可生物素化H-2K^d-BSP融合蛋白的原核表达和纯化

目的构建町生物素化的H-2K^d-BSP融合基因的表达载体，原核表达H-2K^d-BSP融合蛋白，以制备H-2K^d-肽四聚体。方法采用RT—PCR技术从小鼠SP2／0细胞中克隆小鼠MHC-Ⅰ类分子H-2K^d基因的胞外区，拼接上依赖BirA酶的可生物素化序列（BSP）后，插入pET-22b高效表达载体多克隆位点，诱导表达后对表达产物进行纯化，用Western印迹法分析鉴定纯化融合蛋白。结果成功构建pET-H-2K^d-原核表达载体，测序证实H-2K^d-BSP融合基因序列正确。pET—H-2K^d原核表达载体可在大肠枰菌BL21中高效诱导表达H-2K^d-BSP融合蛋白，表达量占菌体总蛋白的36％，主要以包涵体形式表达；经反复洗涤纯化，纯化蛋白纯度可达90％以上。纯化蛋白可被H-2K^d分子特异性单克隆抗体SF1—1．1所识别。结论可生物素化H-2K^d-BSP融合蛋白的原核表达和纯化为进一步制备H-2K^d-肽四聚体奠定了实验基础。     

HLA-A*0201-BSP融合基因的构建与原核表达

克隆表达可生物素化的HLA-A＊0201的重链胞外区是制备HLA-A＊0201-肽四聚体的先决条件。本研究构建重组HLA-A＊0201-BSP融合基因的表达载体，以制备HLA—A2四聚体。根据已报道的序列设计特异引物，利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法从已鉴定为HLA—A＊0201基因型的健康人白细胞中克隆HLA—A＊0201重链胞外区的基因．拼接上依赖生物素-蛋白连接酶（biotin-protein ligase，BirA）的可生物素化序列（BirA substrate peptide．BSP），构建HLA—A＊0201-BSP的原核表达载体，在大肠杆菌DH50t中进行表达。结果表明：成功扩增出HLA—A＊0201-BSP融合基因并测序证实，构建的pBV220-HLA—A＊0201-BSP可在大肠杆菌DH50t中高效表达HLA—A＊0201-BSP融合蛋白．表达量占菌体总蛋白的28％，以包涵体的形式表达，经洗涤、变性后，以Sepharcyl S-300HR（S-300）柱层析纯化，纯度可达90％以上。结论：获得了高效表达HLA—A＊0201-BSP的大肠杆菌工程菌株，建立了简便有效的包涵体纯化方法，为制备HLA-A＊0201-肽四聚体奠定了基础。     

人β2-微球蛋白基因的克隆与原核中的表达

本研究获取主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ类分子的轻链部分,即β2-微球蛋白（β2m）以制备MHC Ⅰ类分子-肽四聚体.根据已报道的序列设计特异引物,利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法从人白细胞中克隆β2m的基因,并构建β2m的原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达.结果显示：构建的编码成熟β2m的pET-β2m可在大肠杆菌BL21（DE3）中高效表达β2m,表达量占菌体总蛋白的32%,β2m以包涵体的形式表达,经洗涤、变性后,以Sephacryl S-200HR（S-200）柱层析纯化,纯度可达95%以上,纯化产物采用稀释法复性.Western blot分析表明,该蛋白具有与抗人天然β2m抗体反应的特性.结论：获得了高效表达人β2m的大肠杆菌工程菌株,建立了简便有效的β2m包涵体纯化、复性方法,为制备MHC Ⅰ类分子-肽四聚体奠定了基础.     

小鼠Foxp3融合蛋白的原核表达及纯化

目的克隆小鼠Foxp3(MFoxp3)基因,构建含该基因的原核表达载体,并表达、纯化出小鼠的Foxp3融合蛋白。方法RT-PCR方法从小鼠淋巴细胞扩增出小鼠Foxp3基因,连入T Easy Vector进行测序,然后将序列正确的小鼠Foxp3基因用酶切的方法从T Easy vector切下,并将其连接到用相同酶切,含有硫氧还蛋白(含6个组氨酸“标签”)的pET 32a( )原核表达载体中构建pET 32a( )-MFoxp3表达载体。用IPTG诱导转化pET 32a( )-MFoxp3表达载体的大肠杆菌BL21(DE3),并以镍螯合层析法纯化MFoxp3融合蛋白。结果经RT-PCR成功地克隆了1,290 bp的小鼠Foxp3基因,测序正确后转化大肠杆菌原核表达载体pET 32a( ),重组质粒在BL21(DE3)中成功表达出分子质量约为63 kD的融合蛋白,运用Ni-NTA方法纯化出目的蛋白,纯化后的蛋白纯度达80%,并用Western Blotting检测蛋白的灵敏度和特异性。结论构建了小鼠Foxp3的融合蛋白原核表达载体并成功表达与纯化出小鼠Foxp3的融合蛋白。     

原核表达载体pGEX-4T-1/Snapin的构建和表达鉴定

目的构建pGEX-4T-1/Snapin原核表达载体并在大肠埃希菌中高效表达,以纯化得到Snapin/GST融合蛋白。方法用RT-PCR从小鼠血小板RNA中扩增Snapin基因。将目的片段装入原核表达载体pGEX-4T-1并转化至大肠埃希菌E.coli DH5α中,经过IPTG诱导,SDS-PAGE及凝胶扫描分析目的蛋白的表达水平。结果成功获得小鼠Snapin基因并构建得到重组表达质粒pGEX-4T-1/Snapin。筛选获得pGEX-4T-1/Snapin/E.coli DH5α重组转化菌株,诱导表达得到融合蛋白Snapin/GST。结论成功构建小鼠Snapin原核表达载体,并在E.coli DH5α中高效表达融合蛋白Snapin/GST,为深入研究Snapin蛋白的生物学结构和功能奠定基础。     

GRIM-19及其截断体原核表达载体的构建及表达与纯化

目的构建GRIM-19及其截断体原核表达载体,在大肠杆菌中诱导表达并纯化融合蛋白。方法用RT-PCR法从HeLa细胞中扩增出带BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点的GRIM-19及其截断体基因片段,将GRIM-19及其截断体基因片段克隆到pGEX-4T-3原核表达载体上,在大肠杆菌中诱导表达GST-GRIM-19及其截断体融合蛋白,用Glutathione Sepharose 4B纯化,纯化后蛋白经Western-blot鉴定。结果 pGEX-4T-3-GRIM-19及其截断体原核表达载体构建正确,并在大肠杆菌中成功诱导表达,IPTG诱导以浓度0.5mM,时间2h为宜,且通过Glutathione Sepharose4B成功纯化到融合蛋白。结论成功构建GRIM-19及其截断体原核表达载体,诱导表达并纯化GST-GRIM-19及其截断体融合蛋白。     

人心肌肌钙蛋白I基因的原核表达及抗体制备

目的进行人心肌肌钙蛋白I（cardiac troponinI，cTnI）基因原核表达载体的构建，获得高纯度的心肌肌钙蛋白I并制备相应的多克隆抗体。方法利用RT—PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白I的cDNA片段，将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21（DE3）中，经IPTG诱导，表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白，Ni—NTA树脂纯化，纯化后的融合蛋白免疫小鼠，制备抗血清。通过ELISA，Western blot鉴定血清效价和特异性。结果成功构建了cTnI的原核表达载体，并在大肠埃希菌中荻得了高效表达。Western blot检测证实获得了抗cTnI抗体。结论成功表达了cTnI蛋白并制备了其特异性抗体。     

人EGFR胞外段原核表达及免疫原性研究

目的：研究人EGFR胞外段在原核本质的表达，纯化条件以及对小鼠的免疫原性。方法：以既往构建包含人EGFR胞外段基因的表达质粒为基础，采用基因工程方法构建pET原核表达载体。在大肠杆菌中表达目的蛋白，表达蛋白在变性条件下，通过Ni^2 柱亲和层析纯化以包涵体形式存在的His-Tag融合蛋白，SDS－PAGE检测其纯度。去余His-Tag的纯化蛋白在梯度尿素中透析复性。以复性蛋白免疫小鼠获得抗血清，western blotting及流式细胞仪器检测特异抗体的存在。结论：通过限制酶切分析及测序鉴定表明获得了人EGFR胞外段基因的pET原核表达载体，SDS－PAGE分析表明在IPTG诱导下可以表达90Kd目的蛋白其纯度大于95％，所产生抗体可以识别复性蛋白及表达于A549细胞上的EGFR。提示在大肠杆菌中表达的人EGFR胞外段重组蛋白具有免疫原性，可以进一步用于EGFR免疫研究。     

人心肌肌钙蛋白Ⅰ基因的原核表达及抗体制备

目的 进行人心肌肌钙蛋白I(cardiac troponin I,cTnI)基因原核表达裁体的构建,获得高纯度的心肌肌钙蛋白I并制备相应的多克隆抗体.方法 利用RT-PCR方法从人心肌细胞的总RNA中克隆出编码人心肌肌钙蛋白I的cDNA片段,将其插入原核表达载体形成重组体并导入宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,表达出带6个组氨酸标签的融合蛋白,Ni-NTA树脂纯化,纯化后的融合蛋白免疫小鼠,制备抗血清.通过ELISA,Western blot鉴定血清效价和特异性.结果 成功构建了cTnI的原核表达载体,并在大肠埃希菌中获得了高效表达.Western blot检测证实获得了抗cTnI抗体.结论 成功表达了cTnI蛋白并制备了其特异性抗体.     

去乙酰化酶SIRT5的原核表达及多克隆抗体的制备

目的克隆小鼠的Sirt5基因,及制备SIRT5多克隆抗体。方法提取小鼠肝细胞总RNA进行RT-PCR,PCR法扩增Sirt5基因,将此基因克隆至pET-28a载体,转化E.coli BL21（DE3）,经异丙-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）诱导表达后,利用Ni 2＋-NTA亲和层析柱纯化;纯化的目的蛋白免疫Bal/c小鼠后,收获血清并鉴定。结果成功构建了Sirt5原核表达载体,并能在宿主菌E.coli BL21（DE3）中高效表达;利用纯化的蛋白制备了理想的多克隆抗体。结论利用分子克隆技术,获得了高纯度的SIRT5蛋白并制备了多克隆抗体,为进一步研究奠定了基础。     

结核分枝杆菌rdESAT-6抗原在耻垢分枝杆菌中的制备及其血清学诊断研究

目的构建结核分枝杆菌(MTB)融合基因2×esat-6原核表达载体,利用耻垢分枝杆菌诱导表达、纯化早期分泌抗原ESAT-6重组二聚体(rdESAT-6),Western blot分析其抗原性,并评估其在结核病患者中的血清学诊断价值。方法以DNA疫苗HG856A2为模板扩增2×esat-6基因,构建pMF41-2×esat-6原核表达载体,电转化耻垢分枝杆菌,诱导表达rdESAT-6蛋白,Western blot分析其抗原性。收集126例确诊的结核病患者和42名健康体检者的血清,用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)和结核斑点金免疫渗滤试验(TB-DOT)检测血清结核抗体,评估rdESAT-6在结核血清学诊断中的价值。结果成功构建了pMF41-2×esat-6重组质粒,以包涵体形式表达了rdESAT-6蛋白,纯化的蛋白纯度在95%以上,可与小鼠抗ESAT-6血清发生特异性反应。126例结核病患者血清检测结果表明,rdESAT-6蛋白在MTB阳性组和阴性组患者血清学诊断的敏感性分别为79.75%(63/79)、61.70%(29/47),好于TB-DOT的62.03%(49/79)、44.68%(21/47)(P0.05)。2种方法对42名健康体检者血清诊断特异性均为95.24%(40/42)。结论 MTB的融合蛋白rdESAT-6用于结核病血清学检测具有较好的敏感性和特异性,可作为结核病血清学诊断的优选抗原。     

小鼠OC-STAMP蛋白表达、纯化、抗体制备及鉴定

目的 OC-STAMP蛋白是一种功能尚不明确的六次跨膜蛋白,通过制备多克隆抗体来为进一步研究其功能奠定基础.方法 采用PCR技术扩增出目的基因,将其克隆到pGEX-4T-1原核表达载体中.经IPTG诱导后,重组质粒pGEX-4T-1/OC-STAMP表达含重组谷胱甘肽转移酶（GST）的融合蛋白GST-OC-STAMP.GST-OC-STAMP融合蛋白经纯化后免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体.此后应用ELISA及Western blot方法鉴定该抗体.结果 pGEX-4T-1/OC-STAMP重组质粒构建成功,并通过原核表达获得达到免疫要求的融合蛋白.免疫所得抗体血清经间接ELISA法、Western blot检测,确定获得了高效价的小鼠OC-STAMP多克隆抗体.结论 成功制备了小鼠OC-STAMP抗体,为进一步研究基因功能奠定了基础.     

HMGB1A盒与LBPK95A融合基因的构建和原核表达

目的克隆、表达高迁移率族蛋白1A盒（HMGB1 A box）与LBPK95A的融合基因。方法经加端-PCR获得HMGB1A盒与LBPK95A的融合基因。该基因克隆到pGEX-4T-2载体中转化TOP10感受态细胞，测序鉴定。将A—LBP质粒转化E．coli BL21，30℃诱导表达4h，超声裂解后经GSTrapFF蛋白纯化柱纯化，进行SDS—PAGE分析。结果DNA测序证明，获得了HMGB1A盒与LBPK95A的融合基因。SDS—PAGE分析表明，A—LBP融合蛋白在原核中获得高效表达，表达量约占菌体总蛋白的28％，GSTrapFF纯化后获得目的蛋白。结论成功表达和纯化了HMGB1A盒与LBPK95A的融合蛋白。     

白念珠菌CDRl和CDR2多克隆抗体制备及鉴定

目的：制备特异性白念珠菌外排泵（CaCDRl和CaCDR2）的多克隆抗体,为研究CaCDRl和CaCDR2在介导白念珠菌耐药中的作用奠定基础。方法：利用Pfam网络预测程序和Blastn、Blastx程序设计引物．采用PCR法获得白念珠菌SC5314基因组上486bp长度的CDRl和CDR2目的基因,并将其克隆入pET-28a（＋）质粒,构建重组表达质粒后,转化人大肠埃希菌BL21宿主菌内,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下表达6xHis融合蛋白;经镍柱纯化蛋白后,免疫新西兰兔,制备兔抗多克隆抗体。用ELISA及蛋白印迹法检测该抗体的效价和特异性。结果：ELISA法检测所制备抗体的效价最终定为1：12800,工作浓度定为1：800;蛋白印迹法检测结果显示,抗体能与CaCDRl及CaCDR2蛋白特异性结合。结论：成功获得具有较高效价和良好特异性的CaCDRl、CaCDR2多克隆抗体．可用于白念珠菌CaCDRl、CaCDR2蛋白水平的鉴定。     

梅毒螺旋体TpN15-47融合基因原核表达系统的构建

目的构建梅毒螺旋体TpN15-47融合基因及其原核表达系统。方法分别克隆TpN15和TpN47基因,利用T4连接酶构建TpN15-47融合基因,常规方法构建其原核表达系统。采用SDS-PAGE检测目的重组蛋白TpN15-47表达情况。结果连接的TpN15-47基因测序分析表明,插入的基因片段为TpN15-47融合基因,与GenBank报道相同。目的重组蛋白TpN15-47表达产量约为细菌总蛋白85.79%,主要以包涵体形式存在。结论所构建的原核表达系统能高效地表达TpN15-47融合蛋白,为后期梅毒螺旋体基因疫苗和临床检测试剂盒的研制奠定了基础。     

Quantitative variations in the expression of H-2 antigens on murine leukemia virus-induced tumor cells can affect the H-2 restriction patterns of tumor-specific cytolytic T lymphocytes

Comparative quantitative experiments were designed to study the expression of H-2Kd and H-2Dd antigens on three different leukemia cell lines induced by Gross murine leukemia virus (MuLV)in BALB/c (H-2d) mice. The H-2 restriction patterns of syngeneic cytolytic T lymphocytes (CTL) directed against Gross MuLV-induced tumors were correlated with these quantitations of H-2Kd and H-2Dd antigens, Our results obtained by quantitative absorption of monospecific antisera indicated that the three BALB/c tumor cell lines expressed different amounts of H-2Kd and H-2Dd antigens, with H-2Dd antigen showing the greatest variability in expression because it ranged from barely detectable levels to one- eighth the amount of H-2Dd antigen expressed on normal BALB/c spleen cells. The H-2 restriction patterns of Gross MuLV-specific CTL were directly affected by these quantitative modulations in the expression of H-2Kd and H-2Dd antigens, as revealed by three independent approaches: (a) inhibition of CTL activity by monospecific anti-H-2 sera in the absence of complement; (b)competitive inhibition of CTL- mediated cytotoxicity by the addition of excess tumor cells into the reaction mixture; and (c) analysis of CTL specificities using cloned CTL populations. Our results thus indicate that H-2 restriction of tumor-specific CTL activity can be directed at the target cell level by variations in the expression of H-2 antigens.     

人巨细胞病毒pp150-gp52蛋白原核可溶性表达与IgM捕获ELISA方法建立和应用

目的原核系统内表达并纯化巨细胞病毒pp150-gp52融合蛋白优势抗原表位,建立IgM捕获ELISA方法并应用。方法通过重叠PCR技术扩增获得巨细胞病毒pp150-gp52优势片段核酸序列,在原核系统内可溶性表达DsbC-pp150-gp52融合蛋白并纯化,用Western blot和ELISA检测融合蛋白的特异性和应用价值。结果纯化获得的融合蛋白DsbC-pp150-gp52经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测60份临床阳性血清和60份健康人血清。其中以酶标记DsbC-pp150-gp52蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率96.7% ,阴性检出率100%,初步验证DsbC-pp150-gp52融合肽具有非常好的抗原特异性。结论融合蛋白DsbC-pp150-gp52在大肠埃希菌中以可溶性表达形式存在,获得的高纯度重组融合蛋白具有抗原性和特异性强的特点,采用IgM捕获ELISA的实验方法,可开发检测试剂盒用于风疹病毒的早期检测。     

HBOV病毒VP1蛋白的重组表达及在感染检测中的应用

[目的]建立检测HBOV感染的免疫学检测方法和进行儿童人群中感染调查。[方法]采用PCR扩增克隆HBOV病毒VP1核衣壳蛋白部分基因，将其基因克隆至PET32a，构建原核表达重组质粒，在大肠杆菌中以包涵体形式获得表达。诱导表达后采用凝胶电泳切胶纯化目的蛋白。用重组蛋白作包被抗原建立了间接酶联免疫检测方法。[结果]病人血清及献血员血清均以1：50稀释。经检测北京和深圳的85份标本，阳性6人，阳性率7．06％，而正常献血员150人均为阴性，人群中感染率较低。[结论]成功重组表达了VP1蛋白，建立了检测抗体的ELISA方法。国内存在该病毒感染，被调查的人群中HBOV感染率较低。