大蒜新素抑制人巨细胞病毒即刻早期抗原表达的实验研究

目的 :通过研究大蒜新素对人巨细胞病毒即刻早期抗原 (HCMVIEA)的抑制作用 ,探讨大蒜新素体外对HCMV感染的预防、阻断和治疗效应及其机制。方法 :采用细胞形态观察和MTT比色法检测大蒜新素的细胞毒性。以流式细胞术定量检测和比较大蒜新素不同剂量 ,不同处理时间 (24 ,48,72 ,96h)以及病毒感染不同阶段 (病毒吸附前、吸附时和吸附后 )应用大蒜新素时HCMVIEA表达水平变化。结果 :人胚肺成纤维细胞对大蒜新素的最大耐受浓度为 9.6 0mg·L^-1。病毒吸附后持续用药可显著抑制HCMVIEA的表达 ,用药 72h HCMVIEA抑制率达 89.3% ;大蒜新素预处理细胞后感染病毒 ,HCMVIEA抑制率为 28.6% ;药物与病毒吸附同时应用 ,即刻早期抗原 (IEA)抑制率仅为 10.3%。结论 :大蒜新素体外持续用药可显著抑制HCMVIEA的表达 ;其预防作用较弱 ;即时抑制效应不明显。大蒜新素对IEA表达的明显抑制可能是大蒜新素抗HCMV效应的主要作用机制之一。     

大蒜新素对人巨细胞病毒感染的人胚肺成纤维细胞凋亡的影响

目的 研究大蒜新素对人巨细胞病毒(HCMV)诱导感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)凋亡的动态变化及凋亡调控基因bcl-2和fas mRNA表达的影响。方法 用流式细胞术测定HELF在高、低感染复数(MOI分别为2．5、0．25)HCMV感染后1、12、24、36、48、72、96h凋亡细胞比率；大、中、小剂量大蒜新素(9、6和3μg／mL)处理正常的和感染的HELF细胞(MOI为2．5)后上述各时间点凋亡细胞比率。用原位杂交法检测大剂量大蒜新素处理感染细胞(MIO为0．25)72h后bcl-2和fas mRNA表达强度变化，并与正常细胞和感染细胞对比分析。结果 正常细胞凋亡比率保持恒定低水平(凋亡率平均2．68％)；低、高感染复数感染细胞随时间延长凋亡细胞逐渐增多，凋亡率峰值分别达8．85％(96h)和25．63％(72h)；各剂量大蒜新素处理的正常细胞凋亡率增加，呈剂量依赖性，峰值分别为4．88％、6．47％和8．35％；但各剂量药物处理感染细胞后却使细胞凋亡比率下降，大剂量药物处理72h时效应最为明显，凋亡细胞比率由25．63％降至16．24％。正常细胞高表达bcl-2，低表达fas基因；感染HCMV后，bcl-2表达显著下调，fas表达明显增强；大蒜新素处理感染细胞后使bcl-2表达强度明显高于感染细胞，fas表达水平明显低于感染细胞，但仍未恢复到正常细胞水平。结论HCMV是HELF凋亡的强诱导剂；病毒可通过下调凋亡抑制基因bcl-2和上调凋亡促进基因fas而发挥致凋亡作用。大蒜新素本身可诱导HELF凋亡，但却能明显抑制HCMV诱导的细胞凋亡，其抑制作用可能与药物干扰HCMV影响凋亡调控基因bcl-2和fas表达有关。     

大蒜新素对人巨细胞病毒即刻早期、早期和晚期基因转录水平的影响

目的 研究大蒜新素对人巨细胞病毒(HCMV)即刻早期(ie)、早期(e)和晚期(1)基因在转录水平的影响,探讨大蒜新素抗HCMV效应的作用机制.方法 建立HCMV AD169株(MOI =2.5)感染细胞和大蒜新素(9.6 mg·L-1)处理感染细胞模型,并用相应剂量(2.3 mg·L-1)的更昔洛韦(GCV)作比较,用实时荧光定量PCR方法检测各组细胞感染后0.5,2,4,6,12,24h病毒u1122,ul123,ul54,ul83 mRNA水平的动态变化.结果 大蒜新素处理组ul122,ul123 mRNA的表达量始终明显低于感染对照组(P＜0.05),而更昔洛韦处理组ul122 mRNA在0.5 ～6 h与病毒对照组无明显差异.大蒜新素对AD169 ul122,ul123 mRNA的抑制率在感染后24h分别为75.2%,70.4%.2药物处理组ul54 mRNA表达量始终低于病毒对照组(P＜0.05),大蒜新素和更昔洛韦对ul54 mRNA的抑制率在感染后24h分别为45.4%,27.2%.在感染后6h各组ul83 mRNA表达明显增多,以病毒感染对照组变化最为明显.大蒜新素和更昔洛韦对ul83 mRNA的抑制率在感染后24h分别为45.9%,26.2%.结论 大蒜新素可显著抑制HCMV AD169毒株ie基因(ul122和ul123)的转录,导致其mRNA表达明显降低,对e基因(ul54)和l基因( ul83)转录水平亦有所抑制,表明病毒ie基因可能是大蒜新素抗HCMV作用的主要环节.     

大蒜新素对鼠巨细胞病毒感染小鼠脾细胞IL-12 基因转录、表达和功能的影响

目的:阐明大蒜新素对鼠巨细胞病毒(MCMV)感染小鼠脾细胞TH1类细胞调控因子IL-12基因转录、表达和功能的影响和其在抗MCMV机制中的作用.方法:60只BALB/c小鼠随机分成大蒜新素治疗组(20只)、安慰剂组(20只)和正常对照组(20只).治疗组在造模后24 h开始腹腔注射大蒜新素一般剂量(25mg·kg-1),每天1次,共14 d;安慰剂组和正常对照组注射等量生理盐水.各组分别于治疗后第3,5,7,10,14天各处死4只小鼠,RT-PCR法检测各组小鼠脾细胞IL-12 p35,IL12 p40 mRNA表达强度;双抗体夹心ELISA法检测脾细胞培养上清中TH1细胞调控因子IL-12 p70蛋白和TH1类细胞因子IFN-γ的蛋白表达水平.结果:安慰剂组在感染后第3天IL-12 p70蛋白和IL-12 p35 mRNA表达显著增高,但第5天后急剧下降,显著低于正常小鼠;IFN-γ在感染后第3天达峰值,随后逐渐下降,在感染后第10～14天降至正常水平;而p40 mRNA则从感染第3天开始持续高水平表达.治疗组在治疗后第3天IL-12 p70蛋白,IL-12 p35,IL-12 p40 mRNA水平均显著增高达峰值(P＜0.05),但随后快速下降,在第5～14天稳定在正常细胞水平;IFN-γ亦在治疗后第3天表达至峰值,第5天稍有下降,但随后表达逐渐上调,在治疗后第7～14天显著高于安慰剂组和正常对照组(P＜0.01).结论:大蒜新素能完全纠正MGMV感染后第5～14天诱导的IL-12 p70蛋白和IL-12 p5 mRNA表达下调以及IL-12 p40 mRNA表达上调;同时还能持续上调IFN-γ表达,提示其还可能通过其他途径促进IFN-γ分泌.大蒜新素的上述作用有助于纠正MCMV诱导的TH1/TH2细胞网络失衡,增强特异性细胞免疫功能和抗病毒因子的分泌而有利于机体清除MCMV病毒,可能是其抗MCMV效应的另一作用机制.     

雷公藤甲素对γ-干扰素刺激后人眼球后成纤维细胞粘附分子-1和白细胞抗原-DR表达的影响

目的观察雷公藤甲素对γ-干扰素(IFN-γ)刺激后人眼球后成纤维细胞(RFs)增殖和对细胞粘附分子-1(ICAM-1)、白细胞抗原(HLA)-DR表达的影响.方法体外培养的RFs分别与IFN-γ、雷公藤甲素孵育后,MTT比色法检测雷公藤甲素对RFs增殖的影响;流式细胞仪检测ICAM-1、HLA-DR的表达状况.结果雷公藤甲素能以剂量依赖方式抑制RFs的增殖,当剂量达100μg/L时,RFs的增殖完全被抑制.正常人自发表达少量的ICAM-1,不表达HLA-DR;IFN-γ(100U/L)能强烈刺激ICAM-1、HLA-DR的表达(P＜0.01);雷公藤甲素能明显抑制IFN-γ对ICAM-1、HLA-DR的刺激作用.结论雷公藤甲素能够抑制细胞因子介导的RFs的生物活性,从而减少Graves'眼病的免疫损伤.     

清肝化瘀方含药血清对人巨细胞病毒感染后人胚肺成纤维细胞细胞病变及增殖的影响

目的探讨清肝化瘀方含药血清对人巨细胞病毒(HCMV)感染后人胚肺成纤维细胞(HELF)细胞病变及增殖活性的影响。方法以体外培养的HELF为靶细胞,将清肝化瘀方含药血清和更昔洛韦(GCV)含药血清分别作用于HCMV AD169株感染的HELF,采用倒置相差显微镜动态观察细胞病变,MTT检测细胞增殖活性。结果清肝化瘀方含药血清、GCV含药血清最大无毒浓度均为血清稀释度10-3。HCMV感染后24~72 h、168 h细胞病变(+);24~72 h、144 h增殖活性减低。清肝化瘀方含药血清、GCV含药血清干预后,细胞病变均消失;干预24~96 h增殖活性均逐渐升高,与病毒组比较,均以72 h时升高为主,差异有统计学意义(P0.05)。2组间细胞病变及增殖活性比较,差异均无统计学意义(P0.05)。结论清肝化瘀方、GCV含药血清均可通过遏制HCMV感染后细胞病变,调节HELF增殖而发挥抗病毒作用。     

清肺口服液对呼吸道合胞病毒感染人胚肺成纤维细胞ICAM-1、IL-8 mRNA基因表达的影响

目的:探讨清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒(RSV)感染的人胚肺成纤维细胞(HELF)细胞间黏附分子(ICAM-1)、白细胞介素-8(IL-8)基因表达的影响。方法:RSV攻击体外培养的HELF细胞后,以清肺口服液含药血清,利巴韦林含药血清及空白血清干预,采用实时荧光定量PCR法(RealTime-PCR)测定各组人胚肺成纤维细胞ICAM-1、IL-8 mRNA表达变化。结果:病毒感染后ICAM-1、IL-8以GAPDH为内参的△Ct值明显小于正常细胞组及生理盐水血清对照组,而清肺口服液含药血清、利巴韦林含药血清作用后△Ct值显著增大。结论:(1)RSV病毒作用后ICAM-1及IL-8 mRNA表达水平显著升高;(2)清肺口服液可以降低ICAM-1、IL-8的表达,缓解RSV感染后细胞的异常变化,起到间接预防RSV肺炎的作用。     

清肺口服液对呼吸道合胞病毒感染人胚肺成纤维细胞肿瘤坏死因子-α转化生长因子-β_1蛋白表达的影响

目的:探讨清肺口服液含药血清对呼吸道合胞病毒感染的人胚肺成纤维细胞肿瘤坏死因子(TNF-α)、转化生长因子(TGF-β1)蛋白表达的影响。方法:用呼吸道合胞病毒Long株感染人胚肺成纤维细胞,用清肺口服液含药血清作用于该细胞,并设空白血清、和正常细胞做对照,24h后采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组细胞上清液TNF-α、TGF-β1蛋白水平。结果:清肺口服液含药血清组两种细胞因子明显升高(P0.01)。结论:清肺口服液含药血清可以在病毒感染早期升高TNF-α、TGF-β1蛋白表达,从而增加病毒清除,抑制过度的免疫反应,这可能是该药治疗呼吸道合胞病毒感染的机理之一。     

清肺口服液对3I、7b型腺病毒感染人胚肺成纤维细胞转化生长因子-β1和血小板衍生生长因子-BB蛋白表达的影响

目的探讨清肺口服液含药血清对腺病毒3Ⅰ、7b感染的人胚肺成纤维细胞之转化生长因子β1(TGFβ1)、血小板衍生生长因子BB(PDGFBB)蛋白表达的影响。方法细胞分为正常细胞组、病毒对照组、空白血清组、利巴韦林组和含药血清组,除正常细胞组外,其余4组均以3Ⅰ、7b型腺病毒分别攻击之,并分别加入相应药物至各组细胞中;采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组细胞上清液中TGFβ1、PDGFBB的含量。结果病毒对照组较正常细胞组细胞中TGFβ1、PDGFBB含量均明显增多(P<0.01),含药血清组比病毒对照组的细胞TGFβ1、PDGFBB含量显著降低(P<0.01)。结论(1)腺病毒感染可使人胚肺成纤维细胞TGFβ1、PDGFBB蛋白表达增高;(2)清肺口服液可降低TGFβ1、PDGFBB细胞因子的蛋白表达,这可能是其抗病毒作用的机制之一。     

清肺口服液对3I、7b型腺病毒感染人胚肺成纤维细胞转化生长因子-β1和血小板衍生生长因子-BB蛋白表达的影响

目的探讨清肺口服液含药血清对腺病毒3Ⅰ、7b感染的人胚肺成纤维细胞之转化生长因子-β1(TGF-β1)、血小板衍生生长因子-BB(PDGF-BB)蛋白表达的影响。方法细胞分为正常细胞组、病毒对照组、空白血清组、利巴韦林组和含药血清组,除正常细胞组外,其余4组均以3Ⅰ、7b型腺病毒分别攻击之,并分别加入相应药物至各组细胞中;采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组细胞上清液中TGF-β1、PDGF—BB的含量。结果病毒对照组较正常细胞组细胞中TGF-β1、PDGF-BB含量均明显增多(P<0．01),含药血清组比病毒对照组的细胞TGF-β1、PDGF—BB含量显著降低(P<0．01)。结论(1)腺病毒感染可使人胚肺成纤维细胞TGF-β1、PDGF—BB蛋白表达增高;(2)清肺口服液可降低TGF-β1、PDGF—BB细胞因子的蛋白表达,这可能是其抗病毒作用的机制之一。     

大蒜新素预防和治疗鼠巨细胞病毒性肝炎的实验研究

目的　探讨大蒜新素在体内对鼠巨细胞病毒 (m urine cytom egalovirus,MCMV)感染小鼠的预防及治疗作用。方法　建立 BAL B/c小鼠 MCMV重组病毒 (插入 L ac Z基因 )性肝炎模型 ,采用 X- gal染色测定β- gal在肝、肾及肺组织中的表达。 70只雌性 BAL B/c小鼠随机分为大蒜新素预防 +治疗组 (n=2 0 ) ,大蒜新素治疗组(n=2 0 ) ,更昔洛韦治疗组〔6 0 m g/(kg· d) ,n=10〕,安慰剂组 (n=10 )及空白对照组 (n=10 )。其中前两组又各均分为低、高剂量组〔2 5 ,75 m g/(kg· d)〕,检测血浆丙氨酸转氨酶 (AL T)水平和评估肝组织组织学活动性指数(HAI) ,并用原位杂交法检测肝组织中 MCMV DNA水平。结果　大蒜新素预防 +治疗组及治疗组与安慰剂组相比较 ,AL T、肝脏 HAI评分及 MCMV DNA杂交的积分光密度均明显降低 (P<0 .0 5 ) ,与更昔洛韦治疗组相比无显著差异 ;大蒜新素预防用药及加大用药剂量并不能显著降低 AL T、肝脏 HAI评分及 MCMV DNA积分光密度水平。结论　大蒜新素能减轻 MCMV性肝炎模型鼠肝功能损害 ,改善肝脏病理变化和降低肝组织内病毒 DNA负荷量 ,其治疗效果与更昔洛韦无显著差异 ,大蒜新素预防用药及加大用药剂量不能增加其病毒抑制效应。     

大蒜新素体内外抑制小鼠巨细胞病毒感染诱导的调节性T细胞扩增实验研究

目的在体内外水平研究大蒜新素对小鼠巨细胞病毒(murine cytomegalovirus,MCMV)感染导致调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)异常扩增的抑制作用。方法 72只MCMV感染小鼠随机分为安慰剂组和大蒜新素治疗组;并设72只同期模拟感染小鼠为对照,随机分为模拟感染对照组和大蒜新素对照组。分别于大蒜新素处理后1、7、14、28、60、120 d处死小鼠,获得脾细胞待测。采用Western blotting法检测脾细胞中Foxp3的蛋白表达强度;流式细胞术分析CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞在脾细胞中所占比率的变化。采用小鼠胚胎成纤维细胞对大蒜新素的最大耐受浓度处理MCMV感染的胚胎成纤维细胞3 d后,采用Real-time PCR法和Westernblotting法分别检测T细胞中Foxp3 mRNA和蛋白的表达水平。结果整体研究发现,大蒜新素对正常小鼠脾细胞中Foxp3蛋白表达和Treg细胞比率均无显著影响;但是在MCMV感染小鼠,大蒜新素可在感染慢性期显著减少Foxp3蛋白表达强度、降低调节性T细胞比率。体外细胞模型发现,最大耐受浓度的大蒜新素加入共培养体系后可部分拮抗MCMV诱导的Foxp3基因和蛋白表达上调。结论大蒜新素在体内外均可显著纠正MCMV感染导致的Treg异常扩增。大蒜新素通过影响Treg增殖进而增强抗病毒免疫而有利于机体清除CMV病毒,可能是大蒜新素诱导抗CMV免疫的另一重要机制。     

解毒胶囊对人巨细胞病毒抑制作用的体外实验研究

目的　探讨中药解毒胶囊对人巨细胞病毒 (HCMV)的抑制作用。方法　在人胚肺成纤维细胞培养 2 4h后 ,加入HCMVAD169毒株 ,作用 2h后加入不同浓度解毒胶囊观察其对该病毒的抑制作用。结果　解毒胶囊的最大无毒浓度为 15 6mg/L ,最小有效浓度为 39mg/L ,治疗指数为 4。结论　解毒胶囊在体外具有良好的抑制HCMV作用 ,随药物浓度增高作用增强 ,是治疗HCMV感染 (孕妇婴幼儿除外 )安全、有效的药物。     

清肺口服液对RSV感染后人胚肺细胞凋亡相关基因Fas、FasL表达的影响

目的:探讨清肺口服液治疗小儿呼吸道合胞病毒性肺炎的作用机制。方法:采用流式细胞仪检测法,测定不同稀释度含清肺口服液血清对呼吸道合胞病毒(RSV)感染后人胚肺细胞(HELF)凋亡相关基因Fas、FasL转录的影响。结果:清肺口服液可以下调RSV攻击后HELF细胞Fas、FasL的表达水平。结论:清肺口服液对RSV感染后HELF细胞有保护作用。     

铝暴露对大鼠记忆学习的影响及其机制研究

[目的]通过观察慢性铝暴露后大鼠学习记忆行为学、神经生化（ERK含量、磷酸化水平）指标变化,探讨铝影响学习记忆的作用机制,并为中医学“脑主神明”理论提供实验依据。[方法]给大鼠自由饮用不同剂量AlCl3水溶液的方法实行铝暴露,观察大鼠圆形Morris水迷宫学习记忆的行为学表现,蛋白免疫印迹（Western—Blot）方法测定各组细胞外信号调节激酶（ERK1／2）活性及含量变化。[结果]对照组、低剂量组、高剂量组的行为学表现和Western—Blot ERK表达比较有显著差异（P〈0．05）。[结论]中医学“脑主神明”理论是正确的而且铝暴露可以影响大鼠的学习记忆。     

人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物结构分析及活性研究

 目的确证人干细胞因子基因在大肠杆菌表达产物的正确性。方法通过蛋白质杂交，氨基酸末端序列分析，质谱分析及动物体内生物活性的研究，对人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物——重组人干细胞因子(rhSCF)分子进行了鉴定。结果大肠杆菌表达产物rhSCF N端15个氨基酸序列及C端2个氨基酸序列与理论推测一致，产物的相对分子质量为18 583.75，质量肽谱与理论序列的重叠率为98.2%，动物试验亦表明当与粒细胞集落刺激因子(G CSF)联用具有显著的外周血干(祖)细胞动员作用。结论人干细胞因子基因大肠杆菌表达产物与理论推测完全一致，为其中试及临床试验奠定了基础。     

丹参总酚酸对慢性心衰大鼠肌浆网Ca~(2+)-ATP酶、受磷蛋白表达的影响

目的:观察丹参总酚酸对慢性心力衰竭大鼠心肌肌浆网Ca2+-ATP酶(Ca2+-ATPase,SERCA)、受磷蛋白(Phospholamban,PLB)的蛋白表达的影响,探讨丹参总酚酸抗心力衰竭的作用机制。方法:结扎大鼠冠状动脉左前降支造成心肌梗死后慢性心力衰竭模型,连续给予丹参总酚酸4周后,采用蛋白印迹(Western Blot)技术检测心肌组织的SERCA和PLB蛋白表达水平及PLB的磷酸化水平。结果:与心力衰竭模型组相比,丹参总酚酸能明显升高SERCA及磷酸化受磷蛋白(phosphorylated Phospholamban,P-PLB)的蛋白表达及PLB的磷酸化水平。丹参总酚酸能明显降低PLB/SERCA比值。结论:丹参总酚酸能升高SERCA的蛋白表达,升高P-PLB的蛋白表达及PLB的磷酸化水平,降低PLB/SERCA比值,减轻PLB对SERCA功能的抑制,这可能是丹参总酚酸抗心力衰竭的机制之一。