报告基因方法对壬基酚、双酚A雌激素样活性的体外研究

目的利用基于报告基因的MCF7细胞体外雌激素检测方法对壬基酚(NP)、双酚A(BPA)的雌激素样活性及作用机制进行研究。方法合成人雌激素反应元件(ERE)核心片断并将其插入pGL3promoter载体的多克隆位点构建而成雌激素反应元件ERE调控的报告质粒pERELuc,用脂质体转染法将pERELuc及内对照质粒phRLSV40瞬时转染MCF7细胞,用17β雌二醇(E2)、三苯氧胺(Tam)、壬基酚、双酚A等处理后检测报告基因荧光素酶的表达。结果转染pERELuc的MCF7细胞的报告基因表达与E2呈明显的剂量-反应关系,1×10-11molLE2可引起报告基因的表达,至1×10-9molL可达到最大表达值,而未转染pERELuc时与E2无明显反应,三苯氧胺可以显著抑制E2引起的报告基因的表达。1×10-6molL以上NP和BPA出现雌激素样作用。NP的雌激素样活性略强于BPA。结论本试验建立并采用的基于报告基因的体外雌激素检测方法是可行的,NP和BPA有一定的雌激素样活性作用。     

基于pGL-4载体的雌激素受体报告基因实验系统的建立与验证

目的建立和评价一种新的基于pGL-4载体的雌激素受体报告基因实验系统。方法通过瞬时共转染将雌激素受体表达载体、报告基因载体和内参载体转入LLC-MK2细胞,用特定浓度受试物进行染毒并观察其反应。结果 (1)细胞毒性试验显示,除双酚A和壬基酚在100μmol/L时有细胞毒性外,其余受试物在设定浓度未见细胞毒性。(2)雌激素受体α报告基因实验系统最低检测限为1.9×10~(-11)mol/L,雌二醇和己烯雌酚在10~(-8)mol/L分别产生30.7倍和24.1倍对照组的荧光素酶表达,双酚A、壬基酚和染料木黄酮均能诱导该系统荧光素酶的表达,他莫昔芬和染料木黄酮能抑制雌二醇诱导的荧光素酶表达。(3)雌激素受体β报告基因实验系统中,雌二醇和己烯雌酚分别产生对照组14.4倍和5.6倍荧光素酶表达。结论基于pGL-4载体建立的雌激素受体报告基因实验系统有着良好的重复性、灵敏度和特异度,且能检测不同雌激素受体亚型的激动剂和拮抗剂,是一种新的用于内分泌干扰物大通量筛选的报告基因实验系统。     

改良的环境化学物雌激素干扰活性检测方法的建立和应用

目的建立雌激素受体(ER)介导的荧光素酶(Luc)报告基因试验方法,为化学物拟(抗)雌激素活性的检测提供研究工具。方法将受雌激素反应元件调控的荧光素酶报告基因质粒pERE-aug-Luc和表达ER的质粒rERα/pCI转染Vero细胞,建立ER报告基因试验。以雌激素(E2)为阳性对照检测该方法的筛选效率。Vero转染后用受试化学物染毒,根据Luc表达的变化,判断化学物的雌激素干扰活性。结果雌激素对转染两种质粒的Vero的诱导作用表现为:10-7 mg/L的雌激素显著诱导Luc的表达,最大诱导倍数为100.959倍,半数效应浓度EC50为3.57×10-6 mg/L。化学物BPA可诱导Luc的表达,其中在0.01mg/L时即可显著性的诱导Luc表达,未发现BPA具有雌激素拮抗作用。结论本研究建立的ER报告基因试验具有较高的灵敏度和特异性,化学物BPA具有拟激素活性。     

筛选维甲酸样内分泌干扰物报告基因方法的建立

[目的]建立应用荧光素酶报告基因筛检干扰维甲酸功能的环境化学物的方法。[方法]利用基因重组方法将3个重复序列RXR/RXR反应元件和2个重复序列RAR/RXR反应元件插入含荧光素酶报告基因的pGL4质粒上游,再将该质粒转染表达维甲酸受体的MLE-12细胞,加入全反式维甲酸或雌二醇后,检测荧光素酶活性。[结果]构建的RARE-TATA-pGL4报告基因质粒经限制性内切酶和DNA测序证实构建成功。经报告基因试验证实,与阴性对照组相比,维甲酸能使pGL4质粒的荧光素酶相对活性增加30.28倍,而雌二醇仅为1.4倍,说明雌二醇没有干扰作用。[结论]RARE-TATA-pGL4报告基因质粒可用于筛检环境中维甲酸样干扰物。     

环境雌激素基因重组酵母测评系统的应用

检测和评价环境雌激素及其它内分泌干扰物，是进行内分泌干扰物研究首先要解决的关键问题之一。根据天然雌激素的主要分子作用机制，在酵母中表达有活性的人雌激素受体(hER)蛋白，同时将报告基因置于雌激素效应元件(ERE)控制之下并导入酵母细胞中，通过检测报告基因的表达产物来反映环境雌激素通过雌激素受体介导而产生的拟雌激素作用。我所何世华博士用分子生物学方法基因重组出了用于检测雌激素类物质的酵母菌，并建立了环境雌激素酵母测评系统。现用该评价系统对不同样品进行检测，结果如下。     

环境雌激素重组酵母测评系统的建立

目的：通过检测重组酵母中报告基因的表达产物来反映环境雌激素通过雌激素受体介导而产生的拟雌激素作用。方法：用乙酸锂法将本实验室已构建成功的全长人雌激素受体酶母表达载体pGAD-hER和雌激素效应元件（ERE）调控的酵母报告载体pLacZi-2ERE导入酵母细胞中，得到重组酵母YM－ADER－ERE。结果：与对照DMSO相比，加入17β－雌二醇（E2）后YM－ADER－ERE中报告基因lacZ的表达产物β－半乳糖苷酶活性显著升高。用终浓度为10^-15-10^-7mol/L的E2进行实验，E2在YM－ADER－ERE中最大效应EAmax为94．31U，EC50为0.34nmol/L.结论：重组酵 报告基因的表达是雌激素配体依赖的，符合环境雌激素测评系统的设计思想和要求，不表明重组酵母测评系统是成功的。     

雌激素受体的作用

雌激素受体是一种配体激活转录因子，类固醇激素17－β雌二醇通过雌激素受体介导反应。雌二醇进入细胞后，与雌激素受体结合，一同结合到靶基因调节区的雌激素反应原件上，起调节作用。现普遍认为有两种雌激素受体，存在于不同组织或同一组织，具有不同的生物学功能。     

大豆异黄酮对大鼠子宫雌激素受体的影响

[目的]探讨大豆异黄酮对子宫雌激素受体的影响及其雌激素样作用机制. [方法]30只大鼠行双侧去卵巢手术后随机分为阴性对照组(蒸馏水)、低、中、高剂量大豆异黄酮组(0.02 mg/kg、0.10 mg/kg、0.50 mg/kg)和阳性对照组(0.08 mg kg雌二醇),连续用药3 d后取子宫,采用放射性配基结合分析法和雌激素受体结合试验检测雌激素受体数量. [结果]大豆异黄酮各浓度组放射活性与阴性对照组比较,差异有统计学意义(P≤0.05).大豆异黄酮各浓度组雌激素受体数量与阴性对照组比较,差异无统计学意义(P≥O.05). [结论]大豆异黄酮影响雌二醇与雌激素受体结合,但不影响雌激素受体的数量,可能是通过与雌激素受体结合显示雌激素样作用.     

汞、铬和锰化合物雌激素样作用的实验研究

目的为评价汞、铬和锰化合物雌激素样作用。方法选用氯化汞、硫酸锰、氯化铬、三氧化铬4种化合物进行MCF7人乳腺癌细胞增殖试验和雌激素受体竞争结合试验。结果10-9×10-5molL氯化汞能诱导MCF7人乳腺癌细胞增殖,10-7molL氯化汞使MCF7人乳腺癌细胞增殖达最大,其增殖作用可被雌激素受体拮抗剂ICI182780完全阻断;但不影响雌二醇与雌激素受体结合。硫酸锰、氯化铬、三氧化铬均不能诱导MCF7人乳腺癌细胞增殖,且不影响雌二醇与雌激素受体结合。结论氯化汞可能通过雌激素受体介导而表现出雌激素样作用;硫酸锰、氯化铬、三氧化铬不具有雌激素样作用。     

报告基因方法检测壬基酚、双酚A抗雄激素样活性的体外研究

[目的]利用基于报告基因的中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)体外抗雄激素检测方法对壬基酚、双酚A的抗雄激素样活性进行研究,为进一步验证该法在检测抗雄激素样物质的可行性和揭示内分泌干扰作用的机制提供依据。[方法]采用本室建立的瞬时转染人雄激素受体表达质粒pSVAR0、雄激素反应元件调控的报告质粒pMMTV-Luc及内对照质粒phRL-SV40的CHO细胞,在给予1×10-7mol/L二氢睾酮(DHT)后给予不同浓度的壬基酚(NP)及双酚A(BPA),检测报告基因表达活性。[结果]浓度均>1×10-6mol/L的NP、BPA可抑制1×10-7mol/LDHT产生的雄激素样作用,两者具有抗雄激素活性,但较雄激素拮抗剂氟他安(FLU)弱,BPA的抑制作用强于NP。[结论]NP、BPA有一定的抗雄激素活性,BPA的抑制作用强于NP。