miRNA-375靶向调控Notch1基因对胰腺癌细胞增殖、迁移的作用机制研究

摘 要：［目的］ 探讨miRNA-375靶向调控Notch1基因对胰腺癌(PAAD)细胞增殖、迁移的作用机制。［方法］ 选取诊断为PAAD并行胰腺外科手术患者60例,取癌组织和癌旁组织行HE染色、免疫组织化学法和免疫荧光检测,采用PCR法检测胰腺癌组织中miRNA-375和Notch1表达量,使用transwall侵袭实验法和MTT试剂盒检测胰腺癌细胞增殖、迁移和侵袭性,采用生物信息学分析和预测miRNA-375调控胰腺癌细胞Notch1的表达。［结果］ miRNA-375表达水平在癌组织（1.00±0.07）与癌旁组织（1.65±0.14）中有显著性差异（P<0.05）;miRNA-375表达水平与肿瘤大小、TNM分期、淋巴结转移和远处转移有关（P<0.05）。qRT-PCR检测显示PANC-1细胞和BxPC-3细胞中miRNA-375 mimics表达水平显著增加（P<0.05）,转染3天后PANC-1细胞和BxPC-3细胞增殖被显著抑制（P<0.05）,抑制率分别为35.93%和27.71%;转染miRNA-375使其表达水平上升可显著抑制PANC-1细胞和BxPC-3细胞的迁移能力。miRNA-375高表达使PANC-1细胞水解基质胶穿透到小室下面的细胞减少35.35%,BxPC-3细胞减少33.04%（P<0.05）。miRNA-375可以调控Notch1D 表达。利用双荧光素酶报告基因法检测miRNA-375与Notch1 mRNA的作用关系,转入突变3′UTR质粒的细胞中荧光素酶活性显著降低（t=5.633,P=0.039;t=5.347,P=0.031）,miRNA-375直接与Notch1 mRNA的3′UTR相互作用。［结论］胰腺癌细胞中miRNA-375靶向调控Notch1表达。miRNA-375/Notch1通路能够抑制胰腺癌细胞的增殖、成瘤及侵袭转移能力,在胰腺癌细胞中发挥抑癌作用。     

miRNA-21抑制剂对骨肉瘤MG63细胞增殖、凋亡和迁移的影响

目的：通过观察miR-21抑制剂对骨肉瘤MG63细胞增殖、凋亡及迁移能力带来的变化,探讨miR-21抑制剂在骨肉瘤细胞生物学行为中的作用。方法：将MG63细胞随机分为实验组、阴性对照组和正常细胞对照组。实验组转染miR-21抑制剂（hsa-miR-21 inhibitors）抑制其细胞内miR-21活性,阴性对照组转染抑制剂阴性对照核苷酸序列（microRNA inhibitor N．C）,正常细胞对照组不做转染。采用MTT比色实验测定三组细胞24h、48h、72h和96h的吸光度（OD）值,并绘制生长曲线。采用流式细胞仪检测细胞凋亡。Tran-swell法检测细胞迁移。结果：两对照组间细胞的增殖速度无明显差异（P＞0．05）,与对照组相比,实验组细胞增殖速度明显减慢（P＜0．05）。实验组细胞凋亡率明显增高（P＜0．05）;阴性对照组、空白对照组之间细胞凋亡无明显差异（P＞0．05）。实验组细胞迁移力受到明显抑制（P＜0．05）。与空白对照组相比,阴性对照组细胞迁移力无明显差异（P＞0．05）。结论：miR-21抑制剂可通过抑制骨肉瘤细胞系MG63细胞内miR-21的活性,显著抑制其增殖能力,促进细胞凋亡和降低迁移。miR-21可能成为骨肉瘤诊治的新靶点。     

土槿皮乙酸对胰腺癌AsPC-1细胞增殖和凋亡的影响

目的:观察土槿皮乙酸（pseudolaric acid B,PAB）对胰腺癌AsPC-1细胞增殖和凋亡的影响。方法:体外培养胰腺癌AsPC-1细胞,用不同浓度PAB作用不同时间后,MTT法检测PAB对AsPC-1细胞增殖的影响,流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果:MTT结果表明PAB以时间和剂量依赖的方式抑制AsPC-1细胞生长,流式结果显示8.0μmol/L PAB处理AsPC-1 24小时后,凋亡率由对照组的8.19%升高至30.86%,差异有统计学意义（P<0.05）,表明PAB可诱导胰腺癌细胞凋亡,呈剂量依赖性。结论:土槿皮乙酸以时间和剂量依赖的方式抑制胰腺癌AsPC-1细胞增殖并诱导其凋亡。     

miRNA-451在宫颈癌中的表达及对宫颈癌Hela细胞增殖与凋亡影响的作用机制研究

目的 探讨miRNA-451在宫颈癌中的表达及对宫颈癌Hela细胞增殖与凋亡影响的作用机制.方法 取60例宫颈癌患者的宫颈癌组织和相应的癌旁正常组织,定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)检测miRNA-451的相对表达量,分析其与宫颈癌患者临床特征的关系.将宫颈癌Hela细胞随机分为miRNA-451-mimics...     

MicroRNA-375表达对大肠癌细胞生物学特性的影响

目的:研究构建miRNA-375慢病毒表达载体并转染结直肠癌细胞,探讨其对结直肠癌细胞生物学特性的影响.方法:采用qRT-PCR法检测结直肠癌细胞株中miRNA-375表达水平.构建FUA-ZMCS-EF1-EGFP-miR-375/inhibitor慢病毒表达载体,建立稳定过表达miRNA-375及其抑制剂的HCT-116亚细胞系,体外观察细胞生长速度并绘制生长曲线,流式细胞仪检测细胞凋亡率,划痕实验检测miRNA-375对HCT-116细胞迁移能力的影响,Western blot法检测miRNA-375对细胞内ERK磷酸化水平的影响.结果:结直肠癌细胞株中miRNA-375低表达不但能促进细胞生长、抑制细胞凋亡,而且能促进细胞内ERK磷酸化水平、增加细胞迁移力和侵袭力.结论:结直肠癌miRNA-375发挥抑癌基因的作用,为miRNA-375在结直肠癌基因诊断及治疗中的应用提供了实验依据.     

表达对胰腺癌CFPAC-1细胞增殖和凋亡的影响

目的:应用慢病毒介导的RNA干扰技术,靶向沉默人胰腺癌CFPAC-1细胞中的EphB2基因的表达,观察EphB2对CFPAC-1细胞增殖和凋亡的影响。方法:构建靶向EphB2基因的siRNA干扰质粒,通过Lipofectamine^TM2000将干扰质粒转染进293T细胞,筛选出能有效抑制EphB2蛋白表达的干扰序列。构建含有效序列的慢病毒载体pLentiGFP-EphB2,感染CFPAC-1细胞,筛选出稳定干扰EphB2蛋白表达的CFPAC-1细胞系。定量PCR、Western blotting检测CFPAC-1细胞中EphB2mRNA和蛋白的表达,CCK8法和流式细胞术检测EphB2下调对CFPAC-1细胞增殖和凋亡的影响。结果:成功构建了EphB2慢病毒干扰载体pLentiGFP-EphB2,获得稳定转染pLentiGFP-EphB2的CFPAC-1细胞（CFPAC-1 EphB2 RNAi）。CFPAC-1EphB2 RNAi细胞中EphB2 mRNA和蛋白表达较空载体组显著降低,EphB2 mRNA的沉默效率为63%。与空载体组和未转染组相比,pLentiGFP-EphB2感染显著促进CFPAC-1细胞的增殖（1.89±0.17vs1.63±0.13、1.71±0.22,P<0.05）,抑制细胞的凋亡[（7.02±1.27）%vs（13.37±1.89）%、（15.71±2.35）%,P<0.05]。结论:pLentiGFP-EphB2可有效下调胰腺癌CFPAC-1细胞中EphB2的表达,促进CFPAC-1细胞增殖和抑制其凋亡。     

基因芯片技术筛选Gemcitabine诱导胰腺癌Panc-1细胞凋亡相关基因的研究

目的研究抗癌药吉斯他滨（Gemcitabine）诱导胰腺癌Panc-1细胞凋亡的相关基因。方法应用基因芯片技术检测50．33μg／mL Gemcitabine作用于胰腺癌Panc-1细胞48h后凋亡基因表达的变化。结果Gemcitabine抑制细胞表达14种凋亡相关基因，包括IRF-4、Scotin、14．3．3gamma、PDE4、GRPS、TID1、AFP、STAT5、Sox-4、c-Rel、MYCN、Htt、CatD、Gd。相反，gemcitabine促进了3种凋亡相关基因的表达，包括CyclinB1、ASK1、AKT2。结论Gemcitabine诱导胰腺癌Panc-1细胞凋亡通过非依赖caspase ASK1途径。     

食管鳞状细胞癌组织中miRNA-375的表达及其临床意义

目的 探讨miRNA-375表达与食管鳞状细胞癌临床病理特征的关系.方法 通过实时荧光定量PCR,检测miRNA-375在67例食管癌及癌旁正常组织的表达.结果 采用循环阈值(△Ct)对miRNA-375在食管癌和癌旁正常组织中表达量进行定量分析,食管癌组织△Ct为9.61±1.52,对应正常组织△Ct为10.86±1.44,其中有80.6％的食管癌组织其表达量低于癌旁正常组织(2-△△Ct＜1).结论 miRNA-375低表达可能与食管鳞状细胞癌的发生、发展、转移相关.     

miR-375和PDK1在胰腺癌组织中的表达及两者的相关性

目的探讨miR-375与PDK1在胰腺癌中的表达及两者的相关性。方法qRT-PCR方法检测胰腺癌组织及胰腺癌细胞系中miR-375、PDK1表达,转染miR-375模拟物上调其在Panc-1中的表达,检测转染后Panc-1中PDK1表达变化。结果miR-375在人胰腺癌组织中表达下调,在Panc-1中表达较HEK293明显降低。PDK1在胰腺癌组织中表达上调,在Panc-1中表达较HEK293明显增高。转染miR-375模拟物上调Panc-1中miR-375表达后,转染组PDK1表达较空白组和阴性对照组均明显下降。结论miR-375在胰腺癌中发挥抑癌基因作用,对PDK1具有负调控作用。     

上调miRNA-145表达对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡及放射敏感性的影响

目的探讨上调miRNA-145表达对非小细胞肺癌细胞增殖、凋亡及放射敏感性的影响。方法收集人正常肺上皮细胞株BEAS-2B和非小细胞肺癌细胞株A549,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测两种细胞中miRNA-145的相对表达量。以Lipofectamine^TM 2000转染试剂将miRNA-145模拟物和阴性对照质粒转染至A549细胞中,分别作为miRNA-145组和NC组,以只加入转染试剂的A549细胞作为对照组,RT-PCR检测各组细胞中miRNA-145的相对表达量。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和流式细胞术(FCM)检测上调miRNA-145表达对细胞增殖和凋亡的影响。给予不同放射剂量X线照射后采用克隆形成实验检测细胞的放射敏感性。结果A549细胞中miRNA-145的相对表达量明显低于正常肺上皮BEAS-2B细胞(P<0.01);转染后,miRNA-145组细胞中miRNA-145的相对表达量高于对照组(P<0.05);转染后,NC组与对照组细胞中miRNA-145的相对表达量比较,差异无统计学意义(P﹥0.05);miRNA-145组细胞转染24、48、72 h的光密度(OD)值均低于对照组(P<0.05);转染48 h后,miRNA-145组细胞的凋亡率高于对照组(P<0.05);2、4、6、8 Gy剂量的X线照射后miRNA-145组细胞的存活分数(SF)均低于对照组,放射增敏比(SER)为1.491。结论与正常肺上皮BEAS-2B细胞比较,A549细胞中miRNA-145的相对表达量较低,上调其表达能够抑制A549细胞增殖,促进细胞凋亡,增强放射敏感性。     

microRNA-155在食管癌中的表达及其对食管癌细胞增殖凋亡的影响

目的 探讨miRNA-155在食管癌中的表达及其对食管癌EC9706细胞增殖及凋亡的影响.方法 采用TaqMan探针实时定量PCR(qRT-PCR)方法检测50例食管癌患者中新鲜食管癌组织和其相应癌旁正常组织中miRNA-155的表达情况;使用脂质体LipofectamineTM2000转染EC9706细胞上调miRNA-155的表达,利用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测转染后细胞的增殖变化,流式细胞仪检测其细胞凋亡率的变化.结果 食管癌组织中miRNA-155的表达水平明显低于与其相应的癌旁正常组织(P=0.000);转染miRNA-155后,miRNA-155转染组EC9706细胞中miRNA-155的表达水平高于对照组和NC组(P﹤0.05);细胞的增殖明显受到抑制,且细胞的凋亡率明显升高.结论 miRNA-155在食管癌组织中呈低表达,上调其表达能够明显抑制食管癌EC9706细胞增殖和诱导其凋亡.     

miR-130a对胰腺癌细胞系PANC-1细胞增殖和凋亡的调控作用及其 机制探讨

目的:研究miR-130a对胰腺癌细胞系PANC-1细胞增殖和凋亡的影响，并探讨其机制。方法:体外培养胰腺癌细胞PANC-1、SW 1990、MIA PaCa-2和正常胰腺上皮细胞HPDE6-C7，检测各细胞中miR-130a表达水平。将PANC-1细胞分为miR-130a低表达组（miR-130a-inhibitor组）、阴性对照组（miR-130a-NC组）和空白对照组（miR-130a-BC组）。转染48 h后，CCK-8试验检测细胞增殖情况；裸鼠皮下成瘤实验检测miR-130a对肿瘤体内生长的影响；流式细胞术检测细胞凋亡情况；TargetScan数据库预测miR-130a的靶基因，并采用蛋白免疫印迹（WB）和荧光素酶报告实验进行验证。结果:PANC-1、SW 1990、MIA PaCa-2人胰腺癌细胞中miR-130a表达水平均显著高于正常胰腺上皮细胞，差异有统计学意义（P<0.05）。转染miR-130a-inhibitor后，PANC-1细胞miR-130a相对表达量显著下调（P<0.05）；与miR-130a-NC和miR-130a-BC组比较，miR-130a-inhibitor组PANC-1细胞增殖能力显著下降（P<0.05）、裸鼠皮下肿瘤体积明显减小（P<0.05）、细胞凋亡率显著升高（P<0.05）。TargetScan数据库显示FOS样抗原1（FOSL1）是miR-130a潜在靶基因，WB和双荧光素酶报告实验证实FOSL1是miR-130a的作用靶点。结论:下调miR-130a表达通过作用于FOSL1基因抑制PANC-1细胞增殖，促进其凋亡，可能为胰腺癌的临床治疗提供新思路。     

乌苏酸联合吉西他滨对胰腺癌PANC-1细胞增殖和凋亡的影响

目的: 探讨乌苏酸联合吉西他滨对胰腺癌PANC-1细胞增殖和凋亡的影响。 方法: 以乌苏酸、吉西他滨单独用药作 用于体外培养的胰腺癌细胞PANC-1细胞,采用细MTT法检测细胞半抑制浓度（IC 50 ）,确定药物给药浓度;以乌苏酸(2 μ mol/L) 、 吉西他滨(0.2 μ mol/L)单独及联合作用于PANC-1细胞,采用锥虫蓝染色法检测PANC-1细胞存活率,PI染色后PANC-1细胞中检 测细胞凋亡,采用细胞划痕实验检测PANC-1细胞迁移和伤口愈合情况,采用Western blotting检测对照组、乌苏酸组与吉西他滨 组单独及联合用药组细胞中P-JNK、Bcl-2、IL-6、P-Stat 3、NF-κB和Cox-2蛋白的表达。 结果: 乌苏酸和吉西他滨对胰腺癌 PANC-1细胞均有较强的抑制作用,其IC 50 分别是13.67和2.78 μ mol/L,据此选择它们的实验浓度分别为2和0.2 μ mol/L。两者联 合用药比分别单独用药能更显著抑制癌细胞的增殖活性[(46.47±5.07)% vs (78.38±8.65)%、(76.12±3.23)%,均P<0.05],能更明显 诱导癌细胞凋亡[(39.78±7.01)% vs (20.35±8.51)%、(20.35±8.51)%,均P<0.01]和抑制细胞迁移能力（P<0.01）,同时更显著抑制凋亡 相关蛋白Bcl-2、IL-6的表达及促进P-JNK的表达。 结论: 乌苏酸和吉西他滨协同增强抑制胰腺癌PANC-1细胞的增殖和迁移以 及促凋亡作用,其机制可能与抑制Bcl-2、IL-6、P-Stat 3和促进P-JNK蛋白表达有关。     

下调TSG101基因表达对胰腺癌细胞系PANC-1增殖的影响

目的：研究通过siRNA下调TSG101的表达对胰腺癌细胞系PANC-1生长、增殖及细胞周期的影响。方法：将合成的TSG101 siRNA片段插入至带有绿色荧光蛋白基因（GFP）的pGenesil-1质粒中,用lipo-fectamine 2000将质粒转入胰腺癌细胞系PANC-1后,Western blot鉴定siRNA对TSG101蛋白干扰效率。然后用MTT、流式细胞术检测TSG101下调的细胞生长、增殖能力及细胞周期的变化。结果：TSG101 siRNA有效下调其在胰腺癌细胞系PANC-1中的表达,下调TSG101基因的表达后显著抑制了PANC-1细胞的生长、增殖能力。与随机对照siRNA及阴性对照细胞相比,MTT分析显示有效转染TSG101 siRNA的细胞从第4天开始增殖能力明显下降（P〈0.05）,流式细胞术分析示细胞周期阻滞在G1期,增殖指数（PI）下降（P〈0.05）。结论：下调TSG101在胰腺癌细胞系PANC-1表达后能够导致细胞周期的阻滞并有效抑制细胞生长、增殖。利用RNA干涉技术下调内源性TSG101表达有望成为一种有效的胰腺癌基因治疗方法。     

miRNA-24通过靶向CARMA3基因调控胃癌AGS细胞的增殖和凋亡

目的:探讨miRNA-24对胃癌AGS细胞增殖和凋亡的影响及其潜在的作用机制.方法:实时定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测不同胃癌细胞株(AGS、MKN74、HGC27)和胃黏膜上皮GES-1细胞中miRNA-24的表达水平.建立miRNA-24过表达的AGS细胞株,采用CCK-8法检测细胞增殖活力,流式细胞术检测细胞周期和凋亡情况,Western blotting检测细胞周期和凋亡相关cyclinD1、CDK2、Bcl-2、p-IκB-α/IκB-α和p-Rb/Rb蛋白的表达水平;双荧光素酶报告基因分析法预测和验证miRNA-24可能的靶基因.结果:3株胃癌细胞中miRNA-24的表达均低于GES-1 cell.转染miRNA-24 mimic(miR-24组)48 h后AGS细胞增殖活力显著低于miR-NC组[(119.62±12.63)％ vs(147.79± 11.89)％,P＜0.05],并出现周期阻滞,且早期和晚期细胞凋亡率明显较miR-NC组上升[早期凋亡率:(11.32±2.27)％ vs (0.57±0.08)％;晚期凋亡率:(15.56±2.27)％ vs (0.85±0.16)％,均P＜0.05].转染miR-NA-24 mimic后,细胞中cyclinD1、CDK2、Bcl-2及p-Rb的蛋白表达水平均较miR-NC组显著降低,p-IκB-α蛋白的表达水平较miR-NC组显著上升.共转染miRNA-24 mimic和miRNA-24可能作用靶点CARMA3基因过表达质粒的miR-24+pcDNA-CAR-MA3组AGS细胞CARMA3蛋白表达较miR-24组明显增加(1.74±0.09 vs 1.03±0.06,P＜0.05).miR-24+pcDNA3-CARMA3组AGS细胞48 h增殖活力较miR-24组显著升高[(137.85±15.34)％ vs(102.31±11.23)％,P＜0.05];而miR-24+pcDNA3-CARMA3组AGS细胞早期凋亡率和晚期凋亡率均较miR-24组显著降低[早期凋亡率:(4.24±0.56)％ vs(11.32±2.27)％,P＜0.05;晚期凋亡率:(6.38±0.63)％ vs(15.56±2.27)％,P＜0.05].CARMA3过表达可部分逆转miRNA-24对胃癌AGS细胞增殖及凋亡的作用.结论:miRNA-24可通过靶向CARMA3基因抑制胃癌细胞的增殖、促进其凋亡.     

HDAC5对胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响

  目的   探讨HDAC5在胃癌细胞中的表达及其对胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。  方法   通过Western blot检测HDAC5和Twist1在胃癌细胞株及正常胃黏膜上皮细胞中的表达。使用MTT及流式细胞术分别检测HDAC5和Twist1对胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响。  结果   HDAC5和Twist1在胃癌细胞株中的表达量均明显高于正常胃黏膜上皮细胞（P < 0.05）。沉默HDAC5的表达可使胃癌SGC-7901细胞中Twist1表达降低,并抑制其增殖、促进凋亡;而过表达HDAC5作用相反（P < 0.05）。此外,沉默Twist1可抑制SGC-7901细胞的增殖、促进其凋亡（P < 0.05）。  结论   HDAC5可能通过上调Twist1的表达水平促进胃癌细胞的增殖、抑制凋亡,从而促进胃癌的发生发展。      

Overexpression of NDC80 is correlated with prognosis of pancreatic cancer and regulates cell proliferation

Aims: NDC80/Hec1, one of four proteins of the outer kinetochore NDC80 complex, is involved in the tumorigenesis of a variety of cancers. In this study, we focused on that NDC80 is overexpressed in human pancreatic cancer and investigates the role of NDC80-knockdown in pancreatic cancer cells proliferation. Materials and methods: We determined the expression levels of NDC80 on both mRNA and protein levels in fresh pancreatic cancer tissues and cells by quantitative real-time polymerase chain reaction and immunoblotting, respectively. Furthermore, protein level of NDC80 was identified using immunochemistry in paraffin-embedded tumor specimen, with correlation between NDC80 expression and various clinicopathological parameters evaluated. The role of NDC80 in pancreatic cancer cells (Panc-1) growth was investigated by lentivirus-mediated silencing of NDC80. The effect of NDC80 deletion on cell proliferation was analyzed by MTT assay and clone formation assay, while cell cycle distributions and apoptosis were analyzed by flow cytometry. Results: The mRNA and protein of NDC80 were overexpressed in pancreatic cancer tissues and cells. The statistical analysis based on immunohistochemical evaluation suggested that NDC80 overexpression was signifi cantly associated with clinicopathological parameters including pathological T staging and N staging, which may be served as an predictor for poor outcomes. The silencing of NDC80 in Panc-1 cells could suppress cell proliferation and colony formation. Furthermore, the NDC80-siRNA infected Panc-1 cells lead to cell cycle arrest at G2/M phase and induction of apoptosis. Conclusion: These results demonstrated that NDC80 plays an essential role in the tumorigenesis of pancreatic cancer, and might serve as potential prognostic and therapeutic target for treatment of pancreatic cancer.