甲胎蛋白表达缺失的人肝癌HepG2细胞株的构建

目的：建立甲胎蛋白（AFP）表达缺失的HepG2细胞株。方法：选择AFP的RNA干涉靶序列,体外合成两段互补的寡核苷酸,与线性化的pll3．7连接,扩增纯化得到所需质粒。鉴定后将质粒用慢病毒包装、纯化得到病毒粗提液,与HepG2细胞共培养,转染后用RT—PCR和Westernblot实验检测细胞AFP的表达情况。结果：RT-PCR和Westernblot实验显示,干扰后HepG2细胞AFP基因和蛋白的表达显著减少。干扰效率达84％。所得细胞株传代后仍仅能检测到微量AFP表达。结论：成功构建稳定的AFP表达接近缺失的HepG2模型细胞株。     

针对甲胎蛋白的肝癌免疫治疗研究进展

自六十年代发现甲胎蛋白 (α -ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ,ＡＦＰ)与肝癌的高度相关性以来 ,ＡＦＰ作为肝细胞癌的标志已广泛用于肝癌的筛检、诊断、鉴别诊断、疗效评价、提示预后等多方面。近年来 ,随着肿瘤免疫学基础研究的进展 ,人们对ＡＦＰ的免疫治疗价值在原有基础上有了新的认识。1　针对甲胎蛋白进行肝癌免疫治疗的依据1 1　ＡＦＰ的免疫抑制作用肿瘤的发生、发展与机体的免疫功能息息相关。ＡＦＰ对体液免疫、细胞免疫及巨噬细胞功能都有显著的抑制作用。国内外研究表明 :ＡＦＰ能以非细胞毒性方式抑制ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＧ等抗体…     

肝病患者血清诱导人骨髓间充质干细胞表达甲胎蛋白和白蛋白的实验研究

近年研究发现骨髓间充质干细胞（MSCs）具有高度可塑性,在特定环境下除分化为中胚层的组织细胞外,还可跨越胚层界限分化为外胚层及内胚层组织细胞.肝细胞生长因子（HGF）、表皮细胞生长因子（EGF）等有诱导骨髓MSCs向肝细胞分化的作用,为肝脏干细胞提供了一种新来源.本研究采用密度梯度离心、贴壁培养和消化时间控制相结合的方法纯化人骨髓MSCs,并用肝病患者血清诱导培养,探讨肝病患者血清对其分化作用.     

甲胎蛋白异质体在原发性肝癌临床诊断中的应用

目的 通过临床大样本数据回顾性分析血清甲胎蛋白（AFP）和甲胎蛋白异质体（AFP-L3）诊断原发性肝癌（PLC）的价值。方法 2015年1月～2015年12月东方肝胆外科医院诊治的PLC患者7097例,同期诊治的肝硬化（LC）患者122例。采用化学发光法检测血清AFP水平,采用凝集素捕获微量离心柱法检测AFP-L3,将AFP-L3/AFP比值大于10%定义为AFP-L3阳性。结果 7097例PLC患者血清AFP水平为61.7（5.4,1226.0）μg/L,显著高于122例LC患者的3.6（2.5,10.95） μg/L（P<0.05）,AFP-L3阳性率为8.2（-,26.1）%,而在肝硬化患者未检出AFP-L3阳性（P<0.05）;以血清AFP≥20 μg/L或/和AFP-L3≥10%任一阳性为截断点,诊断PLC的准确度为63.1%,优于AFP（60.3%）和AFP-L3（47.9%）单独诊断的结果;AFP-L3阳性率随着AFP水平的升高而升高;血清AFP阴性的PLC和AFP阳性的LC患者AFP-L3阳性率分别为39.6%和7.7%,显著低于血清AFP阳性PLC患者的73.7%（P<0.05）;在2103例具有病理学诊断的PLC患者,1976例肝细胞癌（HCC）患者血清AFP水平为50.8（4.8,1015.0） μg/L,6例混合型肝癌患者血清AFP水平为74.9（4.55,39248.3） μg/L,AFP-L3阳性率分别为5.3（-,24.6）%和8.4（-,18.8）%,均显著高于121例肝内胆管细胞癌患者【2.8（2.2,5.15） μg/L,P<0.05】和【-（-,-）%,P<0.05】。结论 大样本的结果显示PLC患者血清AFP和AFP-L3存在较高的阳性率,其诊断效能较好。     

血清甲胎蛋白异质体在原发性肝癌中的表达及临床病理学意义

目的:探讨原发性肝癌(primary hepatic carcinoma,PHC)患者血清中的甲胎蛋白异质体L3(alpha-fetoprotein variant,AFP-L3)在PHC的表达及临床病理学意义.方法:随机选取62例PHC患者和52例良性肝病(benign liver diseases,BLD)的血清,采用亲和吸附方法与电化学发光方法分别进行总AFP检测和AFP-L3的纯化和检测,并计算AFP-L3的百分含量(AFP-L3检测结果).PHC的病理标本切片用苏木精伊红染色法.然后对AFP-L3检测结果与PHC分化程度和肿瘤直径大小及肿瘤分期进行相关性分析.结果:PHC组血清AFP阳性率为51.51%,BLD组血清AFP阳性率为34.62%;PHC组AFP阳性率与BLD组AFP阳性率相比较,差异无统计学意义(χ2=3.318,P=0.069).PHC组血清AFP-L3阳性率为79.03%,BLD组血清AFP-L3阳性率为15.38%;PHC患者血清AFP-L3阳性率高于BLD组(79.03%vs 15.38%,P0.05).AFP灵敏度为51.61%,特异度为65.39%;AFP-L3灵敏度为79.03%,特异度为84.62%;AFP的Youden指数(Youden index,YI)为17%,AFP-L3的YI为63.65%.AFP、AFP-L3联合检测的灵敏度为88.70%,特异度为86.32%.PHC患者血清AFP-L3百分含量高于BLD组(13.35%vs 2.05%,P0.05),P H C患者血清A F P-L3阳性率高于BLD组(79.03%vs 15.38%,P0.05).PHC患者血清AFP-L3百分含量、AFP-L3阳性率与癌灶大小、肿瘤分期呈正相关(P0.05).与肿瘤分化程度不相关.以上各组阳性率比较差异均无统计学意义.结论:AFP-L3的测定对于判断PHC的肿瘤病理学特性具有一定的临床意义.     

肝癌组织甲胎蛋白表达特点及其基因片段的扩增分析

目的探讨肝癌组织甲胎蛋白(AFP)表达的病理学特点及其基因分析的临床价值。方法以免疫组织化学法研究AFP在肝癌及癌周组织中的胞内分布及其表达;并从肝癌的癌灶、癌旁组织中制备总RNA,以巢式聚合酶链反应(nested_PCR)扩增不同癌组织AFP_mRNA片段,以探讨AFP表达的临床病理学特征及其AFP_mRNA分析的应用价值。结果肝癌细胞及癌旁肝细胞的胞浆中,均可见AFP阳性的棕黄色颗粒,癌组织中AFP阳性表达率为73.3%,癌旁组织中为40.0%,中、低分化组肝癌中AFP的表达阳性率明显高于高分化组肝癌(P<0.05),且癌旁组织中AFP的表达强度明显低于肝癌的癌灶组织。肝癌组织、癌周组织的总RNA表达水平存在差别,癌组织中AFP_mRNA片段扩增全数阳性(100%),显著高于癌周组织(P<0.01)。结论肝癌不同组织中AFP表达存在差异,AFP_mRNA分析有助于肝癌的早期发现和诊断。     

甲胎蛋白诊断原发性肝癌的最佳阈值探讨

目的评价血清甲胎蛋白(AFP)诊断原发性肝癌(PHC)的最佳阈值。方法回顾性分析新疆维吾尔自治区石河子地区汉族人群中200例PHC、83例肝硬化、53例乙型肝炎及89例其他非肝脏疾病患者血清AFP水平,采用多种指标评价5.6～500 IU/mL(共10个浓度)AFP阈值对PHC的诊断价值。结果 AFP阳性诊断阈值100IU/mL时诊断敏感度为50.5%、特异度为92.4%,两者之和最大,为1.429;诊断准确度最高,为72.7%;受试者工作曲线(ROC)下面积为0.701,坐标点对应于曲线左上角位置。AFP>400 IU/mL时,其诊断敏感度较低(39.5%),具有较高的阳性似然比(14.63)和较高的诊断优势比(23.83),坐标点对应于曲线右上角位置。结论在新疆石河子地区,100 IU/mL是诊断PHC的AFP最佳阈值。     

ABCG2在肝细胞性肝癌组织和肝癌细胞株中的表达及意义

目的: 探讨干细胞标志物ABCG2在肝细胞性肝癌组织和肝癌细胞株中表达的意义.方法: 应用免疫组化SP方法检测ABCG2在30例肝细胞性肝癌组织和8例癌旁肝硬化组织中的表达、分布, 并采用细胞免疫荧光技术检测ABCG2在两种肝癌细胞株HepG2、PLC/PRF/5中的表达, 采用流式细胞技术测试出两种细胞株中ABCG2阳性细胞的比例.结果: 免疫组化中, ABCG2阳性染色定位于癌细胞胞膜, 部分病例胞质也有分布. 免疫组化显示ABCG2在肝细胞性肝癌组织和癌旁肝硬化组织中的表达阳性率分别为63.33%(19/30)和25%(2/8). ABCG2蛋白在HepG2、PLC/PRF/5这两个肝癌细胞株中均有表达, HepG2中, ABCG2阳性染色定位于细胞胞质中, 而在PLC/PRF/5中, ABCG2阳性染色定位于细胞胞质和细胞膜上. PLC/PRF/5细胞株中, 通过流式细胞仪能检测出表达ABCG2的细胞( P<0.05), 而在HepG2细胞株中, 通过流式细胞仪不能检测出表达ABCG2的细胞.结论: ABCG2在肝细胞性肝癌的发生发展过程中可能起着非常重要的作用, 有可能成为临床治疗肝细胞性肝癌的分子靶标.     

侧群细胞与肝癌干细胞

肝癌是严重威胁人类生命和健康的一种疾病.其病因和发病机制尚不完全清楚,治疗缺少有效靶点.对肝癌恶性生长、转移及复发机制的研究正在逐渐深入.近年来的研究认为,肿瘤中存在一小群具有自我更新和分化潜能的细胞,即肿瘤干细胞,可能是肿瘤转移和复发的根源.肝癌中应同样存在这样的一群细胞.侧群(side population,SP)细胞是肿瘤细胞中一小部分,具备干细胞的多种特性且易于分离.肝癌组织中SP细胞的鉴定和分离有可能找到肝癌干细胞,有助于肝癌的转移和复发机制的研究,并为肝癌治疗提供有效治疗靶点.     

肝癌干细胞与肝癌细胞表面分子标记物的鉴别

目的探讨肝癌干细胞与普通肝癌细胞表面分子标记物的差别。方法采用免疫组织化学方法在HepG2、Hep-11、Hep-12细胞株中对CD34、CD56、CD117、CD133、Nanog、OCT4的表达进行观察。结果 CD34、CD117、CD133在Hep-12细胞中表达的阳性率最高,在Hep-11中表达的阳性率下降或为阴性,而在HepG2细胞中均为阴性;CD56在Hep-12及Hep-11细胞中表达强度相当,在HepG2中为阴性;Nanog及OCT4在3种细胞株中均表达阴性。结论 CD34、CD117、CD133可能在鉴别肝癌干细胞与肝癌细胞的表面分子标记物方面具有重要意义。     

苯乙酸钠对小鼠腹腔内种植肝癌细胞株凋亡的作用

目的 探讨苯乙酸钠(NaPA)对小鼠体内种植性肿瘤生长的影响,以及对肿瘤细胞凋亡和细胞周期的作用,寻找新的有效的肿瘤治疗药物.方法 制作小鼠体内种植性肿瘤模型,NaPA腹腔内注射10 d后运用流式细胞技术检测肿瘤组织细胞凋亡及细胞周期的变化情况,并检测NaPA对荷瘤小鼠的抑瘤作用和毒副作用.结果 随着NaPA浓度的增加,对荷瘤小鼠的抑瘤作用加强,肿瘤细胞凋亡率呈正比例增加.NaPA主要抑制细胞的G1期,且与浓度相关.NaPA各组肿瘤细胞增殖指数下降,细胞生长受阻于G0/G1期,细胞趋于成熟.且没有检测到药物对荷瘤鼠正常组织的毒副作用.结论 NaPA可以抑制肿瘤生长,使肿瘤细胞产生凋亡,诱导细胞向成熟转化;并且无毒副作用,有望成为新的肿瘤治疗药物.     

The promoting molecular mechanism of alpha-fetoprotein on the growth of human hepatoma Bel7402 cell line

AIM：The goal of this study was to characterize the AFP receptor,its possible signal transduction pathway and its proliferative functions in human hepatoma cell line Bel 7402.METHODS:Cell proliferation enhanced by AFP was detected by MTT assay,^3H-thymidine incorporation and S-stage percentage of cell cycle analysis .With radioactive labeled 125 I-AFP for receptor binding assay;cAMP accumulation,Protein kinase A activity were detected by radioactive immunosorbent assay and the change of intracellular free calcium([Ca^2+]i) was monitored by scanning fluorescence intensity under TCS-NT confocal microscope.The expression of oncogenes N-ras,p53,and P21 ras in the cultured cells in vitro were detected by Northern blotting and Western blotting respectively.RESULTS:It was demonstrated that AFP enhanced the proliferation of human hepatoma Bel 7402 cell in a dose dependent fashion as shown in MTT assay,^3H-thymidine incorporation and S-phase percentage up to 2-fold.Two subtypes of AFP receptor were identified in the cells with Kds of 1.3&#215;10^-9 mol.L^-1 and 9.9&#215;10^-8molL^-1 respectively.Pretreatment of cells with AFP resulted in a significant increase (625%)in cAMP accumulation ,The activity of protein kinase A activity were increased up to 37.5,122.6,73.7and 61.2%,at treatment time point 2,6,12and 24hours.THe level of intracellular calcium were elevated after the treatment of aplha-fetoprotein and achieved to 204% at 4 min The results also showed that AFP(20mg.L^-1),could upregulate the expression of N-ras oncogenes and p53 and p21^ras in Bel 7402 cells,Inthe later case,the alteration were 81.1%(12h)and 97.3%(12h)respectively compared with control.CONCLUSION:These results demonstrate that AFP is a potential growth factor to promote the proliferation of human hepatoma Bel 7402 cells,Its growth-regulatory effects are mdeiated by its specific plasma membrane receptors coupled with its transmembrane signaling transduction through the pathway of cAMP-PKA and intracellular calcium to regulate the expression of oncogenes.     

Sphere-forming cell subpopulations with cancer stem cell properties in human hepatoma cell lines

Background

Cancer stem cells (CSCs) are regarded as the cause of tumor formation and recurrence. The isolation and identification of CSCs could help to develop novel therapeutic strategies specifically targeting CSCs.

Methods

Human hepatoma cell lines were plated in stem cell conditioned culture system allowed for sphere forming. To evaluate the stemness characteristics of spheres, the self-renewal, proliferation, chemoresistance, tumorigenicity of the PLC/PRF/5 sphere-forming cells, and the expression levels of stem cell related proteins in the PLC/PRF/5 sphere-forming cells were assessed, comparing with the parental cells. The stem cell RT-PCR array was performed to further explore the biological properties of liver CSCs.

Results

The PLC/PRF/5, MHCC97H and HepG2 cells could form clonal nonadherent 3-D spheres and be serially passaged. The PLC/PRF/5 sphere-forming cells possessed a key criteria that define CSCs: persistent self-renewal, extensive proliferation, drug resistance, overexpression of liver CSCs related proteins (Oct3/4, OV6, EpCAM, CD133 and CD44). Even 500 sphere-forming cells were able to form tumors in NOD/SCID mice, and the tumor initiating capability was not decreased when spheres were passaged. Besides, downstream proteins DTX1 and Ep300 of the CSL (CBF1 in humans, Suppressor of hairless in Drosophila and LAG1 in C. elegans) -independent Notch signaling pathway were highly expressed in the spheres, and a gamma-secretase inhibitor MRK003 could significantly inhibit the sphere formation ability.

Conclusions

Nonadherent tumor spheres from hepatoma cell lines cultured in stem cell conditioned medium possess liver CSC properties, and the CSL-independent Notch signaling pathway may play a role in liver CSCs.     

阿霉素干预与肾上腺皮质癌干细胞标志物的表达

目的 探讨阿霉素(ADM)干预下人肾上腺皮质癌裸鼠模型干细胞标志CD133、ABCG2的表达及意义.方法 SW-13细胞系建立裸鼠皮下移植瘤模型,ADM体内干预后原代培养获得ADM组细胞株,未予干预直接原代培养获得对照组细胞株.用单细胞成克隆技术检测细胞的增殖能力,免疫组化法和流式细胞法检测肿瘤干细胞标志物CD133、ABCG2的表达.结果 ADM组细胞株的克隆形成率高于对照组(P＜0.05);流式细胞法和免疫组化法提示ABCG2在两组细胞中均有阳性表达,ADM组细胞株的流式细胞表达率高于对照组细胞株(P＜0.05);以上两种方法均表明CD133在两组中阴性表达.结论 ADM组细胞具有一定的肿瘤干细胞特征,ABCG2参与肾上腺皮质癌细胞耐药机制,可能为分子靶向治疗的潜在靶点.     

凋亡素基因质粒载体对人肝癌细胞的影响

目的探讨凋亡素基因表达对人肝癌细胞的影响。方法将凋亡素基因克隆入真核表达载体pEGFP-C2,构建成pEGFP-VP3 为了使EGFP和EGFP-VP3在人肝癌细胞中表达,用非脂质体脂质转染法将pEGFP-C2和pEGFP-VP3分别转染人类肝癌细胞系(HepG2),通过荧光显微镜观察EGFP和EGFP-VP3在HepG2中的定位、表达、细胞生长及凋亡,用Annexin V-藻红素(PE)检测细胞凋亡。结果在HepG2/EGFP组细胞中,EGFP均匀分布于细胞浆和细胞核,细胞形态无变化。与非转染细胞的自然凋亡相比,转染细胞中细胞凋亡没有增加。在HepG2/EGFP-VP3组细胞中,EGFP-VP3以荧光颗粒形式集中在细胞核,细胞核中EGFP-VP3颗粒逐渐变粗,细胞变得小而圆,最后成为碎片,Annexin V-PE染色显示细胞凋亡;HepG2/EGFP-VP3组的细胞凋亡率明显高于HepG2/EGFP组和HepG2组(P<0.01)。结论 pEGFP-VP3转染人肝癌细胞后,凋亡素基因表达并导致癌细胞凋亡。     

组织蛋白酶-S在肝癌细胞中的表达及意义

目的研究组织蛋白酶-S（Cat-S）在肝癌细胞和正常肝细胞中的表达情况,探讨其与肝细胞癌（HCC）发生、发展的关系。方法体外培养高转移人肝癌细胞株MHCC97-H、低转移人肝癌细胞MHCC97-L和正常肝细胞LO2,采用荧光定量PCR技术定量检测其Cat-S mRNA表达水平。结果 Cat-S mRNA在LO2细胞中呈弱表达,MH-CC97-H细胞及MHCC97-L细胞表达均明显高于LO2细胞（P〈0.05）;MHCC97-H细胞表达明显高于MHCC97-L细胞（P〈0.05）。结论 Cat-S在高转移、低转移肝癌细胞株和正常肝细胞株中的表达存在差异性,此可能与肝癌的发生发展有关;Cat-S可作为肝癌诊治的分子靶标。