Parkin基因新的多态位点IVS3-20 T→C增加早发性帕金森病的发病风险

目的 确定parkin基因第3内含子区新的多态位点IVS3-20 T→C多态与帕金森病(Parkinson’s disease，PD)的相关性。尤其是该多态与PD发病年龄的关系。方法 经PCR扩增后。用变性高效液相色谱和DNA自动测序等方法分析了312例PD患者和236名正常对照parkin基因IVS3—20 T→C多态性位点分布频率的差异。结果 总体分析未发现C／C纯合型。PD组T／C基因型频率和C等位基因频率与对照组相比有明显升高，但差异无显著性。将PD组按年龄分层后。45岁以下PD患者IVS3—20 T→C多态T／C基因型频率(7．07%)明显高于正常对照组(2．12%)。OR=3．52，95%CI为0．97～13．13(P=0．0263)。C等位基因频率(3．90%)也明显高于正常对照组(1．06％)。OR=3．42。95%CI为0．96～12．57(P=0．0276)．而45岁以上PD组与正常对照组相比差异无显著性。年龄分层后的趋势分析显示parkin基因IVS3-20 T／C多态性相对危险度与PD发病年龄间存在负相关联系．结论 发现了parkin基因IVS3-20 T→C多态位点，并提示IVS3-20 T→C多态位点可能是中国人散发性早发PD的一个危险因素。     

三个常染色体隐性遗传性青少年型帕金森综合征家系的基因型与表型分析

目的探讨常染色体隐性遗传性青少年型帕金森综合征(autosomal recessive juvenile parkinson-ism,AR-JP)parkin基因的突变及临床特征。方法应用聚合酶链反应、DNA测序和限制性核酸内切酶酶切等技术对15个AR-JP家系先证者的parkin基因进行突变研究。结果发现3个家系有parkin基因的突变,其中2个家系含parkin基因的杂合缺失突变,分别为第2外显子的202-203delAG及第9外显子的1069-1074delGTGTCC;另一家系发现一个杂合点突变,为第12外显子的1422(T→C)。其中1069-1074delGTGTCC和1422(T→C)为新的突变。3个家系共6名患者,发病年龄18~31岁,平均25.2±5.7岁;病情进展慢,腱反射活跃或亢进、症状波动常见;对小剂量多巴制剂反应良好。结论我国的AR-JP家系存在parkin基因的突变;含parkin基因突变的AR-JP患者有帕金森病的一般临床表现,又有其独特的临床特征。     

苯丙氨酸羟化酶基因的六种新型突变

目的　检测中国苯丙酮尿症 ( phenylketonuria ,PKU )患者苯丙氨酸羟化酶 (phenylalaninehy droxylase ,PAH)基因新的突变位点。 方法　应用聚合酶链反应 单链构象多态性及DNA直接测序检测 40例经典型PKU患者和 3 0名正常对照的PAH基因。结果　在PAH基因上共发现 11种突变和 3种多态 ,3 0名正常对照者PAH基因未发现异常。结论　经与国际PAH基因突变数据库比较 ,确认M 2 76K、M 2 76R、2 80insT、IVS10nt 3 2T→A、IVS4nt 4 7C→T是国际上首次发现的突变 ,H 2 90R是中国PKU患者基因上首次发现的新型突变。     

常染色体隐性遗传性早发型帕金森综合征DJ1基因突变研究

目的探讨常染色体隐性遗传性早发型帕金森综合征（autosomal recessive early-onset Parkinsonism，AR—EP）DJ1基因的突变特点。方法 应用聚合酶链反应结合DNA直接序列分析方法，对11个常染色体隐性遗传性早发型帕金森综合征家系先证者的DJ1基因进行突变研究。结果本组AR-EP患者未发现DJ1基因的致病突变，在内含子区发现6个多态，分别为IVS1→15T→C、IVS4＋30T→G、TVS4＋45G→A、IVS4＋46G→A、IVS5＋31G→A和g．168-185del，其中3个（IVS1-15→C、IVS4＋45G→A、IVS4＋46G→A）为新发现的多念。结论中国人常染色体隐性遗传性早发型帕金森综合征患者DJ1基因突变可能罕见。     

变性高效液相色谱检测 PKD2基因突变

目的　利用变性高效液相色谱分析技术 ( denaturing high- performance liquidchromatography,DHPL C) ,检测 2型常染色体显性遗传性多囊肾病致病基因 ( polycystic kidney diseasegene 2 ,PKD2 )突变。方法　收集临床确诊的汉族常染色体显性遗传性多囊肾病 ( autosomal dominantpolycystic kidney disease,ADPKD) 94个家系 ,提取外周血白细胞 DNA,用聚合酶链反应 ( polymerasechain reaction,PCR)扩增目的基因的全编码区 ,DHPL C对 PCR产物进行突变筛选 ,出现异常峰型的DNA片段进行核苷酸序列测定 ,明确突变位点和类型。结果　以 5 0名健康志愿者为正常对照 ,从 94例患者家系中成功检测出 8种突变 ,包括 2种无义突变、3种移码突变、3种错义突变。无义突变分别位于第 5和13外显子 ( 12 4 9C→ T,2 4 0 7C→ T) ,编码氨基酸分别在 4 17和 80 3位形成终止密码子。移码突变分别位于第2、12和 13外显子 ( 6 36 - 6 37ins T,2 348- 2 35 1del AGAA,2 4 0 1del A)。错义突变分别位于第 1、4和 5外显子 ( 5 6 8G→ A,96 4 C→T,116 8G→A) ,其编码氨基酸发生改变 ( 190 Ala→ Thr,32 2 Arg→Trp,390 Gly→ Ser)。结论　所检测出的 8种突变 ,为 ADPKD患者的基因诊断、产前诊断和囊肿前诊断积累了资料     

应用变性高效液相色谱技术检测三个遗传性多发性外生骨疣家系的EXT1与EXT2基因突变

目的建立一种应用变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatograph,DHPLC)技术检测遗传性多发性外生骨疣(hereditary multiple exostosis,EXT)基因突变的新方法,并研究3个EXT家系的基因突变情况。方法扩增EXT致病基因的所有外显子区及部分内含子与外显子交界区,联合连锁分析、DHPLC筛查及测序的方法进行分析。结果3个EXT家系中,共检测到两处已知EXT2基因的剪接位点突变IVS2 1G>A、IVS7 1G>T,一处28C>A变异和一处EXT1基因的IVS4 66G>A变异。结论EXT2基因的2个剪接位点突变分别是引起相应EXT家系的致病原因,应用DHPLC技术检测遗传性疾病基因变突是一种自动化、高通量、灵敏、快速且简便经济的好方法。     

非综合征性聋分子病因学分析——TMIE基因突变筛查报告

目的探讨TMIE基因突变与中国人群非综合征性聋的关系以及TMIE基因突变频率和特性。方法收集中国人群中散发非综合征性聋患者123例、遗传性非综合征性聋家系先证者62例及部分成员、以及健康对照60例临床资料及外周血DNA,应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）扩增TMIE基因编码区片段,通过变性高效液相色谱法（denaturing high—performance liquid chromatography,DHPLC）筛查TMIE基因突变,经DNA测序检测突变。结果在两个散发非综合征性聋患者和一个常染色体显性遗传性非综合征性聋家系中先证者TMIE基因编码区PCR产物DHPLC结果异常,但序列检测没有发现TMIE基因编码区的突变,仅分别发现第二内含子区域IVS2—53G〉A和第三外显子506A—G基因单核苷酸多态性呈杂合状态。其中506A—G单核苷酸多态未见有报道。结论中国人群中遗传性非综合征性聋患者TMIE基因突变频率较低,不可能是中国人群中非综合征性聋的主要致病基因。     

parkin基因的一个新的点突变

目的：研究parkin基因外显子2-10点突变与散发性早发帕金森病发病的关系。方法：应用聚合酶链反应（polymerase chain reaction ，PCR）、琼脂糖电泳、单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）、DNA测序及限制性核酸内切酶酶切方法，检测了60例散发性早发帕金森病患者以及120名正常人外周血白细胞DNA的parkin基因外显子2-10点突变。结果：发现1例患者的parkin基因外显子2存在纯合突变（G237→C），限制性内切酶酶切证实，其它外显子未见突变，120名正常对照也未见突变。结论：parkin基因外显子存在点突变，可能与部分散发性早发帕金森病发病有关。     

128例Ⅱ型糖尿病患者线粒体ND1基因突变位点的研究

目的通过对128例Ⅱ型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)患者线粒体DNA ND1基因进行突变位点筛查,探索ND1基因点突变与山西人群T2DM的相关性。方法 PCR扩增患者ND1基因所在区段,PCR产物直接测序分析。结果128例患者共有38例患者检测到基因点突变,突变检出率为29.7%。38例患者共筛出22个突变位点,2种突变类型。其中31例存在单个位点突变,5例存在2个位点突变,2例存在3个位点突变。22个突变位点中,3552(T→A)突变频率最高,为40.9%(9/22);3394(T→C)、3435(C→T)、3497(C→T)、3316(G→A)、3571(C→T)、3537(A→G)的突变频率分别为22.7%(5/22)、22.7%(5/22)、18.2%(4/22)、13.6%(3/22)、13.6%(3/22)和10.1%(2/22);其余突变位点的突变率均为4.5%(1/22)。在所有突变位点中,除3688(G→C)为异质性突变外,其余突变均为同质性。此外,22个突变位点中存在一个新的突变位点3499(A→T),属首次报道。结论 3552(T→A)和3394(T→C)突变频率最高,可能与山西地区T2DM发病相关;新发现的突变位点3499A→T(Thr→Ser),其致病性需要进一步研究。     

47例汉族HIV/AIDS患者外周血白细胞线粒体DNA高变1区序列分析

目的 分析中国汉族HIV-1感染者外周血白细胞线粒体DNA的非编码区的高变1区(HR 1)突变情况,探讨HIV对线粒体影响.方法 分离47例未接受过抗反转录病毒治疗、无机会性感染的HIV/AIDS患者的外周血细胞,提取外周血白细胞DNA,PCR扩增DNA非编码区HR1的大约600 bp的DNA片段,产物纯化后进行测序,测序结果和剑桥序列比对,分析突变位点以及各位点的突变频率.结果 HIV/AIDS患者在非编码HR 1区(核苷酸位点16 024～16 383之间)有124个位点存在多态性,碱基变化率为0～20.47%(中位数为5.33%).大多数突变方式是C→T或T→C的变化.在第16223核苷酸位点,共出现了36个C→T改变,发生率为70.97%(36147);在第16 362核苷酸位点,共出现了26个T→C变化,发生率为55.32%(26147),3个T→G改变,发生率为6.38%(3/47);与以往报道数据类似.结论 HIV-1可能导致线粒体非编码区突变增加.     

Putative role of specific JAG1 gene exons in modulating clinical features in patients with leukoencephalopathy

The aim of this study was to investigate the possible role of JAG1 gene mutations in modulating clinical features in patients with CADASIL-like phenotype which resulted negative for NOTCH3 gene mutations. Sixty-six CADASIL-like patients without NOTCH3 gene mutations were investigated for 5 out of 26 exons of the JAG1 gene, whose mutations were implicated in central nervous system vascular abnormalities. PCR was performed with primers specific for exons 3, 4, 13, 23 and 24 comprising the intron-exon boundaries. Amplicons were then analyzed by denaturing high performance liquid chromatography (DHPLC). The exons showing a variant DHPLC profile were directly sequenced. The sequence of exons 3, 4 and 23 revealed the presence of four already described polymorphisms in JAG1. 1001C/T (g.16015 C>T) in exon 4 was found in 9 patients, IVS23+18delT (g.33147 delT) in 29 patients, IVS3-15T/C (g.15852 T>C) in 17 patients, IVS2-43C/T (g.10532 C>T) in 1 patient; both the polymorphism 1001C/T and IVS3-15T/C were found in 3 patients. No mutations were found. These data demonstrate absence of correlation between mutations in specific JAG1 gene exons and clinical features in patients with CADASIL-like phenotype.     

中国Rett综合征患儿突变基因的亲源分析

目的 明确中国Rett综合征(Rett syndrome,RTT)患儿致病基因甲基化CpG结合蛋白2(methyl-CpG-binding protein 2,MECP2)的突变亲源.方法 对115例经基因突变分析证实存在MECP2突变的患儿进行第3内含子测序分析,寻找单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点.对发现SNP患儿行等位基因特异性PCR扩增,通过比较患儿及其父亲SNP碱基序列,判定患儿突变基因所在染色体亲源.结果 115例患儿中76例存在至少一种SNP.在中国RTT患儿中发现3个热点SNP.76例患儿中73例突变位于父源X染色体,3例突变位于母源X染色体.结论 我国RTT患儿MECP2突变以父源突变为主.     

应用变性高效液相色谱技术进行肝豆状核变性的基因突变筛查及产前诊断

目的 探讨变性高效液相色谱(denature high performance liquid chromatography,DHPLC)技术在肝豆状核变性(Wilson's disease,WD)的突变筛查及产前诊断中的临床应用.方法 以6个WD家系中的患者及其父母的DNA为模板,采用PCR技术扩增ATP7B基因的21个外显子及5'非翻译区,PCR产物经DHPLC技术进行突变筛查,对峰型有改变者进行测序验证.在确定了先证者突变类型的基础上,采用相同方法对其中4个家系(1个双胎和3个单胎)进行产前诊断.结果 6例患者中检测出5种已知的致病突变及8种多态类型.患者的父母均为相应突变类型的携带者.产前诊断结果显示,两例妊娠为异常胎儿,其中1例双胎为Arg778Leu/IVS4-1G>C双重杂合子,1例单胎为Ser975Tyr/Pro992Leu双重杂合子,这两对妊娠夫妇选择了终止妊娠.另两例妊娠中,1例为Ser975Tyr杂合子,1例完全正常,他们选择了继续妊娠,出生了表型正常儿.结论 DHPLC在Wilson病的突变检测和产前诊断中有良好的应用前景.     

Familial dysautonomia: detection of the IKBKAP IVS20(+6T --> C) and R696P mutations and frequencies among Ashkenazi Jews

Familial dysautonomia (FD) is an autosomal recessive congenital neuropathy that occurs almost exclusively in the Ashkenazi Jewish (AJ) population. Mutations in the IkappaB kinase complex-associated protein (IKBKAP) gene cause FD. Two IKBKAP mutations, IVS20(+6T --> C) and R696P, have been identified in FD patients of AJ descent. The splice site mutation IVS20(+6T --> C) is responsible for > 99.5% of known AJ patients with FD, and haplotype analyses were consistent with a common founder. In contrast, the R696P mutation has been identified in only a few AJ patients. To facilitate carrier detection, a single PCR and allele-specific oligonucleotide (ASO) hybridization assay was developed to facilitate the detection of both the IVS20(+6T --> C) and R696P mutations. Screening of 2,518 anonymous AJ individuals from the New York metropolitan area revealed a carrier frequency for IVS20(+6T --> C) of 1 in 32 (3.2%; 95% CI, 2.5-3.9%), similar to the previously estimated carrier frequency (3.3%) based on disease incidence. No carrier was identified for the R696P lesion, indicating that the mutation was rare in this population (< 1 in 2,500). This sensitive and specific assay should facilitate carrier screening for FD mutations in the AJ community, as well as postnatal diagnostic testing.     

The importance of gene dosage studies: mutational analysis of the parkin gene in early-onset parkinsonism

Early-onset parkinsonism (EOP) may be associated with different mutations in the parkin gene, including exon deletions and duplications. To test for gene dosage alterations, we developed a new method of quantitative duplex PCR using the fluorescence resonance energy transfer technique on the LightCycler (Roche Diagnostics). In 21 patients with EOP, three mutations (a single base pair substitution in exon 3 and small deletions in exon 9) were detected by conventional mutational screening (single-strand conformation polymorphism and sequence analysis), while alterations of gene dosage were found in seven patients. We identified heterozygous and compound heterozygous deletions of exons 2, 3, 5 and 7. The latter was also found in the homozygous state. In addition, two heterozygous duplications of exon 4 were observed. Remarkably, two patients carried more than two parkin mutations. This is the first study systematically screening all 12 exons of parkin by real-time, kinetic quantification and clearly shows that mutational analysis of the parkin gene should include gene dosage studies. Furthermore, our method of quantitative PCR is easily applicable to any other gene to be screened for deletions or duplications of whole exons.     

颅内海绵状血管瘤 CCM1基因第12外显子及其5′端内含子新突变位点

目的　探讨 CCM1基因突变在中国人颅内海绵状血管瘤 ( intracranial cavernous angiomas,ICCA)发病中所起的作用。方法　收集我院神经外科 2 0 0 2年 6月～ 2 0 0 3年 2月收治并经手术病理证实的2 1例 ICCA患者及 15名正常健康对照者 ,从外周静脉血中提取 DNA,PCR法扩增 CCM1基因第 12外显子及其两侧部分内含子序列 ,应用 DNA直接测序技术对扩增产物进行检测。结果　 5例患者中检测出 3处 CCM1基因突变 ,均为首次发现。其中 ,5例患者中均存在 1172 C→ T的错义突变 ,使编码 KRIT1蛋白391位的氨基酸由丝氨酸变成苯丙氨酸。另有 1例患者存在 116 0 A→ C的错义突变 ,使编码 KRIT1蛋白387位氨基酸的谷氨酰胺变成脯氨酸。另一个突变发生在第 12外显子 5′端内含子区域 ,5例患者中有 4例第 4个碱基 C被 T取代。对照组检测结果无异常。结论　中国 ICCA患者存在 CCM1基因第 12外显子的突变 ,并与 ICCA的发病有关