镉与汞联合作用对人胚肝细胞凋亡和DNA损伤的影响

目的 研究镉与汞单独及联合染毒对人胚肝细胞(L02细胞)凋亡及DNA损伤的作用.方法 以0.01～100μmol/L的氯化镉、氯化汞以及等浓度的氯化镉、氯化汞混合液对L02细胞染毒24 h,采用MTT法测定细胞的存活率,根据Finney法判断镉与汞对L02细胞的联合作用类型;采用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)和流式细胞术(FCM)检测L02细胞的DNA损伤和细胞凋亡情况.结果 0.01 μmol/L的氯化镉、氯化汞单独及联合染毒可以刺激细胞的生长,但≥1μmol/L的氯化镉、氯化汞单独及联合染毒可显著抑制细胞的生长;且联合作用表现为相加作用.镉、汞单独及联合作用可致L02细胞的DNA损伤率和细胞凋亡率均显著高于对照组;且随着染毒浓度的升高,L02细胞的DNA损伤率和细胞凋亡率均呈上升趋势.结论 镉汞联合染毒引起的DNA损伤和细胞凋亡可能存在一定的协同效应,这可能是由于镉、汞诱导细胞发生氧化应激所致.     

p38MAPK和ERK1／2对镉诱导NRK肾细胞c-myc与c-fos基因mRNA表达的影响

目的研究p38丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和细胞外信号调节激酶（ERK）1／2抑制剂对镉染毒NRK肾细胞后原癌基因c—myc与c—fos表达的影响。方法用不同剂量CdCl2（0、2．5、5．0、10．0μmol／L）染毒大鼠NRK细胞12h,p38MAPK抑制剂SB20358010．0μmol／L和ERK1／2抑制剂PD9805910μmol／L预处理NRK细胞0．5h后,再加入10．0μmol／LCdCl2染毒细胞,用流式细胞技术检测细胞凋亡率,SYBRGreenI荧光定量PCR检测c-rnyc与c-fosmRNA表达。结果流式细胞仪检测NRK细胞染镉后细胞凋亡率随染毒剂量增加而增加;p38MAPK抑制剂SB203580＋10．0μmol／LCdCl2组与单独染镉组比较,细胞凋亡率显著下降;但ERK1／2抑制剂PD98058＋10．0μmol／LCdCl2组与单独染镉组比较,细胞凋亡率显著升高。实时荧光定量PCR检测NRK细胞染镉后c—myc和c—fosmRNA表达明显增强;单独用SB203580和PD98058刺激NRK细胞后c-myc和c—fosmRNA表达与对照组比较,差异无统计学意义,但SB203580和PD98058预处理NRK细胞0.5b后加入10．0μmol／LCdCl2与单纯10．0μmol／L染镉组比较,c—myc和c-fosmRNA表达显著降低。结论MAPK信号转导通路可能在镉诱导原癌基因c—myc和c—fos表达中发挥作用。     

氯化镉对大鼠原代星形胶质细胞凋亡的影响

目的研究氯化镉对星形胶质细胞凋亡的影响。方法取处于对数生长期的细胞,以终浓度为0(对照)、2.5、5、10、20、40μmol/L氯化镉溶液染毒12、24 h,采用MTT实验测定细胞的存活率;以终浓度为0(对照)、2.5、5、10、20μmol/L氯化镉溶液染毒12 h,采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术测定细胞的凋亡率。结果与对照组相比,5~40μmol/L氯化镉染毒12、24 h时大鼠星形胶质细胞的存活率均较低,5~20μmol/L氯化镉染毒12 h时大鼠星形胶质细胞的凋亡率均较高,差异均有统计学意义(P0.05);且随着氯化镉染毒浓度的升高,大鼠星形胶质细胞的存活率呈下降趋势,而凋亡率呈上升趋势。结论氯化镉对星形胶质细胞具有明显的毒性作用,可诱导星形胶质细胞凋亡。     

氯化镉对大鼠肾纤维细胞Bcl-2、Bax基因表达影响实验研究

目的 采取离体细胞培养的方法观察氯化镉在不同时间、不同浓度作用下抑制正常大鼠肾纤维(NRK)细胞生长,及对Bcl-2、Bax基因的表达的影响.方法 实验中选择5、10、20、40、60 μmol/L氯化镉对NRK细胞染毒24 h,及20 μmol/L氯化镉对NRK细胞染毒0.5、2、6、12、24 h,流式细胞仪观察细胞凋亡率,选择5、10、20、40、60 μmol/L不同浓度的氯化镉离体培养NRK细胞12 h,及20 μmol/L氯化镉分别离体培养NRK细胞0.5、2.0、6.0、12.0、24 h,利用免疫组化和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法分别检测Bcl-2、Bax蛋白及其基因的表达.结果 氯化镉可以诱导NRK细胞凋亡,并且有剂量、时间-效应趋势.随着染毒剂量的增加和时间延长,Bax蛋白表达逐渐增强,且有剂量、时间-效应趋势,而Bax基因表达量保持在一个相对稳定的水平,无剂量、时间-效应趋势,Bcl-2蛋白及其基因的表达随着染镉时间的延长和浓度的增加,表达逐渐减弱,有剂量、时间-效应趋势.结论 Bax蛋白表达增强,Bcl-2蛋白表述减弱是镉诱导NRK细胞凋亡过程中一个重要的调节机制,且与Bax/Bcl-2比值有密切的关系.     

锌影响镉对人未成熟树突状细胞毒性作用

目的探讨锌对镉诱导的人未成熟树突状细胞(iDC)毒性的影响。方法分离人周围血单核细胞(PBMC)并诱导为iDC后,分组给予生理氯化钠溶液(对照组)、氯化镉(CdCl2组)、硫酸锌(ZnSO4组)、锌预处理后加氯化镉(Zn+Cd组)、锌离子特异性螯合剂(TPEN)预处理后加氯化镉(TPEN+Cd组)处理。噻唑蓝(MTT)颜色反应法检测细胞活力;单细胞凝胶电泳(SCGE)检测DNA链断裂损伤;吖啶橙(AO)与碘化丙啶(PI)核双染观察细胞凋亡并通过流式细胞仪检测凋亡细胞中染色体断裂的亚二倍体(SubG1)。结果 CdCl2组iDC活力抑制率随CdCl2呈剂量依赖性显著增高(P<0.05);与ZnSO4组或CdCl2组相比,Zn+Cd组和TPEN+Cd组细胞活力抑制率明显升高(P<0.05);相同CdCl2剂量(20μmol/L)时,Zn+Cd组和TPEN+Cd组细胞的彗星尾长和尾矩明显增大(P<0.05);各处理组出现凋亡细胞核染色和SubG1阳性细胞比例明显增加。结论镉化合物暴露导致iDC活力降低,其诱导的细胞毒性明显高于锌;细胞内锌稳态干预可增加镉介导的iDC内DNA损伤相关的毒作用敏感性。     

葡萄籽原花青素对急性镉染毒大鼠肾细胞DNA损伤的影响

目的探讨葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidins,GSP)对氯化镉染毒大鼠肾细胞DNA损伤的拮抗作用。方法将32只健康雄性SPF级SD大鼠按体重随机分为4组,分别为对照组(腹腔注射、灌胃生理盐水)、镉染毒组(腹腔注射1.5 mg/kg氯化镉溶液和灌胃生理盐水)和低、高剂量GSP干预组(腹腔注射1.5 mg/kg氯化镉,同时,分别灌胃20、40 mg/kg GSP溶液),每组8只。腹腔注射和灌胃染毒容量分别为3、5 ml/kg,连续染毒14 d。采用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)检测肾细胞的DNA损伤,采用实时荧光RT-PCR技术检测c-jun N末端激酶(JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)mRNA的表达。结果与对照组比较,镉染毒组大鼠肾脏细胞DNA的尾长、Olive尾矩、尾矩均显著升高,差异具有统计学意义(P<0.05)。低、高剂量GSP干预组大鼠肾脏细胞的DNA损伤均高于对照组,但差异无统计学意义。各剂量GSP干预组大鼠肾脏细胞DNA的尾长、Olive尾矩、尾矩均显著低于镉染毒组差异有统计学意义(P之0.05)。且随着GSP染毒剂量的升高,镉染毒大鼠肾脏细胞的尾长、Olive尾矩、尾矩均呈下降趋势。与镉染毒组比较,各剂量GSP干预组大鼠肾脏细胞中JNK mRNA的表达水平均显著下降,差异有统计学意义(P<0.05);而p38 MAPK mRNA的表达水平无显著变化。结论 GSP可能通过降低MAPK信号通路中JNK的表达拮抗氯化镉诱发的大鼠肾细胞DNA损伤效应。     

MAPK抑制剂对镉诱导凋亡基因表达影响

目的 观察丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)抑制剂PD98059对氯化镉(CdCl2)诱导大鼠肾上皮细胞(NRX)凋亡基因Bcl-2和Caspase-3 mRNA表达的影响.方法 应用流式细胞仪测定CdCl2染毒6 h的NRK细胞凋亡作用;用MAPK抑制剂PD98059预先处理NRK细胞1 h后,用不同浓度镉染毒,运用实时荧光定量PCR技术,检测NRK肾细胞内凋亡基因Bcl-2和Caspase-3 mRNA表达水平.结果 NRK细胞的凋亡率与CdCl2染毒存在剂量-效应关系;2.5,5,10 μmol/L镉染毒使Bcl-2 mR.NA的表达水平分别下降至对照组的72%,53%和37%,而Caspase-3 mRNA表达水平上升为对照组的125%,153%和175%.在细胞培养基中预先加入PD98059然后用镉染毒,PD98059可明显阻止镉引起的Bcl-2 mRNA表达水平下降以及Caspase-3 mRNA表达水平升高.结论 MAPK抑制剂PD98059对镉引起凋亡基因Bcl-2和Caspase-3的表达水平改变具有明显干预作用,提示MAPK信号调节可能参与镉诱导的细胞凋亡过程.     

二硫化碳对植入期小鼠子宫内膜细胞DNA损伤的研究

目的 用单细胞凝胶电泳(SCGE)技术检测二硫化碳(carbon disulfide,CS:)致植入期小鼠子宫内膜细胞DNA损伤,探讨其胚胎植人障碍机制.方法 用机械刮取法制备胚胎植入期小鼠子宫内膜单细胞悬液,台盼蓝检测细胞活性,用0、500、1000、2500μmol/L CS_2与细胞共培养1h后进行SCGE实验,采集彗旱图像,CASP系统自动分析各项指标.结果 不同剂量的CS_2染毒对DNA造成不同程度的损伤,形成较为典型的正常细胞和彗星细胞图像.与对照组比较,500、1000、2500 μmol/LCS_2染毒组彗星头部DNA含量百分比(HDNA%)分别减少了7.49%、12.19%、24.36%,差异均有统计学意义(P<0.01);500、1000、2500 μmol/LCS_2染毒组彗星尾部DNA含量百分比(TDNA%)、尾长(TL)、Olive尾矩(0TM)分别增加了7.13、11.60、23.18倍,3.68、5.98、9.62倍和9.16、16.84、39.32倍,差异均有统计学意义(P<0.01).与500、1000 μmol/L CS_2染毒组比较,2500μml/L CS_2染毒组的TDNA%、TL、彗星全长(CL)、尾矩(TM)、OTM增加了1.98、0.92、1.27、0.52、0.37倍和0.17、5.31、1.90、2.97、1.26倍,差异有统计学意义(P<0.01);与500 μmol/L CS_2染毒组比较,1000μmol/L CS_2染毒组的TDNA%、,TL、CL、TM、OTM增加了0.55、0.49、0.16、1.18、0.76倍,差异有统计学意义(P<0.01).HDNA%、TDNA%、TL、TM、OTM与染毒剂量的回归系数分别为-13.78,13.78,0.05,4.38,3.23,差异有统计学意义(P(0.01).结论 CS_2致植入期小鼠子宫内膜细胞DNA损伤,随着染毒剂量增加,损伤程度明显增加.CS_2损伤植入期小鼠母体子宫内膜细胞可能是影响胚胎正常植入的重要原因之一.     

氟致人肝细胞DNA损伤与细胞凋亡关系的研究

目的 研究氟致人肝细胞DNA损伤与细胞凋亡之间的关系. 方法采用40、80、160μg/ml氟化钠对培养的人肝细胞进行染毒,12 h后用单细胞凝胶电泳技术(SCGE)和流式细胞术(FCM)检测氟化物对人肝细胞DNA损伤和细胞凋亡情况. 结果各氟染毒组人肝细胞DNA损伤程度明显高于对照组,并且随着染氟剂量的增高而增大;中、高剂量氟组人肝细胞凋亡百分率均明显高于对照组.同时,高剂量氟组与低剂量氟组之间细胞DNA损伤程度和凋亡率的差异亦有统计学意义. 结论氟可导致人肝细胞DNA损伤,诱导细胞凋亡,一定浓度范围内的氟所导致的DNA损伤与细胞凋亡之间呈现明显的正相关关系.     

镉诱导大鼠肾细胞早期凋亡及bax基因表达的实验研究

目的探讨氯化镉(CdC l2)在不同时间、剂量作用下,诱导正常大鼠肾(NRK)细胞早期凋亡的发生情况以及CdC l2染毒不同时间对bax基因表达的影响。方法选择不同浓度(0~60μm ol/L)CdC l2体外作用NRK细胞12 h及20μm ol/L CdC l2体外作用NRK细胞不同时间(10 m in~24 h),用流式细胞仪检测细胞凋亡;用逆转录-多聚合酶链扩增反应(RT-PCR)的方法观察20μm ol/L CdC l2作用NRK细胞不同时间(0.5~6 h)baxmRNA的表达情况。结果0、5、10、20、40、60μm ol/L CdC l2作用NRK细胞12 h,细胞早期凋亡发生率分别为1.49%、3.77%、7.77%、14.83%、9.69%、7.23%;20μm ol/L氯化镉作用NRK细胞10、20 m in和0.5、2、6、12、24 h后,早期凋亡发生率分别为0.69%、1.16%、2.71%、4.11%、16.72%、14.83%、9.63%;20μm ol/L CdC l2处理NRK细胞0.5、2、6 h后,bax的相对表达量(β-actin为内参照)分别为:对照组0.604±0.184,染毒0.5 h组1.017±0.285,染毒2 h组1.424±0.367,染毒6 h组1.742±0.392。结论CdC l2可以诱导NRK细胞早期凋亡,并可使bax基因表达增强。