RNAi沉默Survivin基因抑制人鼻咽癌细胞生长

目的观察RNA干扰沉默Survivin基因对人鼻咽癌CNE2细胞在体内外生长的抑制作用。方法将Survivin特异性shRNA表达载体pGenesil-1-survivin经Lipofectamine。”2000介导转染人鼻咽癌CNE2细胞,经G418筛选获得稳定转染的CNE2细胞,荧光显微镜和流式细胞仪检测细胞转染效率;逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Westernblot分别检测Survivin基因mRNA和蛋白表达水平;噻唑蓝（MTF）法检测细胞增殖能力的变化。以稳定转染细胞建立裸鼠荷瘤模型,观测瘤体积的变化,绘制移植瘤生长曲线。结果流式细胞仪检测pGenesil-1-survivin细胞转染百分率为（87．13±2．21）％;RT．PCR和Westernblot结果显示,pGenesil-1-survivin组对人鼻咽癌CNE2细胞SurvivinmRNA和蛋白的抑制率分别为64．55％和51．24％,均较随机序列构建载体的阴性对照（pGenesil-1-NC）组和空白对照组明显下调（均P〈0．05）;MTT结果显示,pGenesil-1-survivin组细胞增殖能力明显较pGenesil-1-NC组和空白对照组降低（均P〈0．05）;体内实验表明,pGenesil-1-survivin组较pGenesil-1-NC组和空白对照组能有效抑制BALB／C裸鼠人鼻咽癌的生长（均P〈0．05）。结论沉默Survivin基因可以有效抑制人鼻咽癌CNE2细胞在体内外的增殖,Survivin基因有望成为鼻咽癌基因治疗的有效靶点。     

bcl-2基因在鼻咽癌中的表达

目的研究bcl2基因在鼻咽癌中的表达及其与预后的关系。方法对84例鼻咽癌和21例非癌样本中bcl2mRNA进行逆转录聚合酶链反应定量分析及单链构象多态性分析。结果①鼻咽癌组bcl2mRNA的水平比非癌组高,差异有显著性(新发组P<0.05,复发组P<0.01);②鼻咽癌复发组bcl2mRNA的水平比新发组高,差异有显著性(P<0.05)。③逆转录聚合酶链反应单链构象多态性分析未发现所检查的基因片段有点突变。结论鼻咽癌中bcl2的表达增高,其过度表达可能是由转录增强所引起,bcl2的高表达提示鼻咽癌预后不良。     

RNA干扰GCF2基因沉默对人肝癌BEL-7404细胞侵袭能力的影响

目的 探讨沉默GCF2基因表达对人肝癌BEL-7404细胞侵袭能力的影响.方法 实验分为GCF2-siRNA组、NC-siRNA组及MOCK组,GCF2-siRNA组转染靶向GCF2基因的RNA干扰序列GCF2-siRNA,阴性对照组转染阴性对照序列NC-siRNA,MOCK组不转染任何序列.将靶向GCF2基因的RNA干扰序列 (GCF2-siRNA) 瞬时转染BEL-7404细胞以沉默GCF2表达,采用CCK-8法检测细胞增殖活性,体外侵袭实验检测细胞侵袭能力,Western blot检测基质金属蛋白酶(MMP)-9及GCF2靶基因MMP-23蛋白表达.结果 转染GCF2-siRNA使GCF2表达下调,后者导致BEL-7404增殖受阻;GCF2-siRNA组的穿膜细胞数较阴性对照组(NC-siRNA)及未转染组(MOCK)明显减少(穿膜细胞数分别为41.5±0.95、61.3±1.57、64.5±1.65,P<0.05);MMP-9和MMP-23蛋白表达较两个对照组明显下降(P<0.05).结论 下调GCF2表达能抑制BEL-7404侵袭能力, 提示GCF2促进肝癌细胞的侵袭可能是其参与肝癌发展进程的重要途径.     

RNA 干扰bcl-2基因对人卵巢癌细胞株SKOV3增殖影响的实验研究

目的探讨RNA干扰bcl-2基因对人卵巢癌细胞体外增殖及凋亡的调控作用.方法选用人卵巢癌细胞进行体外培养,以siRNA分别处理SKOV3细胞24～72h后,MTT法检测细胞增殖,SABC免疫组织化学法检测细胞内bcl-2、bcl-xl、bax、caspase-3蛋白表达水平.结果 RNA干扰bcl-2基因对SKOV3细胞增殖有抑制作用.bcl-2表达下调,Caspase-3蛋白表达水平上调.结论 RNA干扰bcl-2对人卵巢癌细胞的增殖具有明显的抑制作用.下调bcl-2的表达,上调Caspase-3蛋白表达水平.特异性地降解抗凋亡基因bcl-2的mRNA是其作用机制.     

RNA干扰沉默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞增殖的影响

目的:研究RNA干扰沉默EZH2基因对人膀胱癌EJ细胞周期和增殖的影响.方法:体外构建EZH2基因的shRNA的表达载体,Lipofectamin 2000介导转染膀胱癌EJ细胞,采用RT-PCR和Western Blot方法检测特异性shRNA对EZH2基因沉默效果,转染后采用MTT法检测shRNA对细胞增殖的作用;应用PI单染流式细胞术分析对细胞周期的改变.结果:EZH2基因的shRNA表达载体有效下调EZH2基因的表达(P<0.05).与对照组比较,细胞增殖明显抑制(P<0.05);同时引起细胞G1期阻滞,RNA干扰后,G1期细胞增加[(84.0±8.7)% vs (52.0±6.8)%, P<0.05],S期细胞减少[(11.0±1.1)% vs (43.0±4.9)%, P<0.05].结论:EZH2基因有望成为应用RNAi技术探索膀胱癌基因治疗的潜在靶基因.     

RNA干扰沉默食管癌COX-2基因的实验研究

目的:观察人食管鳞癌细胞(Eca-109)在RNAi抑制其环氧合酶2(COX-2)基因表达后生物学行为的变化。方法:采用DNA载体细胞内表达siRNA技术,以含RNA聚合酶Ⅲ启动子H1的质粒pSUPER,针对人COX-2 mRNA分别构建重组质粒psiRNA-C1、psiRNA-C2,转染Eca-109细胞,对照组采用空白质粒pSU-PER。ELISA测定培养液上清PGE2浓度,Real Time PCR检测细胞COX-2 mRNA水平,流式细胞术分析细胞凋亡与周期分布,绘制细胞生长曲线。结果:在psiRNA-C1p、siRNA-C2转染Eca-109细胞24 h后,细胞COX-2mRNA水平分别下降了17.9%、56.1%,培养液上清PGE2浓度分别下降了10.8%5、4.9%;psiRNA-C2组细胞生长明显减缓,G0~G1期细胞比例增加(P<0.01),G2~M期细胞减少(P<0.05)、细胞凋亡率增加(P<0.01)。结论:RNAi技术可显著抑制人食管鳞癌细胞COX-2基因表达,从而导致肿瘤细胞增殖减缓、凋亡增加。     

RNA干扰沉默雄激素受体基因对前列腺癌细胞生长的抑制作用研究

目的设计、合成针对雄激素受体(AR)基因的具有高干扰效率的si RNA,观察其对前列腺癌细胞的生长抑制作用。方法设计、合成多个针对AR的si RNA,转染前列腺癌细胞LNCaP,筛选出对AR基因干扰效率最高的ARsi RNA,用RT-PCR检测AR mRNA水平,并计算细胞生长抑制率。结果采用Silencer si RNA Construction Kit成功合成了ARsi RNA,转染LN-CaP细胞,筛选出一个对其生长抑制作用最强的si RNA,并证实AR mRNA水平显著下降,LNCaP细胞的生长抑制率为78.2%。结论针对雄激素受体的si RNA可沉默雄激素受体基因,并抑制前列腺癌细胞的生长。     

RNA干扰沉默mTOR基因对肝癌HepG2细胞侵袭和转移的影响

目的：探讨RNA干扰技术对人肝癌HepG2细胞mTOR的表达及细胞侵袭与转移的影响。方法：体外合成mTOR siRNA,并转染HepG2细胞24 h,同时设无义对照组（转染无义对照siRNA）、空白对照组（转染空脂质体）及正常对照组（不转染）。采用western blot法检测各组HepG2细胞的mTOR蛋白表达;应用Transwell小室细胞体外实验检测转染后肝癌HepG2细胞的穿膜细胞数,评价肝癌细胞体外侵袭和转移能力的变化。结果：mTOR siRNA转染组HepG2细胞mTOR蛋白的表达低于各对照组（P〈0.05）;HepG2细胞侵袭和转移力均显著低于各对照组（P〈0.05）。结论：mTOR siRNA可有效抑制HepG2细胞mTOR蛋白的表达,且能抑制HepG2细胞的侵袭和迁移。     

Bcl-2短发夹状RNA对BEL-7402、Caco2细胞的生长抑制作用

目的:研究Bcl-2短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)序列的表达载体对肝癌细胞系BEL-7402和结肠癌细胞系Caco2生长的抑制作用.方法:将Bcl-2 shRNA序列克隆到携带绿色荧光蛋白基因的质粒Pgenesil-1载体,采用脂质体介导的转染方法将构建的Bcl-2shRNA表达质粒转入BEL-7402、Caco2细胞,同时设立阴性shRNA组、空载体组、脂质体组、空白组作为对照.通过倒置荧光显微镜和流式细胞仪观察细胞的转染效率,Western印迹法检测Bcl-2蛋白表达水平,MTT法测定细胞增殖情况.结果:Bcl-2 shRNA转染组、阴性shRNA组、空载体组的转染效率无显著差异.转染Bcl-2 shRNA后BEL-7402、Caco2细胞Bcl-2蛋白表达水平与转染阴性shRNA、空载体组、脂质体组和空白组相比均显著降低(P＜0.05),且Bcl-2 shRNA抑制Caco2细胞Bcl-2蛋白表达比BEL-7402细胞更为明显(P＜0.05).MTT测定显示转染Bcl-2 shRNA载体入BEL-7402、Caco2细胞在72、96 h细胞生长明显受到抑制,分别与转染阴性shRNA、空载体组、脂质体组和空白组比较,差异有显著性(P＜0.05).结论:Bcl-2 shRNA可特异性地抑制BEL-7402、Caco2细胞生长.     

RNA干扰介导的Cdx2沉默对人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤生长的影响

目的 建立人胃癌裸鼠移植瘤模型,探讨Cdx2基因RNA干扰(RNAi)的重组慢病毒载体(pLL-Cdx2-siRNA)对人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤Cdx2基因表达和肿瘤生长的影响.方法 建立人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤模型,随机分为实验组(pLL-Cdx2-siRNA组),空载体组(pLL3.7组)和生理盐水组.隔天向各组动物肿瘤内分别注射Cdx2基因沉默的重组慢病毒载体pLL-Cdx2-siRNA、空载体pLL3.7或生理盐水0.2 mL,共6次,测量各组肿瘤体积的大小;11d后处死裸鼠,应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot技术检测移植瘤中Cdx2基因的表达,脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记(TUNEL)技术检测肿瘤细胞的凋亡.结果与生理盐水组和空载体组相比,实验组的肿瘤生长速度明显减慢(P＜0.05),肿瘤细胞Cdx2 mRNA和蛋白表达明显下降(P＜0.05);实验组肿瘤细胞的凋亡指数(16.7±5.6)％明显高于空载体组( 10.5±4.1)％和生理盐水组(11.2±4.3)％(P＜0.05).结论慢病毒载体pLL-Cdx2-siRNA瘤内注射可抑制人胃癌细胞MGC-803裸鼠移植瘤的生长.     

bcl-2 RNAi表达载体的构建、鉴定及其对Raji细胞的干扰效果

目的 构建bcl-2特异性RNAi真核细胞质粒表达载体,并研究其对B细胞淋巴瘤Raji细胞的干扰效果.方法 根据GenBank提供的bcl-2 cDNA序列,设计并合成两对短发夹结构的互补DNA序列,经退火形成互补双链,克隆至载体pGenensil-1构建重组质粒,予以酶切和DNA测序鉴定.脂质体介导重组质粒转染Raji细胞,采用RT-PCR法观察重组质粒对bcl-2 mRNA表达的影响,流式细胞仪测定细胞凋亡.结果 酶切及测序鉴定表明,成功构建bcl-2 shRNA的质粒表达载体pGenesil-1-bcl-2-544和pGenesil-1-bci-2-1009.转染Raji细胞48 h后,RT-PCR结果显示Raji细胞中bcl-2 mRNA表达分别下调了(31.95±3.02)%和(47.57±2.88)%,与空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);流式细胞仪检测结果显示Raji细胞凋亡率分别为(14.25±0.84)%和(11.96±0.79)%,明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05).结论 成功构建bcl-2特异性RNAi真核细胞质粒表达载体,它能有效沉默bcl-2基因在B细胞淋巴瘤中的表达并促进B细胞淋巴瘤Raji细胞凋亡.     

Bcl-2反义寡核苷酸联合照射对肺癌细胞的抑制作用

[目的]研究Bcl-2反义寡核苷酸联合照射对肺癌细胞的抑制作用。[方法]NCI-H446肺癌细胞株分5组:空白对照、单纯照射组、反义寡核苷酸加照射组、无义序列加照射组、脂质体加照射组。相应组照射10GY后24、48、72小时,MTT法检测各组的细胞增殖抑制率和联合相互作用。[结果]照射组、反义寡核苷酸加照射组、无义序列加照射组、脂质体加照射组均有细胞抑制,并呈时间依赖关系。其中Bcl-2反义寡核苷酸联合照射组抑制率明显高于其它三组(P<0.01),联合作用指数(CDI)=0.86。[结论]Bcl-2反义寡核苷酸促进了照射对NCI-H446肺癌细胞的增殖抑制作用,两者有协同作用。     

白藜芦醇对前列腺癌PC-3细胞Bcl-2和Survivin表达的影响

目的 研究白藜芦醇(Resveratrol,Res)对人前列腺癌PC-3细胞体外生长的抑制作用和对Bcl-2和Survivin蛋白表达的影响.方法 分别用不同浓度的白藜芦醇作用前列腺癌PC-3细胞24 h和48 h,MTT法分别测定细胞抑制率,免疫组化SP法分析100 μmol/L 浓度白藜芦醇作用48 h时 PC-3细胞Bcl-2和Survivin蛋白的表达.结果 不同浓度白藜芦醇作用24 h与48 h时PC-3细胞生长明显受到抑制(P＜0.01);Bcl-2和Survivin蛋白免疫组化染色明显减弱(P＜0.01).结论 白藜芦醇对前列腺癌PC-3细胞体外生长有明显的抑制作用,其机制可能与下调Bcl-2和Survivin蛋白表达,增加前列腺癌PC-3细胞凋亡有关.     

莪术油对人乳腺癌MCF-7细胞凋亡及Bcl-2、Bax表达的影响

目的:观察中药提取物莪术油(zedoray turmeric oil)对人乳腺癌(human breast cancer)细胞系MCF-7的凋亡诱导作用。方法:用不同浓度的莪术油对体外培养的MCF-7细胞进行干预。分别采用MTT、细胞免疫组织化学染色、流式细胞仪检测等方法,观察其对MCF-7细胞增殖的抑制和凋亡诱导作用,并对凋亡相关Bcl-2与Bax蛋白的表达变化进行定性检测。结果:经不同浓度的莪术油处理后的MCF-7细胞,其生长受到明显的抑制,细胞凋亡指数随药物浓度增加而明显增加;莪术油作用后,细胞中Bax蛋白表达明显高于对照组。结论:一定浓度的莪术油能抑制MCF-7细胞增殖,促进其凋亡;其机制可能与调控Bcl-2、Bax表达有关。     

浅蓝菌素在诱导骨肉瘤细胞株U2-OS凋亡过程中对Bcl-2和Bax的影响

目的研究凋亡蛋白Bcl-2、Bax是否参与浅蓝菌素（Cerulenin）诱发骨肉瘤细胞株U2-OS凋亡信号传导。方法采用Western—blotting检测Cerulenin作用前、后骨肉瘤细胞株U2—OS中凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达变化情况,了解不同的Cerulenin剂量和作用时间骨肉瘤细胞株U2-OS中凋亡蛋白Bcl-2和Bax表达变化情况。结果骨肉瘤细胞株U2-OS中Bcl-2和Bax呈阳性表达,Cerulenin作用细胞株后Bcl-2表达量随着浓度增加和作用时间延长而递减,Bax表达量随着浓度增加和作用时间延长而递增。结论Cerulenin可能通过下调Bcl-2的表达和上调Bax的表达而诱导骨肉瘤细胞凋亡。     

RNAi抑制骨肉瘤细胞KDR蛋白表达的研究

目的研究siRNA表达载体对骨肉瘤MG63细胞KDR蛋白表达的抑制作用。方法构建psuper质粒,化学合成2段编码发卡RNA序列、靶向KDR基因的寡核苷酸,克隆进pSuper的pol Ⅲ HI启动子的下游,重组构建抑制KDR表达的siRNA质粒,并转染入骨肉瘤MG63细胞,Western blot检测转染后KDR基因在蛋白水平表达的变化。结果酶切后电泳鉴定正确的重组质粒小量扩增后测序,证实成功构建了KDR siRNA表达质粒,转染入细胞后,有效抑制了KDR基因在蛋白水平的表达。结论成功构建的siRNA表达载体有效抑制了骨肉瘤MG63细胞KDR蛋白的表达,为进一步分析骨肉瘤中KDR基因的功能及肿瘤治疗奠定了研究基础。     

慢性粒细胞白血病患者骨髓细胞中Cox-2与Bcl-2的表达

目的探讨慢性粒细胞白血病（CML）患者骨髓细胞中Cox-2与Bcl-2的表达与意义。方法应用免疫组化SP法检测42例CML患者（CML组）和30例健康体检者（正常对照组）骨髓细胞中Cox-2与Bcl-2的表达。结果CML组患者骨髓细胞中Cox-2与Bcl-2的表达水平和积分明显高于正常对照组（P〈0.05）;骨髓细胞中Cox-2与Bcl-2的表达呈正相关（r=0.675,P〈0.05）。结论Cox-2和Bcl-2可能与CML的发生、发展有一定的关系。     

Skp2-siRNA构建及其对食管癌细胞Eca-109 p27和Bcl-2蛋白表达的影响

目的:研究siRNA抑制Skp2基因在食管癌细胞中表达,探讨Skp2在肿瘤发生过程中的作用。方法:在Skp2基因编码区选择4个RNAi作用位点,体外合成前体DNA链,复性后连入逆转录病毒载体pSUPER-retro(pRS),转染包装细胞PT67,收集含病毒颗粒的培养上清感染食管癌Eca-109细胞,经嘌呤霉素筛选并扩大培养后形成稳定克隆。流式细胞仪检测细胞凋亡情况,RT-PCR和免疫印迹法检测Eca-109细胞内Skp2 mRNA、p27和Bcl-2表达。结果:与正常细胞和空载细胞相比,筛选得到的2个克隆细胞Skp2 mRNA表达水平下降(P<0.01),p27表达增高(P<0.05),Bcl-2表达降低(P<0.05),细胞凋亡增加(P<0.05)。结论:Skp2 siRNA促进食管癌细胞凋亡与p27上调有关。     

慢病毒介导的RNAi对人多发性骨髓瘤DKK1基因表达的抑制作用

目的观察慢病毒表达载体介导的RNA干扰（RNAi）对人骨髓瘤细胞株U266 中dickkopf1（DKK1）的抑制作用,为以DKK1基因为靶点的骨髓瘤骨病（myeloma bone disease,MBD）的基因治疗研究奠定基础。方法把构建好的DKK1 shRNA慢病毒表达载体,与慢病毒包装质粒混合,以L ipofectam ine 2000转染293FT细胞,48h后收取含病毒的上清液、浓缩,并检测病毒效价;RT-PCR和Western blot检测病毒感染多发性骨髓瘤细胞U266细胞后的DKK1表达。结果浓缩后的慢病毒效价为427&#215;105 TU/ml;DKK1shRNA慢病毒感染的U266细胞分别与未感染的U266细胞、无关序列shRNA慢病毒感染U266细胞DKK1表达量比较,统计学均有显著性差异（P〈0.001）。结论慢病毒介导的干扰RNA能有效抑制骨髓瘤细胞U266中DKK1的表达。     

Bcl-2 siRNA增强HepG2细胞对5-氟尿嘧啶敏感性

目的 观察Bcl-2 siRNA对人类肝癌细胞HepG2 5-氟尿嘧啶（5-FU）敏感性的影响。方法 Bcl-2 siRNA表达载体构建并稳定转染至肝癌细胞HepG2中,用G418筛选稳定的阳性细胞克隆。用RT-PCR检测Bcl-2 mRNA水平,免疫荧光检测目的基因Bcl-2蛋白水平的表达。用131、30、1300和13 000 mg/L 5-FU处理稳定转染细胞,用MTT观察细胞对药物敏感性的影响,用流式细胞术观察细胞凋亡情况。Western blot检测Bcl-2和Bax蛋白水平。结果 5-FU处理细胞24 h,Bcl-2 siRNA转染组的细胞生长抑制率明显高于阴性载体转染组和正常细胞;Bcl-2 siRNA转染组细胞凋亡率高于正常细胞和阴性载体转染组;在Bcl-2表达下调时,Bax蛋白表达水平不变。结论 siRNA下调目的基因Bcl-2能增强人类肝癌细胞HepG2对5-FU的敏感性;HepG2细胞对5-FU的敏感性增强与Bax/Bcl-2的比例增高有关。