大鼠骨髓间充质干细胞的培养、扩增与鉴定

目的:建立大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)分离及培养的方法,探讨体外培养MSCs的生物学特性.方法:采用密度梯度离心法和贴壁筛选法纯化MSCs,镜下连续观察细胞的形态变化.流式细胞仪鉴定其表面抗原CD29、CD34、CD44和CD45的表达情况.结果:原代MSCs呈集落状生长,细胞呈梭形、纺锤形,呈放射状排列.传代后大都均匀分布生长,细胞生长迅速,倍增时间约45.5 h.流式细胞术鉴定表明,培养的第3代和第5代MSCs CD44、CD29阳性,CD45和CD34阴性.结论:采用密度梯度离心法结合贴壁筛选法可成功分离和培养大鼠的骨髓MSCs,MSCs可以作为组织工程中种子细胞的来源.     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离培养与鉴定

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞(bMSCs)体外分离培养方法及其生物学特性。方法在无菌条件下取SD大鼠股骨、胫骨,采用差速贴壁法分离培养bMSCs,通过传代培养进一步纯化扩增。倒置显微镜下观察细胞形态及生长特征,绘制细胞生长曲线。流式细胞仪测定bMSCs表面标志。结果镜下bMSCs大小均一,呈梭形、多角形成纤维细胞形态,呈旋涡状生长。第3代bMSCs纯度可达97%以上,其细胞表型CD29,CD44,CD105和CD166呈阳性表达,CD34,CD80和CD86呈阴性表达。结论采用差速贴壁法分离培养的大鼠bMSCs纯度高、扩增迅速、生物学特性稳定,是一种较为理想的体外分离扩增bMSCs的培养体系。     

成体大鼠骨髓间充质干细胞的表型研究

目的文献报道大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）不表达CD45,而本实验中却发发现CD45高度表达,针对这一现象做初步分析：方法成体大鼠骨髓MSCs的分离培养,对原代、第3代和第6代细胞做流式细胞仪检测MSCs的表面标记物以及染色体分析。结果体外培养的大鼠骨髓MSCs呈长梭型、有突起,排列成旋涡状。流式细胞仪检测示原代细胞：CD29（99．9％）,CD90（48．5％）,CD45（996％）,CD34（202％）;第3代细胞：CD29（100％）,CD90（97．1％）,CD45（100％）,CD34（089％）;第6代细胞：CD29（99．7％）,CD90（99．6％）,CD45（99．7％）,CD34（0．49％）。上述3代细胞的染色体分析床细胞核型为二倍体。结论体外培养的成体大鼠骨髓MSCs同时表达CD29,CD90和CD45,不表达CD34。     

成人骨髓基质细胞体外培养及其生物学特性

目的：探索体外培养脑出血后遗症患者骨髓基质细胞(BMSCs)的方法及扩增后的生物学特性。方法取脑出血后3个月以上患者髂骨骨髓组织,去除淋巴细胞后采用静置贴壁培养法接种培养,经多次换液纯化。在倒置相差显微镜下观察细胞形态,取第3、6代应用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD29、CD34、CD45、CD105因子的表达。结果倒置相差显微镜下接种48 h后,发现少数细胞贴壁,呈梭形,6~8 d后细胞形成集落。传代后,细胞形态趋于一致,可成漩涡状。流式细胞仪检测显示CD34、CD45阴性,而CD29、CD105阳性。结论体外密度梯度离心法和贴壁静置可以获得大量高度均一的表型符合骨髓基质细胞的细胞。     

大鼠骨髓间充质干细胞的体外分离与培养

目的 建立体外分离纯化及培养扩增大鼠骨髓间充质干细胞的方法.方法 应用全骨髓贴壁培养法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,并进行细胞传代培养.倒置显微镜下观察细胞形态及生长特征,测定细胞生长曲线,通过流式细胞仪检测细胞表面标志物,取第3代细胞分别加入成骨、成脂诱导剂并采用碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色鉴定成骨能力,以油红O染色鉴定成脂能力.结果 获取的大鼠骨髓间充质干细胞形态呈均一成纤维细胞样,并呈集落样生长.传至第3代细胞纯度可达97%以上,其细胞表型CD29、CD44、CD105、CD166呈阳性表达,CD34、CD80、CD86呈阴性表达.经成骨诱导后细胞碱性磷酸酶染色及Von Kossa染色呈阳性,成脂诱导后细胞油红O染色呈现阳性.结论 应用全骨髓贴壁法可以分离培养出高纯度的大鼠bMSCs,培养的细胞扩增迅速、生物学特性稳定,是一种较为理想的体外分离扩增bMSCs的培养体系.     

SD大鼠脂肪干细胞体外分离培养及造血因子表达情况的研究

目的建立一种体外分离和培养大鼠脂肪干细胞的方法,观察其增殖的规律,并探讨其造血因子的分泌情况。方法无菌技术下切取双侧腹股沟皮下脂肪垫,加入0.1%Ⅰ-型胶原酶消化获取细胞,接种入含10%胎牛血清的DMEM培养液,倒置显微镜下连续观察细胞形态变化,并用流式细胞学鉴定CD90、CD34、CD44、CD45、CDl06和CDllb的表达,ELISA法检测造血因子的表达,并作统计学分析。结果原代培养显示培养的脂肪干细胞24 h左右开始贴壁,8 d左右可达90%融合,基本上为梭形成纤维样细胞形态,从第3代开始细胞稳定增殖,15代以前具有活跃的增殖能力。流式细胞学鉴定显示CD44、CD90、CDl06为阳性表达,CD34、CD45、和CDllb为阴性表达,脂肪干细胞能持续的表达G-CSF、GM-CSF、M-CSF、SCF、IL-6,统计学分析提示各代细胞因子的分泌呈缓慢下降趋势。结论成功地建立了一种分离培养大鼠脂肪干细胞的方法,其生长稳定、增殖较快,可以作为组织工程的种子细胞,其稳定的表达多种造血因子,找到了一条促进造血干细胞增殖的新途径。     

大鼠骨髓间充质干细胞的培养及初步鉴定

目的：探讨体外获取高纯度大鼠骨髓间充质干细胞（ BMSCs ）方法以及通过形态学观察BMSCs在培养过程中是否存在自分化现象。方法应用全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSCs ,倒置显微镜下观察细胞形态,直接荧光抗体染色法鉴定培养的细胞,免疫细胞化学方法鉴定其向神经元的诱导分化。结果原代末期及传代的BMSCs呈均一长梭形生长,第三代荧光抗体染色CD29,CD90阳性表达,神经元特异性标记物Nse（神经元特异性烯醇化酶）表达阳性,BMSCs在未加任何诱导剂时培养30d时发生了自分化现象。结论贴壁培养法是一种有效的获得高纯度BMSCs的方法,在体外培养时BMSCs可发生自分化现象。     

硫代乙酰胺促进骨髓间充质干细胞凋亡的研究

目的研究硫代乙酰胺(TAA)对大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的毒性作用。方法体外分离大鼠骨髓间充质干细胞并培养;光学显微镜下观察原代细胞生长的过程;CCK-8检测TAA对BMSCs细胞的生长抑制作用;流工式细胞术法检测细胞凋亡率;免疫印迹法(Western blot)检测凋亡蛋白Bax,Bcl-2,Caspase-3的表达情况。结果分离培养的BMSCs阳性表达CD90,CD29,阴性表达CD45,CD11b/c;与对照组比较,TAA能显著的抑制BMSCs细胞增值,具有明显的时间和剂量依赖性;流式细胞术结果显示TAA能够诱导细胞凋亡;Western blot结果显示TAA能够上调Bax,Caspase-3的表达,Bcl-2的表达下降。结论 TAA对BMSCs具有促进其凋亡的作用。     

C57BL6小鼠骨髓间充质干细胞的分离培养鉴定

目的建立一种简单实用的小鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)体外分离培养方法,为BMSCs的进一步研究和应用提供实验材料和依据。方法采用直接贴壁法和分阶段更换培养基的方法分离纯化BMSCs,显微镜下观察其形态,应用流式细胞技术鉴定细胞表面标记。结果显微镜下BMSCs贴壁生长后呈梭形,形态均一,经流式细胞仪检测第2代BMSCs高表达CD34、Sca-1,不表达CD45。结论本实验方法能简单高效的获得高纯度BMSCs,且细胞生物学特性稳定,适用于对BMSCs的进一步研究和应用。     

多种中药成分诱导大鼠骨髓间质干细胞转变为神经元样细胞

目的　体外定向诱导大鼠骨髓间质干细胞 (MSCs)分化为神经元样细胞。方法　通过贴壁法分离大鼠MSCs,体外扩增培养 ,流式细胞仪检测其表面抗原表达 ,中药成分定向诱导MSCs分化为神经元样细胞。光镜下观察细胞形态 ,免疫细胞化学法检测神经细胞特异性抗原标志。结果　大鼠MSCs可通过贴壁法成功分离并可在体外大量扩增。流式细胞仪检测结果显示CD1 4、CD1 1α、CD34、CD38、CD45、CD80、CD86为阴性 ,CD2 9、CD44、CD90、CD1 0 5、CD1 66呈阳性。黄芪、天麻、人参、当归、脑新舒、人参蜂王浆等多种中药诱导 1～ 3h后大部分MSCs转变为神经元样细胞 ,出现胞体和突起 ,免疫细胞化学染色神经元特异性烯醇酶 (NSE)、巢蛋白 (nestin)呈阳性 ,胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)阴性。结论　多种传统中药成分及中药制剂体外能诱导大鼠MSCs分化为神经元样细胞     

MSCs分离培养及定向分化为血管内皮细胞的研究

目的建立分离和培养大鼠骨髓源间充质干细胞（MSCs）的方法及定向分化为血管内皮细胞诱导条件的优化。方法淋巴细胞分离液（比重1．077g／m1）密度梯度离心法分离单个核细胞（MNC），在含10％胎牛血清L—DMEM培养基中培养，并传代扩增MSCs；选取状态较稳定的第4代细胞，分别用含10％胎牛血清和2％胎牛血清的诱导液（终浓度为10ng／mlVEGF、2ng／mlbFGF的DMEM培养液）继续培养，于第7、14天用流式细胞术分析CD34的表达情况，免疫组化法观察FVⅢ的表达情况。结果密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs，细胞呈均一的成纤维细胞样，流式细胞术分析MSCs结果显示，CD34阳性率为1．01％、CD29阳性率为97．32％；诱导14d后免疫组织化学法检测FVⅢ的表达，10％和2％胎牛血清诱导体系细胞的阳性率分别为12．21％和91．43％。结论密度梯度离心结合贴壁培养法能有效分离纯化MSCs；就诱导效果而言，2％胎牛血清诱导体系明显好于10％胎牛血清诱导体系，说明低浓度的胎牛血清更有利于MSCs向血管内皮细胞分化。     

慢病毒载体介导的bFGF基因转染兔BMSCs的实验研究

摘要： 目的 观察在体外培养条件下, 慢病毒载体介导的碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF） 基因转染对兔骨髓基质干细胞 （BMSCs） 生物学特性的影响。方法 采用密度梯度离心法及贴壁筛选法获取 BMSCs; 利用慢病毒载体将 bFGF 基因转染到 BMSCs 中, 根据转染条件分为 bFGF 转染组、 空病毒组、 未转染组, 转染后分别对 3 组细胞的形态 bFGF mRNA 及蛋白表达、 细胞增殖情况、 细胞周期及碱性磷酸酶 （ALP） 活性进行观察。结果 采用密度梯度离心法和贴壁筛选法, 成功获得高纯度的 BMSCs。载有 bFGF 基因的慢病毒转染 BMSCs 后, 细胞形态无明显变化, 而 bFGF mRNA 与蛋白表达均明显增强、 细胞增殖曲线上移、 增殖期细胞比例增大、 ALP 活性明显增高, 与空病毒组及未转染组比较, 差异均有统计学意义 （P＜0.05)。结论 利用慢病毒载体将兔 bFGF 基因导入体外培养的 BMSCs, 目的基因获得稳定表达, 并且自身过表达的bFGF 可以促进BMSCs 的增殖与成骨分化。     

骨髓间充质干细胞旁分泌HGF体外调控肝星状细胞

目的 探讨大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）与肝星状细胞（HSCs）体外共培养体系中,BMSCs旁分泌肝细 胞生长因子（HGF）对 HSCs 增殖、凋亡、活化的影响。方法 全骨髓贴壁法分离、培养、纯化大鼠 BMSCs,另培养 HSCs。6 孔板半透膜建立上下两层细胞非直接接触共培养体系,实验设 H 组（HSCs 单独培养）、H-H 组（HSCs 与 HSCs共培养）、M-H组（BMSCs与HSCs共培养）、M-H-C组（BMSCs与HSCs共培养并加c-met抑制剂）,各组细胞培 养48 h后,流式细胞仪鉴定BMSCs,检测HSCs凋亡率,MTT法检测HSCs的增殖,免疫荧光共聚焦定量检测HSCs中 α-肌动蛋白（α-SMA）的表达量,ELISA法检测共培养体系上清液中HGF的浓度。结果 MSCs高表达阳性表面分子 CD29、CD90,低表达造血细胞表面标记CD45;BMSCs能明显抑制HSCs的增殖、活化并促进其凋亡,且M-H组上清液 中HGF的浓度明显高于其他组。结论 BMSCs与HSCs共培养过程中,BMSCs通过旁分泌HGF促进HSCs的凋亡,抑 制HSCs的增殖、活化。     

不同年龄兔骨髓间充质干细胞的体外生长特性分析

目的观察不同年龄兔骨髓间充质干细胞(BMSC)在体外分离、培养、扩增的过程,并对其生长特性进行初步比较分析,为BMSC的临床应用提供技术方法和依据。方法选取出生1月、18月、36月的健康中国白兔,分成新生、成年、老年3组,采用密度梯度离心技术及贴壁筛选法相结合,分离培养BMSC,用噻唑蓝(MTT)法观察其增殖及生长特征,用流式细胞仪检测细胞表面标志。结果各组BMSC均贴壁生长,呈成纤维细胞样BMSC典型形态,贴壁率的观察和生长曲线显示,在相同的培养条件下,新生兔细胞增殖最快,细胞可扩增能力最强,而老年兔细胞增殖最慢,细胞可扩增能力最弱,成年兔细胞介于两者之间。结论利用密度梯度离心法结合贴壁培养法可以从不同年龄兔中获得高纯度的BMSC,干细胞的活性和增殖能力随着年龄的增加而降低。     

两种猪自体骨髓间充质干细胞培养方法的比较

目的比较猪应用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合直接贴壁法两种方法分离、纯化、扩增骨髓间充质干细胞(MSCs)的培养效率,为临床应用提供理论依据和实验方法。方法取滇南小型猪的骨髓液用单纯直接贴壁法和密度梯度离心结合贴壁培养法两种方法分离猪骨髓间充质干细胞,体外培养扩增,绘制其生长曲线,通过显微镜观察培养细胞的生物学形状。结果直接贴壁法收集到的细胞扩增速度较慢,密度梯度离心法收集到的细胞扩增速度较快,细胞培养后成梭形。结论密度梯度离心结合贴壁培养法较单纯的直接贴壁法培养骨髓间充质干细胞的培养效率更高。体外培养的猪骨髓间充质干细胞生长稳定,增殖力较强。     

不同浓度胎牛血清对骨髓基质细胞产生细胞因子水平影响的研究

目的通过比较使用不同浓度胎牛血清(FBS)培养的骨髓基质细胞(BMSCs)产生某些细胞因子的量,揭示FBS对BMSCs产生细胞因子是否有影响。方法采用密度梯度离心法分离骨髓单一核细胞,分别使用10%和20%FBS通过贴壁法培养BMSCs,收集传3代后又培养72h的BMSCs及培养上清,用流式细胞仪鉴定细胞表面标志并用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测上清液中白细胞介素(IL)-7、IL-8和干细胞因子(SCF)的水平。结果90%以上细胞表面抗原高表达CD29,而CD34、CD45及HLA-DR表达阴性,即BMSCs纯度在90%以上;两组BMSCs培养上清液中IL-7、IL-8和SCF的水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论胎牛血清对BM-SCs产生细胞因子没有影响。     

骨髓间充质干细胞异体移植对大鼠肝细胞增殖影响的实验研究

目的探讨骨髓间充质干细胞治疗急性肝衰竭的机制。方法全骨髓贴壁法培养扩增原代SD大鼠骨髓干细胞,传代培养,形态学、生长曲线及免疫表型鉴定骨髓间充质干细胞,移植治疗D-氨基半乳糖联合脂多糖致肝衰竭大鼠,观察干预治疗后1d、3d、5d、7d肝组织病理学改变、肝组织PCNA蛋白、CyclinDlmRNA表达量。结果原代培养大鼠骨髓间充质干细胞传代后,形态较均一,为梭形或纺锤形,高表达CD90（94．3％）,CD29（99．4％）,不表达CD11b／c（5．7％）,CD45（3．2％）。骨髓间充质干细胞移植减轻肝脏组织病理损伤（P〈0．05）。BMSCs治疗组PCNA的蛋白表达高于对照组（P〈0．01）。干预后不同时间点治疗组细胞周期蛋白D1的mRNA表达高于对照组（1．182±0．248VS0．468±0．053、0．858±0．114vs0．218±0．178）,差异有统计学意义（P〈0．01）。结论骨髓间充质干细胞移植减轻肝脏病理损伤,上调细胞周期蛋白DlmRNA的表达,促进肝再生,对急性肝衰竭有治疗作用。     

降脂壮骨方剂含药血清对大鼠骨髓基质细胞骨形态发生蛋白-2表达的影响

目的研究高胆固醇血清以及降脂壮骨方剂含药血清干预下大鼠骨髓基质细胞骨形态发生蛋白-2（BMP-2）表达的变化。方法取成年大鼠股骨,用密度梯度离心方法分离大鼠骨髓基质细胞,原代培养细胞至第三代,并用流式细胞仪进行细胞鉴定。选取第三代细胞,随机分为三组。A组正常血清对照组：2％空白血清（体积比）;B组高胆固醇血清损伤组：终浓度为4mmol／L高胆固醇血清;C组中药血清预处理＋高胆固醇血清损伤组：2％中药血清（体积比）预处理2h后＋终浓度为4mmol／L高胆固醇血清。回收细胞提取总RNA,检测BMP-2表达变化,并进行统计学分析。结果与空白血清对照组相比,高胆固醇血清损伤组骨髓基质细胞增殖受抑制;BMP-2的mRNA表达水平降低（P〈0．01）。与高胆固醇血清损伤组相比,中药血清预处理＋高胆固醇血清损伤组骨髓基质细胞生长状态明显改善,BMP-2的mRNA表达水平增高（P〈0．01）。结论降脂壮骨方剂含药血清可以增强高胆固醇血清环境下骨髓基质细胞BMP-2、雌激素受体（ER）,明显改善骨髓基质细胞生长状态,有利于骨质疏松症的治疗。     

应用密度梯度离心法分离扩增兔骨髓基质细胞的体会

目的探讨密度梯度离心法分离培养兔骨髓基质干细胞(BMSc)的条件,为组织工程学选择合适的种子细胞奠定基础。方法采用密度梯度离心法将兔BMSc自小量骨髓中分离并培养,观察其增殖和生长特性,绘制生长曲线,测定分裂指数和贴壁率。结果兔．BMSc在第7代前性状稳定,生长曲线相似;第4天分裂指数最高为15％;传代后10h贴壁率高达90％。结论密度梯度离心法是分离兔BMSc的理想方法,BMSc能为未来组织工程提供足量种子细胞。