因片段克隆到核酸疫苗真核表达载体pVAX1中，免疫小鼠后，用SARS—CoV抗体ELISA检测试剂盒定期检测免疫小鼠血清中抗SARS—CoV的病毒特异性抗体水平。结果：构建了重组核酸疫苗质粒pVCo—M，免疫小鼠后可诱导产生出病毒特异性抗体。结论：以M为抗原基因的DNA疫苗能诱导SARS病毒特异性抗体，为进一步改进或探索同类DNA疫苗提供有益启示。