结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85B编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85B编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVaxl中，转化大肠杆菌DH5a，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌PCR扩增为阳性，经限制性内切酶消化后可见目的条带，所测定序列与报道的Ag85B序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85B基因真核表达株。     

结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株的构建

目的 构建结核分支杆菌分泌蛋白Ag85A编码基因的DNA疫苗。方法 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，PCR扩增Ag85A编码基因，用限制性内切酶消化后，插入真核表达载体pVAXl中，转化大肠杆菌DH5α，进行重组子筛选、鉴定。结果 以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板，用Ag85A引物PER扩增出1041bp特异性片段，以重组子DNA为模板用Ag85A引物PCR扩增为阳性，重组子经限制性内切酶消化后可见目的片段，所测定序列与报道的Ag85A序列一致。结论 成功地构建了结核分支杆菌Ag85A基因真核表达株，该DNA疫苗的免疫效果有待进一步研究。     

PstS1-卡介苗重组疫苗的构建

目的：构建结核分支杆菌分泌蛋白磷酸盐特异转运系统1（PstS1）的重组卡介苗。方法:以结核分支杆菌H37Rv基因组为模板,通过PCR扩增获得PstS1基因序列;将PstS1基因与大肠杆菌-卡介苗穿梭表达质粒PMD31重组,得到S-PMD31重组质粒,对S-PMD31重组质粒进行HindⅢ、BanHⅠ双酶切及测序鉴定,转化大肠杆菌,用IPTG对工程菌株进行诱导表达,并通过电穿孔技术将S-PMD31重组质粒导入卡介苗中构建重组卡介苗。结果：用引物P1、P2对结核分枝杆菌H37R_V基因组进行PCR扩增获得长为1 100 bp的PstS1基因序列,S-PMD31重组质粒的HindⅢ、BanHⅠ双酶切及测序鉴定证实：PstS1基因正确插入载体PMD31中,并能在大肠杆菌中诱导表达。通过质粒提取及PCR扩增表明重组质粒正确导入卡介苗中。结论：成功地构建了PstS1重组卡介苗,预期能提高卡介苗的免疫原性和保护力。     

携带绿色荧光蛋白人转化生长因子基因真核表达载体的构建

目的：构建携带绿色荧光蛋白(GFP)人转化生长因子基因真核表达载体。方法：应用RT-PCR方法扩增人转化生长因子基因，与GFP真核表达载体连接，构建带有标记基因和人转化生长因子基因的真核表达载体，并用限制性内切酶酶切鉴定。结果：构建的新质粒经酶切鉴定和DNA测序，证实新质粒的构建成功。结论：应用RT-PCR方法扩增目的DNA片段，简单快捷；双酶切定向克隆可以保证构建一步到位，免去正反向重组体筛选的问题。     

人载脂蛋白M野生型和突变型表达载体的构建及鉴定

目的: 构建人载脂蛋白M (APoM)野生型和突变型原核表达载体PGEX-KG-APoM及真核表达载体PcDNA3.1(+)-APoM。方法: Trizol法抽提HePG2细胞总RNA,RT-PCR扩增APoM全长基因,将基因片断重组到PMD18-T质粒中构建PMD18-T-APoM重组质粒载体,转化到大肠埃希菌JM109后筛选阳性克隆,提取质粒酶切和测序鉴定。采用Sited-directedMutagenesis定点诱变试剂盒对APoM基因进行体外定点诱变,DNA测序鉴定定点诱变成功与否。用双酶切方法分别将APoM野生型和突变型基因定向连接到原核表达载体PGEX-KG和真核表达载体PcDNA3.1(+)中,构建野生型和突变型PGEX-KGAPoM重组体和PcDNA3.1(+)-APoM重组体,分别转化到大肠埃希菌DH5α内,提取质粒酶切鉴定和测序鉴定。结果: 成功克隆了APoM并构建了野生型和突变型原核表达载体和真核表达载体。结论: 通过RT-PCR,定点诱变及基因重组技术成功构建野生型和突变型重组表达质粒PGEX-KG-APoM和PcDNA3.1(+)-APoM,为进一步研究APoM的功能奠定了基础。     

结核分枝杆菌Ag85A真核表达质粒的构建与鉴定

目的：构建结核分枝杆菌Ag85A重组真核表达质粒，为DNA疫苗的研究提供靶基因。方法：采用聚合酶链反应(PCR)方法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出结核杆菌Ag85A分泌性蛋白的基因，应用T-A克隆技术，直接与pUCan-T载体连接，转化大肠杆菌JMl09(E．coli JMl09)，蓝白筛选，阳性克隆经酶切鉴定和DNA测序证实基因碱基无误后，用NheⅠ和XbaⅠ双酶消化，回收的小片段与用NheⅠ和XbaⅠ消化的真核表达质粒pCI-neo连接，转化E.coli JMl09，筛选阳性克隆酶切鉴定。结果：经酶切鉴定，证实结核分枝杆菌重组真核表达质粒pCI-Ag85A构建正确。结论：结核分枝杆菌真核表达质粒pCI-Ag85A构建成功，为进一步研究其作为一种结核病DNA密菌在预防和治疗结核病中的作用奠定了基础。     

结核分枝杆菌Rv2994基因重组穿梭质粒的构建与鉴定

目的构建结核分枝杆菌假想药物外排泵蛋白编码基因Rv2994的重组穿梭质粒pMV-2994,并对其进行鉴定。方法以结核分枝杆菌H37Rv基因组为模板,应用PCR技术扩增Rv2994基因编码序列,定向克隆入融合蛋白原核表达载体pGEX-1λT,获得重组表达质粒pGEX-2994,测序鉴定。酶切该基因片段,定向重组入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭载体pMV261,构建重组质粒pMV-2994,通过限制性内切酶酶切及PCR鉴定。结果从结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA中扩增出的Rv2994基因与GenBank公布的序列一致,经过酶切及PCR鉴定,表明Rv2994基因成功插入了pMV261穿梭载体。结论成功构建了重组穿梭质粒pMV-2994,为进一步研究Rv2994基因功能奠定了基础。     

死亡素在大肠杆菌中的融合表达

目的:构建死亡素基因重组表达载体,并以融合蛋白的形式在大肠杆菌中诱导表达。方法:人工合成死亡素基因片段,克隆于质粒pUC18,转化大肠杆菌DH5α,挑选阳性菌落,提取重组质粒双酶切,电泳回收目的基因,与经相同酶切的pGEx-4T-l连接构建重组表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),筛选阳性菌落,抽提质粒进行鉴定,测序正确的重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达。结果:重组表达质粒经双酶切、PCR及测序鉴定,证明目的基因正确插入。IPTG诱导表达后,SDS-PAGE显示出现目的条带,与预期结果一致。结论:成功构建了死亡素基因的原核表达载体,并诱导表达出目的融合蛋白。     

结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的高效表达

目的 通过结核分支杆菌Ag85B蛋白编码基因在大肠杆菌中稳定表达，以获得大量纯化的Ag85B蛋白。方法 采用DNA重组技术构建结核分支杆菌Ag85B基因的表达载体，双酶切和聚合酶链反应(PCR)鉴定重组子，阳性重组子转化大肠杆菌，并诱导表达外源蛋白。十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)鉴定Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中的表达，对染色的凝胶扫描，以测定目的蛋白表达水平。结果 菌体蛋白经SDSPAGE，含阳性重组质粒的菌体蛋白中出现一条新蛋白带，表达量占菌体总蛋白的33％～38％。Ag85B蛋白抗原在大肠杆菌中表达方式主要是包涵体形式。结论 构建的大肠杆菌重组体能高效表达结核分支杆菌Ag85B蛋白抗原。     

小鼠4-1BBL基因真核表达载体构建及其在前列腺癌细胞中的表达

目的:构建含小鼠4-1BBL编码区cDNA序列的真核表达载体,并检测其在前列腺癌细胞株(PC-3)中的表达。方法:将目的基因m4-1BBL全长cDNA克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),获得m4-1BBL定向插入重组子pcDNA3.1(+)m4-1BBL,采用限制性内切酶和测序鉴定是否成功构建。用脂质体法将重组质粒转入PC-3细胞,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测m4-1BBL在PC-3中的表达。结果:酶切鉴定和序列分析证实,重组质粒含有小鼠4-1BBL全长cDNA编码序列,转染实验表明m4-1BBL基因能在PC-3细胞中表达。结论:小鼠4-1BBL全长cDNA基因真核表达载体构建及其在PC-3细胞中的表达均获成功,为进一步研究莫定了基础。     

诱导性鼠Smad7真核表达载体的构建与鉴定

目的构建四环素诱导性鼠Smad7真核表达载体。方法采用常规分子生物学方法,抽提SD大鼠肾脏总RNA,RT-PCR获得鼠Smad7 cDNA,再定向克隆于四环素诱导性真核表达载体pBI-L多克隆位点MeI和HindⅢ之间,限制性内切酶酶切和测序鉴定。结果重组pBI-L-Smad7真核表达载体经限制性内切酶酶切分析和测序分析,与理论值相符。结论本实验成功构建鼠Smad7四环索诱导性真核表达载体pBI-L-Smad7,为今后临床开展组织器官纤维化Smad7基因治疗奠定实验基础。     

WDR5真核表达载体的构建及其在LNCaP细胞中的稳定表达

目的 构建人源WDR5全长结构基因真核表达载体, 建立稳定表达WDR5的LNCaP细胞株.方法PCR扩增WDR5基因, 将WDR5插入pCI-neo载体中, 酶切及测序鉴定重组质粒.利用脂质体转染法将重组质粒转染LNCaP细胞, Real Time-PCR检测转染细胞WDR5的m RNA表达水平.结果 经酶切及测序证实真核表达载体pCI-neo-WDR5构建正确.重组质粒转染到LNCaP细胞后, 用G418筛选获得稳定表达的细胞株, Real Time-PCR方法检测到WDR5基因在转录水平的表达.结论 PCI-neo-WDR5成功转染LNCaP细胞株中并稳定表达, 为下一步WDR5的深入研究及应用奠定了基础.     

IL-2/Fc融合基因真核表达载体的构建和表达

目的：构建含人IL-2 cDNA基因和免疫球蛋白Fc片段融合基因的真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在真核细胞中表达，以期用于乙型肝炎病毒(HBV)DNA疫苗的研究。方法：应用重叠延伸剪切技术(SOE)经两次PCR获得嵌合基因片段IL-2／Fc，回收后克隆到中间pGEM—T：Easy TA克隆载体，得到合适的酶切位点后，用双粘端连接法转克隆入真核表达载体pcDNA 3．1中，得到真核重组载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc。然后用脂质体法转染SP2／0细胞。结果：对重组载体进行限制性酶切鉴定及测序分析，证明连接正确；经ELISA检测证实，该重组载体能够在真核细胞中外分泌表达插入的外源性基因编码的融合蛋白。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA 3．1 IL-2／Fc，并在SP2／0细胞中有效表达。     

cdx2真核表达质粒的构建

目的：构建含有cdx2全长基因的真核表达质粒并在人胃上皮细胞系中表达。方法：从人结肠上皮组织中提取总RNA,RT-PCR获得全长人cdx2基因的cDNA,测序证实序列正确后亚克隆入pcDNA3.1来构建重组真核表达载体pcDNA3.1/cdx2。使用脂质体将该重组质粒转染入人胃上皮细胞GES-1中,RT-PCR证明该细胞中出现人cdx2基因的表达。结果：酶切鉴定和测序显示靶基因cdx2克隆到pcDNA3.1质粒中,RT-PCR证实转染的人胃上皮细胞中有人cdx2基因的表达。结论：成功构建含有人cdx2基因的真核表达质粒。并在人胃上皮细胞中表达。     

遗传性长QT综合征HERG基因真核表达载体的构建和在HEK293细胞中的表达

目的构建HERG基因的真核表达载体,并在人胚胎肾细胞（HEK293）中进行表达。方法先将pGH19-HERG通过限制性酶SacⅠ和EcoR Ⅰ酶切得到HERG cDNA,将pIRES2-EGFP用SacⅠ和EcoRⅠ进行双酶切,把HERGcDNA定向克隆到pIRES2-EGFP中,即构建了HERG基因的真核表达载体pIRES2-EGFP—HERG。然后利用电穿孔法将pIRES2-EGFP-HERG转染HEK293细胞。结果在卵母细胞异源表达载体pGH19-HERG基础上,获得了真核表达载体pIRES2-EGFP—HERG,并在HEK293细胞中成功进行了表达。结论在HERG基因卵母细胞异源表达载体的基础上,构建了HERG基因的真核表达载体piRES2-EGFP-HERG,利用电穿孔法将其转染至HEK293细胞中并成功地进行了表达,为下一步进行膜片钳的研究奠定基础。     

人核心蛋白聚糖真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建人核心蛋白聚糖（DCN）真核表达载体,为进一步研究其生物学活性奠定基础。 方法：采用聚合酶链反应（PCR）扩增目的片段,PCR产物及真核表达载体pcDNA3分别双酶切后进行连接,并转化入大肠杆菌JM109中扩增以获得重组载体。 结果：PCR获得与预期大小一致的、约1 000 bp的特异性DNA片段,PCR产物与表达载体经双酶切后连接,构建重组载体pcDNA-dec,经双酶切鉴定及测序证实,人DCN基因cDNA片段正确插入真核表达载体中。结论：成功构建人DCN真核表达载体pcDNA-dec。     

pcDNA3.1(+)gpc-5真核表达载体的构建及鉴定

目的：构建pcDNA3.1（＋）磷脂酞肌醇蛋白5（gpc-5）基因真核表达载体。方法：根据gpc-5基因序列设计一对引物,利用RT-PCR法扩增出gpc-5基因的编码区（CDS）,连接在PGM-T载体上,并进行pcDNA3.1（＋）gpc-5真核表达载体的构建、酶切鉴定以及测序。结果：gpc-5基因的体外扩增目的片段为2 083 bp。所构建的重组体pcDNA3.1（＋）gpc-5经双酶切鉴定,与预期片段大小一致,测序结果与NCB I收录gpc-5基因的CDS序列一致。结论：成功构建了真核表达载体pcDNA3.1（＋）gpc-5,为研究gpc-5基因在原发性肺癌的发生发展中的作用奠定了基础。     

大鼠寡霉素敏感相关蛋白的克隆及真核表达载体的构建

目的:克隆大鼠寡霉素敏感相关蛋白(OSCP)的基因并构建pEGFP-N1真核表达载体。方法:采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)从大鼠脑组织中扩增出OSCP基因,将其插入到pTA2克隆载体中,测序鉴定后亚克隆至pEGFP-N1真核表达载体并进行酶切、测序鉴定。结果:PCR扩增出约为700 bp的基因片段;重组克隆载体pTA2-OSCP经测序鉴定证明pTA2载体中插入了目的基因片段;重组表达载体pEGFP-N1-OSCP经酶切、测序鉴定证明其构建成功。结论:OSCP基因克隆和真核表达载体构建成功,这为下一步开展该基因的重组蛋白表达及功能研究奠定了基础。     

人转化生长因子-β1基因克隆、测序及真核表达载体的构建

目的：克隆人转化生长因子-β1（TGF-β1）基因编码区cDNA序列，构建并鉴定TGF-β1真核表达载体。方法：设计含有EcoRI和Xhol Ⅰ酶切位点的TGF-β1 cDNA引物，利用逆转录聚合酶链反应（RT—PCR）法，以人白细胞mRNA为模版，扩增TGF-β1基因，纯化PCR产物，TA克隆，双酶切与pcDNA3质粒表达载体连接，转化感受态大肠杆菌JM109，酶切鉴定阳性董组子，并进行序列测定。结果：琼脂糖凝胶电泳显示，用双酶切后形成分子量1．2kb的条带，符合物理图谱，表明表达载体构建成功，序列测定结果与预测结果完全一致。结论：成功克隆了TGF-β1基因，并成功地构建了真核表达载体pcDNA3-TGF-β1.