成骨细胞在机械力刺激下细胞骨架及细胞形态改变的体外研究

目的:探讨大鼠颅骨成骨细胞(OB)对机械力刺激的反应及细胞骨架F-actin的变化。方法:体外分离培养大鼠颅骨OB细胞;应用四点弯曲加力系统,对第3代细胞施加2000με的机械牵张力,加力时间分别为0h、2h、6h、12h,应用特异性荧光染料分别标记微丝蛋白F-actin和细胞核;在激光共聚焦显微镜下观察并进行形态计量学测量。应用TUNEL法进行原位凋亡检测。结果:在机械张力刺激下,OB荧光强度减弱,F-actin纤维束变得稀疏而排列紊乱;胞核轮廓模糊,并可观察到凋亡小体。定量分析表明,OB的荧光总强度、绿色荧光强度(F-actin)和红色荧光强度(胞核)均显著下降(9<0.05或P<0.01)。TUNEL检测也表明,随着加力时间延长,凋亡细胞数明显增加,但明显少于F-actin发生改变的细胞数。结论:机械牵张刺激可引起OB细胞骨架F-actin解聚和重排,并诱发部分细胞发生凋亡。     

动态张、压应力刺激下人牙周膜成纤维细胞细胞骨架变化

目的:观察不同动态张、压应力刺激下人牙周膜成纤维细胞细胞骨架的变化.方法:用Forcel四点弯曲加载装置对体外培养的人牙周膜成纤维细胞分别施加不同动态的张、压应力(强度为1 000、2 000、4 000 μstrain,加力时间为0、1、2、4、8、12 h),经荧光倒置显微镜观察施加不同动态张、压应力后细胞形态变化,细胞骨架荧光染色强度测定分析细胞骨架F-actin表达量的变化.结果:加力后细胞骨架形态和微丝蛋白发生规律性变化;细胞F-actin荧光染色强度正常→下降→正常;细胞骨架对张、压应力作用的反应敏感程度无明显差异.结论:在一定的张、压应力范围内人牙周膜成纤维细胞细胞骨架的形态结构具有一定的稳定性.     

张应力刺激下人牙周膜成纤维细胞纤连蛋白、整合素、细胞骨架的变化

目的:研究不同动态张应力刺激下体外培养的人牙周膜成纤维细胞纤连蛋白、整合素β1和细胞骨架的变化.方法:刮取牙根中1/3牙周膜组织,采用Ⅰ型胶原酶消化结合组织块贴附法进行人牙周膜成纤维细胞(hPDLF)原代培养并传代.用四点弯曲加载装置,通过对体外培养的hPDLF分别施加不同动态的张应力,采用实时荧光定量PCR法研究机械力对人牙周膜成纤维细胞纤连蛋白和整合素β1亚单位mRNA表达的影响.经荧光倒置显微镜观察施加不同动态张应力后细胞形态的变化.采用SPSS 13.0软件包对荧光定量PCR所得数据取常用对数后行ANOVA分析.结果:张应力的大小及加力时间都对hPDLF纤连蛋白mRNA表达产生影响.加力后,hPDLF整合索β1亚单位mRNA表达下调,这种下调变化与所施加应力大小和作用持续时间相关.机械力刺激越强,整合素β1表达越明显.加力后,细胞骨架形态发生变化.加力前呈梭形,排列呈漩涡状,F-actin纤维粗且分布均匀;加力后,形态不规则,沿力的方向排列整齐,F-actin纤维细且分布不均匀;加力12h后,形态恢复到加力前形态,细胞F-actin荧光染色强度也由正常到下降再到正常.结论:动态张应力刺激在本实验提供的微应力范围内可以促进纤连蛋白、整合素βmRNA表达改变,hPDLF细胞骨架的形态结构也发生一定规律的变化.     

骨髓间充质干细胞对机械张应力刺激的反应及转化生长因子-β和胰岛素样生长因子-Ⅱ的基因表达

目的探讨大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）对机械张应力刺激的反应及力学刺激下转化生长因子-β（TGF-β）和胰岛素样生长因子-Ⅱ（IGF-Ⅱ）基因表达的规律。方法分离培养大鼠骨髓MSCs,应用四点弯曲加力系统对细胞施加单一周期的机械张应力刺激（2 000 με,40 min）。检测MSCs细胞增殖及碱性磷酸酶（ALP）活性,并采用实时荧光定量RT-PCR检测TGF-β和IGF-Ⅱ的基因表达。结果机械张应力刺激下,MSCs的增殖活力、ALP活性以及TGF-β和IGF-Ⅱ的基因表达均显著增高。TGF-β和IGF-II的mRNA水平在加力后瞬时达最高水平;与对照细胞比较,分别增加了51.44和8.92倍。除加力后6 h有少许增高外,TGF-β和IGF-Ⅱ的表达随时间逐步下降,并于加力后12 h恢复到对照组水平。结论机械张应力刺激可促进MSCs增殖,提高其ALP活性,使TGF-β和IGF-Ⅱ基因表达呈时间依赖性上调,并最终诱导MSCs向成骨细胞分化。机械力学刺激是MSCs骨向分化的关键驱动因子,对牵张成骨骨痂形成具有重要的作用。     

张应力下成骨性转录因子在骨髓间充质干细胞中的表达

目的:探讨大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)对单一周期的机械力刺激的反应以及Ets-1、Cbfa1和ALP的基因表达.方法:密度梯度离心法体外分离培养大鼠骨髓MSCs;应用四点弯曲加力系统对细胞施加40 min、2 000μ8的机械牵张力,检测MSCs细胞增殖及ALP活性,并采用实时荧光定量RT-PCR检测Ets-1、Cbfa1和ALP的基因表达.结果:机械力刺激下,MSCs的增殖活力、ALP活性以及Ets-1、Cbfa1和ALP的基因表达均显著增高.Ets-1表达较早,加力后0.5 h达到最高峰;而Cbfa1表达较晚,加力后6 h达到最高峰;ALP的表达与Cbfa1相似.3个基因表达增高均在6～12 h后恢复到正常水平.结论:单一周期的张应力可诱导Ets-1、Cbfa1和ALP在MSCs中呈时间依赖性表达,并促使MSCs短暂性骨向分化.机械力刺激是MSCs骨向分化的关键驱动因子,对牵张成骨骨痂形成具有重要的作用.     

周期性张应力作用下成骨样细胞MG-63中c-fos基因和丝状肌动蛋白相互关系的研究

目的探讨成骨样细胞MG-63中c-fos基因和细胞骨架丝状肌动蛋白（F-actin）的相互关系。方法对MG-63细胞施加周期性张应力,频率为0.5 Hz,细胞应变为2 000 μstrain,按3、6、12 h不同时间段进行加载,采用荧光定量聚合酶链反应（PCR）检测c-fos mRNA的变化,筛选最佳加载时间点,并作为实验组和0 h组进行对比,检测在细胞松弛素D作用下c-fos mRNA和F-actin的表达变化。结果周期性张应力可以诱导c-fos mRNA的表达增加,至3 h达到峰值;在周期性张应力作用下,MG-63细胞中F-actin的结构、排列发生改变,但荧光强度无明显变化;经细胞松弛素D处理后,张应力作用下的MG-63细胞的应力纤维明显减少,F-actin荧光强度降低,c-fos mRNA表达受抑制。结论周期性张应力作用下,F-actin的量并没有明显变化,只是出现了结构上的重组,且重组的是既有的F-actin。F-actin重组是应力诱导c-fos基因高表达的一个重要环节。     

张应力对骨髓基质细胞分化和力生长因子表达的影响

目的探讨张应力加载下骨髓基质细胞力生长因子（MGF）表达的影响及量效关系。方法骨髓基质细胞原代培养后加力不同时间经形态学观察,ELISA检测各组BMSC培养上清中ALP的浓度,Western blot检测加力后骨髓基质细胞MGF的表达。结果机械拉伸刺激下BMSC的形态学特性逐渐发生改变。加载0h、1h、3h、6h、12h、24h位移为1mm,频率为0.5Hz的机械张应力,均可增强BMSC的ALP活性,其中24h时ALP OD值最高（P〈0.05）。Western Blot分析BMSC加力后MGF蛋白的表达,结果为细胞加力后MGF在1h开始有变化,MGF表达水平随加力作用时间延长而增高,组间比较差异有统计学意义（P〈0.05）。结论 MGF可能通过刺激骨髓基质细胞ALP的分泌而促进其向成骨方向分化。     

张应力诱导大鼠骨髓间充质干细胞骨向分化及其差异基因表达分析

目的探讨SD大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）在张应力作用下成骨向分化及其相关基因的差异表达。方法密度梯度离心法体外分离培养大鼠骨髓MSCs;应用四点弯曲加力系统对细胞施加2 000 με的机械牵张力,骨钙素免疫组化染色、碱性磷酸酶（ALP）活力测定MSCs骨向分化,cDNA芯片技术对加力前后MSCs进行mRNA检测,通过芯片杂交、生物信息处理,分析二者间基因差异表达。结果MSCs经应力加载后,其细胞生长曲线与对照组相比差别不大,但骨钙素表达水平和ALP活性显著增高,27 K Rat Genome Array芯片发现,加载前后MSCs表达差异基因共有416条（2.8%）,其中表达增强247条（61条显著增强）,表达降低169条（74条显著降低）。结论张应力可诱导MSCs骨向分化,而差异表达的基因可能在这一过程中起重要作用。     

张应力刺激下Wnt/β-catenin信号通路对成牙骨质细胞Runx2表达调控的体外研究

目的 研究张应力刺激下Wnt/β-catenin信号通路对成牙骨质细胞Runx2表达的调控。方法 以成牙骨质细胞样细胞OCCM30为研究对象,应用FX4000T应力加载装置对其加载张应力,时间为0、3、6、12 h,然后分别使用不同质量浓度的Dikkopf-1（DKK1）处理48 h,采用Western blot法检测β-catenin蛋白的表达水平,实时荧光定量聚合酶链反应法（RT-PCR）检测Runx2 mRNA的表达水平。选取最佳作用时间点（12 h）和最佳阻断剂质量浓度（150 ng•mL-1）,将样本分为A、B、C、D共4组,A组不加力不加阻断剂,B组加力加阻断剂,C组加力不加阻断剂,D组不加力加阻断剂,测量β-catenin蛋白和Runx2 mRNA的表达水平。结果 1）张应力加载3、6、12 h后,Runx2 mRNA表达水平和β-catenin蛋白水平与对照组相比均明显升高,差异有统计学意义（P<0.05）。2）不同质量浓度DKK1处理后,细胞内Runx2 mRNA的表达量呈下降趋势。3）未加载张应力的情况下,DKK1明显抑制了β-catenin蛋白的表达,Wnt/β-catenin通路被抑制;加载张应力情况下,DKK1处理组β-catenin蛋白表达低于未加DKK1处理组;不加阻断剂的情况下,张应力刺激增强了β-catenin蛋白的表达;阻断剂作用后,应力刺激组β-catenin蛋白表达相对较高。结论 机械应力刺激下Wnt/β-catenin信号通路可正向调控成牙骨质细胞Runx2基因的表达。     

Rho信号通路在周期性张应力诱导人牙周膜细胞骨架重排中的作用

目的探讨周期性张应力对人牙周膜细胞（human periodontal ligament cells,hPDLCs）骨架重排的影响及Rho信号通路在其中的作用。方法应用FX-5000T细胞应变加载系统,对体外培养的hPDLCs施加周期性张应力,幅度为10%,频率为0.1 Hz,加载时间为6 h和24 h。以未加载的细胞作为对照组。应用倒置显微镜观察细胞形态变化,细胞免疫荧光染色和共聚焦显微镜观察细胞骨架蛋白F-actin的变化,并应用Western blot检测Rho通路相关蛋白的表达变化。用Rock的特异性抑制剂Y-27632预处理细胞后,在0.1 Hz,10%幅度条件下,加载6 h和24 h,检测细胞骨架蛋白F-actin的变化和Rho信号通路相关蛋白的表达变化。结果与静态组相比,周期性张应力诱导hPDLCs细胞骨架重排差异有统计学意义,Rho信号通路Rock和p-cofilin蛋白表达增加（P〈0.05）。Rock的特异性抑制剂Y-27632可以降低Rock（P〈0.05）和p-cofilin蛋白表达和细胞骨架重排。结论周期性张应力可促进体外培养的hPDLCs细胞骨架重排,Rho信号通路参与了此过程。     

绿色荧光蛋白转基因小鼠骨髓间充质干细胞的多向分化潜能研究

目的　研究绿色荧光蛋白(GFP)转基因小鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)体外定向诱导下的多向分化潜能。 方法　取6周龄GFP转基因小鼠1只,用密度梯度离心法结合贴壁法体外培养获得GFP转基因小鼠骨髓MSCs有 限细胞系(GFP-MSCs)。取第3代GFP-MSCs进行体外多向分化诱导:成骨诱导后进行碱性磷酸酶增殖活性检测及 茜素红钙盐染色;成脂肪诱导20 d后进行油红O染色鉴定;成神经诱导6 h后用免疫组织化学方法检测神经元烯 醇化酶(NSE)的表达。结果　GFP-MSCs经成骨诱导后ALP表达较对照组明显升高,20 d后茜素红染色可见有橘红 色钙盐沉积;经成脂诱导后油红O染色阳性;经成神经诱导后,细胞形态由梭形转变为星状细胞,NSE染色呈强阳 性表达。结论　GFP转基因小鼠骨髓MSCs在体外诱导下具有多向分化能力,对GFP稳定表达无影响,可以作为研 究MSCs多向分化潜能机制的一个有效示踪工具。     

Behavior of transplanted bone marrow-derived mesenchymal stem cells in periodontal defects

BACKGROUND: Recently, there have been an increased number of basic and clinical reports indicating the superior potential of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) for tissue regeneration. In periodontal treatment, previous animal studies indicated that autotransplantation of bone marrow MSCs into experimental periodontal defects enhanced periodontal tissue regeneration. However, mechanisms for periodontal tissue regeneration with MSCs are still unclear. The purpose of this study was to elucidate the behavior of transplanted MSCs in periodontal defects. METHODS: Bone marrow MSCs were isolated from beagle dogs, labeled with green fluorescent protein (GFP), and expanded in vitro. The expanded MSCs were mixed with atelocollagen (2% type I collagen) at final concentrations of 2 x 10(7) cells/ml and transplanted into experimental Class III periodontal defects. Localizations of GFP and proliferating cell nuclear antigen (PCNA)-positive cells were evaluated by immunohistochemical analysis. RESULTS: Four weeks after transplantation, the periodontal defects were almost regenerated with periodontal tissue. Cementoblasts, osteoblasts, osteocytes, and fibroblasts of the regenerated periodontal tissue were positive with GFP. PCNA-positive cells were present in regenerating connective tissue. CONCLUSION: These findings suggest that transplanted mesenchymal stem cells could survive and differentiate into periodontal tissue cells, resulting in enhancement of periodontal tissue regeneration.     

成骨样细胞受力后细胞骨架中微丝形态结构变化的初步研究

目的:探讨成骨样细胞株UMR-106受机械力作用后细胞骨架微丝蛋白F-actin的变化。方法:成骨样细胞株 UMR-106体外扩增,实验组以225@g相对离心力离心10 min后,分7组分别继续培养15、30 min,1、4、6、12、24 h,并设立相应对照组。所有样本经BODIPYFLPhallacidin处理后,在激光扫描共聚焦显微镜下观察、记录图片并测定单个细胞的平均荧光强度。结果:对照组F-actin较粗,呈束状,排列较整齐;实验组除24 h外,其余各组的纤维明显较对照组纤细、短,散乱分布于胞浆内、无方向性;但两组间差异随时间延长逐渐减小。除24 h外,实验组的平均荧光强度较对照组明显降低,差异有显著性;随时间延长,实验组荧光强度逐渐回升,到24 h组时较对照组增强。结论: 成骨样细胞受力后细胞骨架微丝的结构明显变化,荧光染色变弱,表明在机械力作用下微丝结构趋于解聚。去除刺激后随时间延长,实验组逐渐恢复并比对照组增高,说明细胞骨架受力后的改变是可恢复和改建的。     

Effects of equibiaxial mechanical stretch on extracellular matrix‐related gene expression in human calvarial osteoblasts

Mechanical stretch commonly promotes craniofacial suture remodeling during interceptive orthodontics. The mechanical responses of osteoblasts in craniofacial sutures play a role in suture remodeling. Moreover, the extracellular matrix (ECM) produced by osteoblasts is crucial for the transduction of mechanical signals that promote cell differentiation. Therefore, we aimed to investigate the effect of mechanical stretch on cell viability and ECM‐related gene‐expression changes in human osteoblasts. Human calvarial osteoblasts (HCObs) were subjected to 2% deformation. Caspase activity, MTT, and cell viability assays were used to estimate osteoblast apoptosis, proliferation, and viability, respectively. Real‐time RT‐PCR (RT²‐PCR) arrays were used to assess expression of cytoskeletal‐, apoptosis‐, osteogenesis‐, and ECM‐related genes. We found that mechanical stretch significantly increased osteoblast viability and cell proliferation, and decreased the activities of caspases 3 and 7. Moreover, the expression of 18 genes related to osteoblast differentiation, apoptosis, and ECM remodeling changed by more than two‐fold in a time‐dependent manner. Therefore, mechanical stretch promotes HCOb viability and alters expression of genes that are closely related to suture remodeling under mechanical stretch.     

牵引成骨体外模型的建立及成骨细胞骨架的观察

目的建立模拟临床牵引成骨的体外模型，了解不同牵引强度牵引后成骨细胞骨架的改变。方法应用钛合金板材和硅橡胶薄膜研制牵引成骨体外模型，并在激光共聚焦显微镜下观察不同强度牵引成骨细胞24h后，肌动蛋白细胞骨架的原位表达，以及肌动蛋白和微管蛋白α细胞骨架蛋白蛋白质印迹凝胶电泳表达。结果建立的牵引成骨体外模型与临床应用的牵引成骨模式类似；生理性机械牵引力作用于成骨细胞24h后，肌动蛋白细胞骨架蛋白组装，沿受力方向排列；超生理性机械牵引成骨细胞24h后，肌动蛋白细胞骨架出现解聚和崩解，细胞骨架蛋白水平降低。结论牵引成骨体外模型适宜进行牵引成骨体外研究；生理性机械牵引刺激引起肌动蛋白细胞骨架的组装和重新排列，而超生理性机械牵引刺激导致肌动蛋白细胞骨架的解聚和崩解。     

犬自体骨髓间充质干细胞介导HA-TCP修复牙槽骨缺损的实验研究

目的:研究成年犬骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)介导羟基磷灰石磷酸三钙(hydroxyapatite-tricalcium phosphate,HA-TCP)修复犬牙槽骨缺损。方法:用密度梯度离心贴壁培养法分离纯化成年犬的MSCs,将MSCs矿化诱导为成骨样细胞后与HA-TCP支架复合。选取3只成年犬,在876︱678根分歧处分别制备长宽高均为3mm的骨缺损。左侧作为实验组,牙槽骨缺损处植入MSCs-HA-TCP复合物;右侧作为对照组,将HA-TCP植入牙槽骨缺损部位。移植后8周处死实验动物,进行组织学观察,并进行图像分析。结果:实验组新生骨组织占缺损的百分比明显高于对照组,剩余材料占缺损的百分比低于对照组,具有统计学意义(P<0.01)。结论:MSCs介导HA-TCP修复成年犬牙槽骨缺损效果优于单纯的HA-TCP修复犬牙槽骨缺损。     

机械牵张对人成骨样细胞增殖能力的影响

目的：研究机械张力对成骨细胞增殖能力的影响。方法：通过Flexercell细胞拉伸力学装置对人成骨样细胞MG-63施加6％、12％和24％的拉伸应变加载实验，用MTT法检测细胞受力后增殖变化。结果：细胞受不同大小张力作用后，其增殖能力均增强，但以12％拉伸应变率的促增殖作用最为显著。结论:机械张力可以促进成骨细胞的增殖能力，但这种效应可能与细胞所受力值的大小有关。