山茱萸CoDXR基因的克隆与分析

目的克隆山茱萸关键酶基因1-脱氧-D-核酮糖5-磷酸还原酶(CoDXR)的全长cDNA序列,为山茱萸的进一步研究提供依据。方法以本实验室获得的山茱萸转录组数据中的转录本序列c147202_g1为模板,通过Primer Premier 5.0设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆CoDXR基因的全长cDNA序列,并通过相关的生物信息学软件对其进行相关的生物信息学分析和功能预测。结果 CoDXR基因长度为1 505 bp,ORF长度是729 bp,编码242个氨基酸。而通过SignalP4.0Server和HMMTOP对CoDXR蛋白预测分析结果可知,该蛋白不具有信号肽和跨膜区,为疏水性蛋白。系统进化树分析结果表明CoDXR蛋白与野茶树(Camelliasinensis)的DXR蛋白序列相似性最高。结论在山茱萸果实和叶片转录组测序的基础上成功克隆了山茱萸萜类合成途径中的关键酶基因CoDXR,对其进行相关的生物信息学分析,为深入研究CoDXR基因在山茱萸萜类合成途径中的功能奠定了基础。     

山茱萸萜类合成途径关键酶HMGR1基因的克隆与分析

目的克隆山茱萸Cornus officinalis HMGR1的cDNA序列并进行生物信息学分析。方法以山茱萸转录组数据中unigenec100572_g1序列为参考,在其开放阅读框两端设计特异引物,经实时荧光定量PCR(RT-PCR)扩增、连接pTOPO-T载体克隆并测序,获得CoHMGR1基因的cDNA序列,并利用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行相关分析。结果 CoHMGR1基因长2 116 bp,含长度为1 338 bp的完整开放阅读框(ORF),编码445个氨基酸,为疏水性蛋白。多序列比对和亲缘关系分析显示,CoHMGR1基因编码的氨基酸序列与喜树的序列相似性较高,达79.56%。结论首次对山茱萸叶片和果实进行比较转录组测序的基础上,成功克隆并分析了CoHMGR1基因,为进一步研究CoHMGR1蛋白的功能及山茱萸萜类合成途径的分子机制奠定基础。     

广藿香香叶基二磷酸合酶基因的克隆及生物信息学分析

目的进一步阐明广藿香(Pogostemon cablin)中萜类生物合成的分子调控机制,从广藿香叶片中克隆单萜化合物合成的关键酶香叶基二磷酸合酶基因PcGPPS。方法根据广藿香转录组PcGPPS基因序列,设计特异性引物,采用RT-PCR技术从广藿香叶片中克隆得到香叶基二磷酸合酶(PcGPPS)基因,构建原核表达载体,并对其进行生物信息学分析。结果该序列为完整开放阅读框,长庶1272bp,编码由423个氨基酸构成的蛋白质。预测蛋白质的分子量为46.3kDa,等电点为5.62,为膜外在蛋白,定位在叶绿体,为非分泌蛋白。系统进化树结果显示,广藿香PcGPPS蛋白与药用鼠尾草和丹参的GPPS蛋白的亲缘关系较近。结论克隆了广藿香PcGPPS基因,为深入研究GPPS基因功能和广藿香萜类生物合成途径奠定基础。     

罗马洋甘菊吉马烯A合成酶基因的克隆与表达分析

目的从罗马洋甘菊Chamaemelum nobile中克隆萜类化合物合成关键酶吉马烯A合成酶(germacrene A synthase,GAS)cDNA全长,并对其进行生物信息学和组织表达分析。方法基于前期对罗马洋甘菊转录组测序结果,设计特异性引物,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增得到GAS的cDNA全长,利用生物信息学手段对其核苷酸和编码的氨基酸序列进行分析,并预测其编码的蛋白质的理化性质和功能。通过实时定量PCR技术(qRT-PCR)检测罗马洋甘菊GAS基因(CnGAS)在罗马洋甘菊不同组织的表达水平。结果扩增得到的罗马洋甘菊吉马烯A合成酶基因的cDNA全长为1 785 bp,命名为CnGAS(GenBank登录号为KU589283),包含1个1 683 bp的开放阅读框(ORF),编码561个氨基酸,预测的相对分子质量和等电点分别为6 470和5.21。CnGAS基因编码的氨基酸序列与其他植物的GAS蛋白高度同源,且含有DDxx D保守序列。系统进化树表明CnGAS基因与菊科植物的GAS基因的亲缘关系最近。qRT-PCR结果显示CnGAS基因在罗马洋甘菊各组织中均有表达,且花中表达量最高。结论从罗马洋甘菊中克隆得到CnGAS基因,分析了该基因在不同组织中的表达水平,为罗马洋甘菊萜类化合物的生物合成代谢途径的研究奠定了基础。     

三七3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶基因的克隆和生物信息学分析

目的克隆三七总皂苷甲羟戊酸合成途径中的1个关键酶3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme-A reductase,HMGR)基因,为进一步研究HMGR蛋白的功能及开展三七皂苷的合成生物学研究奠定基础。方法根据NCBI上已公布的同属人参的HMGR基因全长序列(登录号GU565097.1)设计特异性引物。利用RT-PCR技术,以三七愈伤组织总RNA反转录的cDNA为模板扩增基因片段;并对其编码的蛋白进行生物信息学预测和基因表达分析。结果序列分析表明,获得的三七HMGR(命名为PnHMGR)基因的cDNA序列大小为1 893 bp,该序列与人参、刺五加和杜仲中HMGR基因的一致性分别达到98%、93%、80%,且含有大小为1 725 bp的开放阅读框,经Genbank查询为一新的cDNA。生物信息学预测PnHMGR基因编码蛋白包含2个跨膜区,不含信号肽,具有HMGR催化作用的活性中心结构域。实时荧光定量PCR检测到PnHMGR基因在三七细胞生长30 d表达量最高。结论首次从药用植物三七中克隆得到HMGR基因的编码区序列,为进一步鉴定PnHMGR的功能和开展三七皂苷的合成生物学研究奠定了基础。     

桑黄鲨烯环氧酶基因克隆与序列分析

目的对参与桑黄三萜合成途径的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)进行基因全长克隆和生物信息学分析。方法以桑黄总RNA为模板,采用RT-PCR和RACE技术克隆桑黄SE基因的全长c DNA和DNA序列,并通过Ex PASy在线分析等方法对其进行生物信息学分析。结果序列分析表明,SE基因全长2 145 bp,包含6个外显子和5个内含子;所克隆的c DNA全长为1 856 bp,包含1个1 452 bp的开放阅读框,编码483个氨基酸的蛋白,命名为Ib SE1,预测该蛋白的相对分子质量为5.3×104,等电点(p I)为8.41,无信号肽。结论首次克隆并获得桑黄鲨烯环氧酶基因全长序列,为进一步阐明桑黄三萜代谢途径和改善中药材品质奠定基础。     

鱼腥草乙酰辅酶A酰基转移酶基因克隆、表达及生物信息学分析

目的通过克隆鱼腥草乙酰辅酶A酰基转移酶(acetyl-Co A C-acetyltransferase,AACT)基因c DNA全长,并展开生物信息学分析和表达分析,为解析鱼腥草萜类次生代谢产物的生物合成机制奠定基础。方法采用RT-PCR方法获得AACT基因c DNA序列并进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR方法检测了AACT基因在鱼腥草的地下茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的AACT基因c DNA全长为1 218 bp,编码405个氨基酸。生物信息学预测AACT蛋白不含跨膜区,不含信号肽。AACT基因在鱼腥草地上茎中的表达量最高,达到1.49,其次是地下茎0.96,花和叶中的表达量相对较低,分别为0.20和0.10。结论首次从鱼腥草中克隆了AACT基因,为进一步阐明该基因在鱼腥草萜类化合物代谢途径中的重要作用奠定基础。     

菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的克隆与原核表达分析＊

目的 克隆菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的全长编码序列，利用原核系统表达融合蛋白，为进一步研究该基因在菊花脑萜类合成中的功能提供理论依据。方法 以菊花脑基因组数据为基础，设计特异性引物，PCR扩增CnTPS1的全长编码序列，利用生物信息学分析软件分析序列特征。利用qRT-PCR技术分析CnTPS1基因在不同组织中的基因表达量。构建原核表达载体，体外诱导目的蛋白表达。结果 CnTPS1编码序列全长1749bp，编码582个氨基酸；基因表达模式分析表明该基因在茎和管状花中表达量较高；原核表达系统能诱导出67.58kDa大小的蛋白。结论 首次从菊花脑中克隆得到一个芳樟醇合酶基因CnTPS1，运用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、结构特征等进行了分析预测，分析了该基因的组织表达模式，并在原核表达系统中成功诱导表达出目标蛋白，这些结果将为菊花脑萜类合酶基因的功能以及萜类物质生物合成途径的解析提供理论依据。     

鱼腥草HMGR基因cDNA克隆、差异表达及蛋白质结构分析

目的克隆鱼腥草3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGR)基因并分析其差异表达。方法采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)方法获得HMGR基因cDNA序列并对HMGR蛋白进行理化性质、蛋白二级结构及三维结构预测分析,并预测该蛋白功能;利用RT-PCR方法检测HMGR基因在鱼腥草的地下茎、地上茎、叶、花中的表达情况。结果克隆获得的HMGR基因cDNA全长为1 626 bp,编码541个氨基酸。生物信息学预测HMGR蛋白含2个跨膜区,不含信号肽。HMGR基因主要在鱼腥草的花中表达,其他器官中表达相对较低,地下茎中表达量最低。结论首次从鱼腥草中克隆了HMGR基因,为进一步阐明该基因在鱼腥草萜类化合物代谢途径中的作用奠定基础。     

龙骨马尾杉PcHDR1基因克隆及序列分析

该研究采用RT-PCR方法对龙骨马尾杉Phlegmarirus carinatus(Desv.)Ching 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶[1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase,HDR]基因Pc HDR1的编码区进行克隆并利用生物信息学方法进行序列分析。根据实验室已获得的龙骨马尾杉转录组数据,从中获得1条编码HDR的转录本,采用RT-PCR方法获得该基因的全长c DNA序列,所克隆的Pc HDR1基因编码区长为1 437 bp,编码478个氨基酸残基,Gen Bank登录号为JQ957845。Pc HDR1与银杏Ginkgo biloba的HDR序列同源性最高,达78%。生物信息学预测Pc HDR1蛋白没有跨膜区,具有Lyt B保守结构域,不含信号肽。该研究克隆并获得了龙骨马尾杉Pc HDR1基因的编码区序列,并对其编码的蛋白进行了序列分析及结构域预测,为进一步研究HDR的功能奠定基础。     

温郁金中茉莉酸氨基酸合酶关键基因JAR的克隆及生物信息学分析

目的 克隆温郁金茉莉酸氨基酸合酶关键基因JAR(JA-amino acid synthetase)的全长c DNA序列,并进行生物信息学和表达分析。方法 根据温郁金转录组数据设计特异性引物。以温郁金根茎的c DNA为模板,通过RT-PCR扩增获得JAR全长c DNA序列,利用生物信息学软件预测基因编码蛋白的特征;利用ClustalW和MEGA 6.06软件构建温郁金JAR的系统进化树;构建原核表达载体PET-22B(+)-JAR,纯化重组蛋白JAR5,并进行鉴定。结果 扩增后的基因编码582个氨基酸,全长1749 bp,且具有典型的GH3特征结构域,不具跨膜域,不存在信号肽,属于不稳定蛋白;PCR扩增后得到约1 800 bp大小的片段,经凝胶过滤色谱纯化,最终得到基于蛋白印迹实验(Western blotting)验证正确的66 200大小的重组蛋白。结论 首次克隆并分析了温郁金JAR基因,纯化了JAR5蛋白,为进一步研究温郁金JAR基因蛋白功能研究提供依据。     

山茱萸转录因子CobHLH7基因的克隆及分析

目的克隆山茱萸转录因子Cob HLH7的c DNA序列。方法以转录组数据中unigenec15204_g1序列为参考,在其开放阅读框两端设计特异引物,提取山茱萸果实总RNA,并反转录成c DNA,以此为模板,经RT-PCR扩增、连接pMD19-T克隆载体并测序,获得Cob HLH7的cDNA序列。通过Protparatam、Prot Scale、SOPMA等软件,对其进行生物信息学分析。结果 Cob HLH7的cDNA长度为941 bp,编码266个氨基酸,其相对分子质量为29 220,等电点为6.32。经SOPMA在线软件预测,该蛋白为不稳定蛋白,其高级结构以α-螺旋和无规卷曲为主,含有少量的β-转角和延伸带。多序列比对和亲缘关系比较显示,Cob HLH7氨基酸序列与马铃薯和模式植物烟草的bHLH类转录因子亚家族的ILR3同源性较高。结论在首次对山茱萸叶片和果实转录组测序的基础上,对筛选并预测的可能与环烯醚萜苷合成相关的转录因子Cob HLH7进行克隆与生物信息学分析,为进一步研究其功能奠定基础。     

荆芥1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶基因克隆及生物信息学分析

目的 克隆荆芥1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(1-deoxy-D-xylulose 5-phosphate synthase,StDXS)基因,并进行生物信息学分析.方法 根据荆芥转录组数据获得的StDXS基因序列设计特异性引物,通过RT-PCR技术获得StDXS基因cDNA的全长序列,并进行生物信息学分析.结果...     

三叶青扩展蛋白家族基因全长cDNA的克隆及其生物信息学和表达分析

目的克隆三叶青Tetrastigma hemsleyanum的扩展蛋白家族基因,对其进行器官表达分析,并初步探讨其功能。方法根据Gen Bank中登录的扩展蛋白基因保守区域序列设计1对简并引物,以三叶青球形块根c DNA为模板进行RT-PCR扩增,再结合RACE技术,获得三叶青扩展蛋白基因全长c DNA序列,命名为Th-exp。采用半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析Th-exp基因在不同器官中的表达情况。结果克隆获得扩展蛋白家族基因,共782 bp,其中包含630 bp开放阅读框,编码209个氨基酸(Gen Bank登陆号KP693606)。Th-exp编码的蛋白质具有典型的扩展蛋白结构特征,N端含有8个半胱氨酸的结构域,C端含有4个保守的色氨酸结构域,中间含有组氨酸功能域。Blast分析显示,Th-exp与葡萄、醉蝶花中扩展蛋白基因具有相似性。半定量RT-PCR和荧光定量PCR分析表明,Th-exp在三叶青叶、茎、普通细根和球形块根中均有表达,但球形块根中表达强于其他器官。结论克隆得到三叶青扩展蛋白家族基因Th-exp全长c DNA,初步预测其参与了三叶青块根的发育过程。     

洋常春藤鲨烯合成酶基因HhSS的克隆与表达分析

目的克隆获得洋常春藤Hedera helix鲨烯合成酶基因(HhSS)cDNA全长序列并进行生物信息学分析及表达分析。方法根据洋常春藤转录组数据信息设计引物,通过RACE克隆方法获得HhSS基因序列;采用DNAMAN、PROTPARAM、TMHMM、PSORT、Scan Prosite、SOPMA、SWISS-MODEL等生物信息学工具分析序列信息及编码蛋白的理化特性、结构域等特征;通过实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术进行HhSS基因的检测分析。结果 RACE克隆获得HhSS(Gen Bank登录号KX056078)基因cDNA序列全长1 889 bp,包含一个从248~1 477 bp的完整开放阅读框(ORF)以及247 bp的5’非编码区(5’UTR)和412 bp的3’非编码区(3’UTR)。该基因编码409个氨基酸,相对分子质量为46 800,等电点为5.68。HhSS蛋白具有植物SS蛋白的特征结构域和跨膜区,与刺五加、人参等同科植物亲缘关系较近。qRT-PCR结果表明洋常春藤叶片中HhSS基因的相对表达量与常春藤皂苷含量存在正相关性。结论洋常春藤HhSS基因的成功克隆及表达分析研究,为阐明HhSS基因在常春藤皂苷生物合成途径中的作用及代谢调控研究提供理论依据和技术基础。     

金荞麦黄酮醇合酶基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

目的 克隆金荞麦黄酮醇合酶(FdFLS)基因的编码序列,并对该基因进行序列分析、原核表达及其活性研究.方法 采用同源克隆技术获得FdFLS基因cDNA序列,并对其进行生物信息学分析;构建FdFLS原核表达载体pET-30b(+)-FdFLS,在大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,并测定目标蛋白的酶学活性.结果 FdFLS基因开放阅读框(ORF)全长1008 bp,编码334个氨基酸;FdFLS基因在大肠杆菌中可表达出相对分子量约4×104的蛋白,并具有将二氢槲皮素和二氢山柰酚转化为槲皮素和山柰酚的催化活性.结论 首次克隆到FdFLS基因,并实现该基因在大肠杆菌中有活性的表达.     

人参质体ATP/ADP转运蛋白基因PgAATP1的克隆及表达分析

目的克隆人参Panax ginseng中质体ATP/ADP转运蛋白基因(ATP/ADP transporter protein,AATP),为深入研究其在人参中的生物学功能奠定基础。方法利用人参14个组织部位转录组测序的转录组数据库,通过与NCBI下载的其他植物中AATP的m RNA序列进行本地Blast比对,从中筛选出质体ATP/ADP转运蛋白基因。利用PCR技术克隆获得该基因的全长,通过生物信息学软件分析该基因编码蛋白的信息。利用人参14个组织部位的转录组数据库分析该基因在人参不同组织中的表达模式,并利用实时荧光定量PCR检测茉莉酸甲酯处理条件下该基因的表达模式。结果获得人参AATP1基因全长c DNA,命名为Pg AATP1,该基因长度为1 866 bp,编码621个氨基酸,蛋白质相对分子质量为67 897.23,等电点为9.58。该蛋白与其他物种中的质体ATP/ADP转运蛋白比较类似,分析发现Pg AATP1在人参中所有组织中表达量均比较高,在果肉和叶片中表达量最高。实时荧光定量PCR检测发现Pg AATP1基因在茉莉酸甲酯处理条件下表达持续上调。结论获得Pg AATP1基因全长cDNA序列,该基因在淀粉合成旺盛的组织中表达量较高,且响应茉莉酸甲酯处理。