含IL-24基因重组慢病毒表达载体的构建及其对肝癌细胞生长的抑制作用

目的 探讨白细胞介素(IL)24基因表达目的蛋白IL-24的方法,检测IL-24对肝癌细胞生长的影响.方法 自经5μg/ml植物血凝素(PHA)刺激的正常人单个核细胞(PBMCs)中提取总RNA,RT-PCR扩增出IL-24 cDNA,插入到pHAGE-CMV-MCS-IzsGreen中构建成慢病毒转移载体pHAGE-IL-24,转染HEK 293T细胞.荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GFP)表达;梯度稀释法测定病毒滴度,感染HEK 293T细胞48 h后进行RT-PCR和Western blot检测IL-24的基因和蛋白表达;MTT法检测细胞的增殖.结果 限制性内切酶检测和基因测序证实成功构建了携带IL-24基因的慢病毒表达载体,滴度为5×106TU/ml.以MOI为5.0的重组慢病毒感染靶细胞HepG2 48 h后,能够检测到外源基因IL-24的蛋白表达.IL-24能够抑制肝癌细胞的生长.结论 成功构建了含IL-24基因的慢病毒表达载体,获得的病毒能够有效感染HepG2细胞,并在其中大量表达目的蛋白;IL-24能够抑制肝癌细胞的生长.     

人白细胞介素24真核表达载体的构建及其在HepG2细胞中的表达

目的 构建人白细胞介素24(human interleukin-24,hIL-24)真核表达载体,并在HepG2细胞中稳定表达,为进一步研究其抗肿瘤作用奠定基础.方法 采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),从植物血凝素活化的人外周血单个核细胞中克隆得到hIL-24基因目的 片段.应用DNA重组技术将IL-24PCR产物双酶切后定向克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),转化大肠杆菌DHSα获得重组载体,进行PCR、酶切及测序鉴定.应用脂质体将鉴定正确的重组质粒转染至HepG2细胞,用G418筛选稳定转染细胞株.采用RT-PCR检测稳定转染细胞HepG2中IL-24 mRNA的表达.结果 通过RT-PCR获得与预期大小一致约600 bp的IL-24基因片段;重组载体pcDNA3.1(+)-IL-24经PCR、双酶切及测序证实,IL-24 eDNA片段已正确插入真核表达载体中;在稳定转染的HepG2细胞株中可见到IL-24 mRNA表达.结论 成功构建了hIL-24真核表达载体pcDNA3.1(+)-IL-24,并获得了稳定转染该重组质粒的HepG2细胞株.     

携带白细胞介素2和NK4双基因真核共表达质粒的构建及活性观察

目的 构建同时携带白细胞介素2（IL-2）和NK4基因的真核表达载体（pIRES-IL-2-IRES-NK4）,观察其在防治肿瘤中的潜在应用前景.方法 根据Pubmed上公布的IL-2及NK4 mRNA序列,设计扩增IL-2及NK4 cDNA的特异性引物,以PBV220-IL-2质粒和PCAGGS/hNK4质粒为模板,分别扩增IL-2及NK4基因,并将IL-2及NK4基因分别克隆在真核表达载体pIRES-SEQ的XhoI、MLuI位点和SalI、NotⅠ位点.获得同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4.该重组质粒转染肝癌细胞HepG2后,检测目的基因的转染表达及表达产物对HepG2细胞增殖的影响.结果 通过对构建质粒克隆进行测序及酶切,证实携带IL-2和NK4双基因的真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4构建成功.用pIRES-IL-2-IRES-NK4转染HepG2细胞后24 h后在荧光显微镜下可观察到细胞有较强的绿色荧光表达,48 h时荧光更强;逆转录聚合酶链反应结果表明转染pIRES-IL-2-IRES-NK4质粒细胞的IL-2及NK4基因表达明显增强.酶联免疫吸附测定检测结果表明,转染组细胞较对照组细胞培养上清中IL-2及NK4蛋白表达水平明显增强.转染组48 h后的IL-2、NK4蛋白表达水平为2.139、1.956 mg/L,明显高于未转染组的0.492、0.620 mg/L.四甲基偶氮唑盐法结果表明转染真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4的细胞表达上清,有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,且有剂量效应关系.结论 本研究成功构建了同时携带IL-2和NK4基因的重组真核表达质粒pIRES-IL-2-IRES-NK4,该质粒可有效转染肝癌细胞,且转染细胞表达上清有明显抑制肝癌细胞HepG2增殖的活性,提示该重组质粒有潜在防治肿瘤的应用前景.     

人IL-24基因在CHO细胞中的表达及其抗肿瘤效应

目的构建人IL-24基因真核表达载体,在CHO细胞中进行稳定表达,并检测重组表达蛋白rhIL-24的抗肿瘤活性。方法将测序验证的人IL-24基因亚克隆至真核表达载体pcDNA3,构建重组真核表达载体pcDNA3-hIL-24,转染CHO细胞进行稳定表达,经RT-PCR鉴定后用MTT法、Ho-echst染色和流式细胞术检测CHO细胞表达的rhIL-24诱导A549人肺腺癌细胞凋亡的抗肿瘤效应,用ELISA检测其刺激免疫细胞分泌IL-6和IFN-γ的功能。结果经双酶切和PCR鉴定,重组真核表达载体构建正确,人IL-24在CHO细胞中获得稳定表达,且所表达的人IL-24具有较强的诱导A549人肺腺癌细胞凋亡及上调免疫细胞表达IL-6和IFN-γ的免疫刺激活性。结论人IL-24基因的稳定表达和抗肿瘤效应的实验研究,为进一步研究人IL-24抗肿瘤的分子机制及潜在的应用奠定了基础。     

Claudin-1荧光真核表达载体的构建及其在HepG2肝癌细胞中的表达

目的构建pDsRED1-Claudin-1重组质粒,并在HepG2肝癌细胞中进行表达。方法采用基因重组技术构建含Claudin-1开放读码框(ORF)基因的红色荧光蛋白报告基因载体pDsRED1-Claudin-1。经PCR、酶切和DNA测序鉴定,通过脂质体法转染HepG2肝癌细胞后,进行荧光检测和Western blot分析。结果成功构建真核表达质粒pDsRED1-Claudin-1,转染HepG2细胞后,经荧光检测和Western blot分析可见Claudin-1红色荧光融合蛋白正确表达。结论成功构建含Claudin-1 ORF基因的红色荧光蛋白报告载体,并在HepG2肝癌细胞中正确表达。     

铜绿假单胞菌外排泵MexA蛋白原核表达纯化

目的 构建MexA原核表达载体,并实现MexA原核表达、纯化.方法 从多重耐药的铜绿假单胞菌抽提DNA,经PCR扩增出mexA1基因与PUC18克隆载体连接,PCR、酶切及测序鉴定,再经PCR扩增出mexA基因,酶切纯化后克隆到原核表达载体PQE30,构建重组表达载体PQE30/mexA,PCR及酶切鉴定,IPTG诱导表达,SDS-PAGE、Western blot检测有无蛋白的表达.结果 已获得长约1.5kb PCR产物,酶切结果显示所构建的重组质粒已成功地克隆了mexA基因,序列分析结果与PA01mexA序列相同.SDS-PAGE检测表达产物,在相对分子量40kDa处有表达条带,诱导表达之菌体,超声破碎后,目的蛋白主要以包涵体形式存在.结论 获得mexA基因,并在E.coliM15中成功表达.融合蛋白纯化后作免疫原,为制备多克隆抗体打下基础.     

核糖体蛋白RPS3a腺病毒载体的构建和体外表达

目的 构建核糖体蛋白RPS3a的腺病毒表达载体,并进一步验证其在细胞中的表达。方法 应用RT-PCR从人胚肾HEK293细胞的总RNA中反转录并扩增出RPS3a基因,并将RPS3a亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV中,酶切及测序鉴定后,再将含RPS3a基因的重组穿梭质粒pAdTrack-CMV-RPS3a进行Pme I酶线性化处理,转化到含有骨架质粒的BJ5183感受态菌,进行同源重组。鉴定后,经Pac I线性化转染HEK293细胞,包装重组腺病毒。病毒感染NIH3T3细胞,Western blot 分析RPS3a蛋白的表达。结果 证实pAdTrack-CMV-RPS3a及pAdEas-RPS3a质粒构建正确;Western blot检测病毒感染的NIH3T3细胞总蛋白,与pAd-GFP阴性对照组相比,RPS3a蛋白表达量显著提高。结论 成功构建了能表达RPS3a基因的重组腺病毒载体,为进一步研究其生物学功能奠定基础。     

携带LMO3基因逆转录病毒载体的构建及其在NIH/3 T3细胞中的表达

目的：构建单纯LIM蛋白3（LMO3）的逆转录表达载体,并观察其在 NIH/3T3细胞中的表达情况。方法重组载体pLXSN-LMO3经酶切及测序鉴定后,脂质体法转染到pA317包装细胞,G418筛选稳定的病毒产生细胞株。重组逆转录病毒体外感染NIH/3T3,并对其进行病毒滴度检测,NIH/3T3细胞分为3组：以pLXSN-LMO3转染为实验组,以pLXSN转染为阴性对照组,正常细胞为空白对照组。采用免疫荧光组化染色和蛋白印迹（ Western blot）法鉴定NIH/3T3细胞中LMO3的表达。结果重组逆转录病毒载体pLXSN-LMO3经酶切及测序鉴定构建正确,其病毒滴度平均可达4.04×106 cfu/ml,各组NIH/3T3细胞免疫荧光组化染色及Western blot检测均有LMO3蛋白表达,其中实验组高表达LMO3,与阴性对照组、空白对照组比较差异具有统计学意义（P〈0.05）。结论成功构建了携带LMO3基因逆转录病毒载体,并能在NIH/3T3细胞中高表达LMO3蛋白,为下一步开展基因治疗奠定了基础。     

携带LMO3基因逆转录病毒载体的构建及其在NIH/3T3细胞中的表达

目的构建单纯LIM蛋白3(LMO3)的逆转录表达载体,并观察其在NIH/3T3细胞中的表达情况。方法重组载体pLXSN-LMO3经酶切及测序鉴定后,脂质体法转染到pA317包装细胞,G418筛选稳定的病毒产生细胞株。重组逆转录病毒体外感染NIH/3T3,并对其进行病毒滴度检测,NIH/3T3细胞分为3组:以pLXSN-LMO3转染为实验组,以pLXSN转染为阴性对照组,正常细胞为空白对照组。采用免疫荧光组化染色和蛋白印迹(Western blot)法鉴定NIH/3T3细胞中LMO3的表达。结果重组逆转录病毒载体pLXSN-LMO3经酶切及测序鉴定构建正确,其病毒滴度平均可达4.04×106cfu/ml,各组NIH/3T3细胞免疫荧光组化染色及Western blot检测均有LMO3蛋白表达,其中实验组高表达LMO3,与阴性对照组、空白对照组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建了携带LMO3基因逆转录病毒载体,并能在NIH/3T3细胞中高表达LMO3蛋白,为下一步开展基因治疗奠定了基础。     

中介素真核表达质粒的构建及其在大鼠近端肾小管上皮细胞中的表达

目的构建带有绿色荧光蛋白的中介素(IMD)真核表达质粒pIRES2-EGFP/IMD,并转染大鼠近端肾小管上皮细胞系(NRK-52E)。方法合成带有IMD基因片段的pMD19-TSimple/IMD质粒,将pMD19-TSimple/IMD质粒和pIRES2-EGFP载体双酶切之后进行高效连接,将IMD亚克隆至pIRES2-EGFP上,对重组表达载体进行酶切、测序鉴定。采用FuGENEHD转染试剂转染NRK-52E细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白。提取细胞mRNA和蛋白,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测基因表达,Western检测IMD蛋白表达。结果经限制性酶切鉴定及测序分析证实pIRES2-EGFP/IMD载体序列正确;荧光显微镜下可见转染的NRK-52E细胞有绿色荧光蛋白的表达,经RT-PCR和Western测定分析,转染细胞IMD基因及蛋白的表达增加。结论pIRES2-EGFP/IMD载体构建成功,并在NRK-52E细胞内成功表达。     

人白介素24基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

目的构建含有人白介素24(hIL-24)基因的重组腺病毒载体,为下一步病理性瘢痕的基因治疗研究奠定实验基础。方法采用基因工程技术将hIL-24基因的cDNA亚克隆至穿梭质粒pAdTrack-CMV上,鉴定正确后在PAdEasy系统中进行细菌内同源重组,通过脂质体将正确重组体包裹并转染293A细胞以包装并扩增病毒。采用酶切及PCR方法对重组腺病毒进行鉴定。结果酶切和PCR结果证实hIL-24基因重组腺病毒载体构建成功并可在293A细胞中表达,病毒滴度达107pfu/ml。结论成功构建了有较强感染能力的含hIL-24基因的重组腺病毒载体。     

靶向大鼠血管紧张素转换酶基因的短发夹RNA重组腺病毒载体的构建及鉴定

目的利用AdMax腺病毒载体系统构建大鼠血管紧张素转换酶-短发夹RNA(ACE-shRNA)腺病毒载体并在人胚胎肾-293细胞中扩增制备重组病毒。方法自先期构建的pGenesil-1-ACE-shRNA真核表达载体中用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法扩增出ACE-shRNA片段,并克隆进入穿梭质粒pDC316中,将构建好的穿梭质粒pDC316-ACE-shRNA载体和骨架病毒pBHGlox-E1,3Cre共转染293细胞,包装成重组的病毒颗粒,荧光显微镜观察绿色荧光表达。结果经限制性内切酶,聚合酶链反应(PCR)检测和绿色荧光蛋白(FGFP)表达证实成功地构建了携带ACE-shRNA的重组腺病毒载体并制备出高滴度重组病毒。结论成功地构建了携带ACE-shRNA片段的重组腺病毒载体,为进一步利用基因沉默技术抗高血压的研究奠定了基础。     

Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒的构建及其表达特点

目的：构建Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒，并在Hela细胞中表达以研究蛋白的定位和分泌特点。方法：以pGEM—T—MYOC质粒中MYOC为模板，用PCR介导的定点突变技术，得到Pro370Leu突变型MYOC基因（mMYOC），并定向亚克隆到真核表达质粒pDsRed2-N1上，得到pDsRed2-N1—mMYOC重组表达质粒，再用限制性内切酶消化和DNA测序鉴定，最后用脂质体包埋转染法转染Hela细胞，进行荧光显微镜观察，并用Western Blot分析蛋白分泌情况。结果：经酶切和DNA序列测定，证实重组质粒构建成功，mMYOC基因能在Hela细胞中表达，并且蛋白只定位在细胞质中，经Western Blot分析，mMYOC蛋白不能分泌到培养液中。结论：成功构建Pro370Leu突变型MYOC基因真核表达质粒pDsRed2-N1—mMYOC，并能有效表达，其表达的蛋白定位在细胞质，并且不能分泌。     

Flag-p107真核表达载体的构建及其在ECA109细胞表达及鉴定

目的 构建N端含flag标签的p107的真核表达载体,及其在EC109细胞表达的鉴定.方法 设计引物在p107蛋白N端增加flag标签,通过PCR扩增获得3×flag-p107 cDNA片段,将此片段插入真核表达质粒CMV-MCS-SV40-Neomycin中;再与质粒CMV-MCS-SV40-Neomycin连接,将所得的融合基因进行PCR、酶切及DNA测序验证正确后,利用电转染将其转染至ECA109细胞中;利用Western-Blotting检测融合蛋白CMV-MCS-3flag-p107-SV40-Neomycin的表达情况.结果 重组真核表达载体构建正确,该重组质粒能在ECA109细胞中表达.结论 成功构建真核表达载体CMV-MCS-3flag-p107-SV40-Neomycin并建立了其在ECA109细胞的表达.     

真核表达载体pEGFP-C3-MASH-1的构建

目的构建含小鼠MASH1基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C3-MASH1，为进一步研究MASH1在间充质干细胞神经分化中的作用打下基础。方法应用RT-PCR方法从小鼠13．5d胚胎组织中扩增出两端带有HindⅢ和EcoRI酶切位点的MASH1cDNA编码片段，经回收、纯化、酶切后，依次连接到质粒pGEM-T和pEGFP-C3上。结果酶切及测序结果表明：重组质粒PEGFP-C3含有MASH-Ⅰ片段，方向及大小正确。结论成功构建了小鼠真核表达载体PEGFP-C3-MASH-Ⅰ。     

EB病毒基因Z2A原核表达载体的构建及表达

目的 构建能分泌性表达EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)融合基因Z2A的BCG重组质粒并导入BCG.方法 分别以BCG和EBV融合基因cDNA为模板,通过PCR扩增得到139 bp的BCG-Ag85B信号肽序列和2291 bp的Z2A基因序列.将BCG-Ag85B信号肽序列与大肠杆菌-BCG穿梭表达载体pMV261重组,得到重组质粒pMVS.再将EBV融合基因序列Z2A亚克隆至pMVS中,得到重组质粒pMVZ2A,电转化导入BCG,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对表达产物进行分析.结果 构建的重组质粒pMVZ2A经双酶切、PCR扩增及序列测定证实,克隆基因BCG-Ag85B信号肽和Z2A正确插入载体pMV261.重组质粒pMVZ2A电转化导入BCG后能在BCG中有效表达相应蛋白.结论 构建的重组质粒pMVZ2A能在BCG中表达相应蛋白.这一结果为改造BCG及发展新型抗EBV和结核杆菌的双价疫苗奠定了基础.     

EB病毒基因Z2A原核表达载体的构建及表达

目的 构建能分泌性表达EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)融合基因Z2A的BCG重组质粒并导入BCG.方法 分别以BCG和EBV融合基因cDNA为模板,通过PCR扩增得到139 bp的BCG-Ag85B信号肽序列和2291 bp的Z2A基因序列.将BCG-Ag85B信号肽序列与大肠杆菌-BCG穿梭表达载体pMV261重组,得到重组质粒pMVS.再将EBV融合基因序列Z2A亚克隆至pMVS中,得到重组质粒pMVZ2A,电转化导入BCG,采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳对表达产物进行分析.结果 构建的重组质粒pMVZ2A经双酶切、PCR扩增及序列测定证实,克隆基因BCG-Ag85B信号肽和Z2A正确插入载体pMV261.重组质粒pMVZ2A电转化导入BCG后能在BCG中有效表达相应蛋白.结论 构建的重组质粒pMVZ2A能在BCG中表达相应蛋白.这一结果为改造BCG及发展新型抗EBV和结核杆菌的双价疫苗奠定了基础.