BCSC-1基因异位表达致鼻咽癌细胞CNE-2L2黏附性增强及细胞周期阻滞

目的探讨BCSC-1基因异位表达导致人鼻咽癌细胞CNE-2L2恶性行为减弱的机制。方法采用碘化丙啶染色DNA,流式细胞法检测细胞周期;Hoechest33258染色分析细胞分裂情况;细胞聚集实验检测细胞的黏附性;Western印迹分别检测E-钙黏蛋白、α-catenin和p53的表达。结果细胞周期分析显示异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞、野生型CNE-2L2细胞和转染空载体的CNE-2L2细胞分别有55.1%、43.4%和39.4%处于G0/G1期,分别有25.2%、28.7%和30.9%处于S期,分别有19.7%、27.9%和29.7%处于G2/M期。野生型CNE-2L2细胞和转染空载体的CNE-2L2细胞有较多细胞处于有丝分裂相,异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞几乎见不到有丝分裂相。异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞的黏附性和E-钙黏蛋白、α-catenin及p53的表达水平均高于野生型CNE-2L2细胞和转染空载体的CNE-2L2细胞。结论异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞的黏附性增强可能与E-钙黏蛋白和α-catenin表达增强相关;异位表达BCSC-1的CNE-2L2细胞阻滞于G1期可能与p53表达增加相关。这些变化可能在细胞恶性行为减弱中发挥作用。     

蝎毒抗癌多肽对CNE-2Z细胞生长周期移行和p53表达的影响

目的观察蝎毒抗癌多肽(APBMV)对CNE-2Z细胞生长周期和p53表达的影响.方法采用流式细胞仪双标法.结果APBMV处理CNE-2Z细胞48h后,进入S期的细胞明显减少,处于G1期和G2期的细胞明显增多,APBMV16mg/L处理CNE-2Z细胞48h后,G1期、S期和G2期细胞的百分比分别为59.7%、32.3%和7.9%,空白对照组的百分比分别为53.3%、45.2%和1.5%,二者比较差异有显著性(P<0.01或P<0.001).空白对照组CNE-2Z细胞P53蛋白24h和48h表达量处于较高水平(27.23±0.93)和(31.67±1.75),经APBMV处理24h或48h后,P53蛋白表达量明显下降,与空白对照组相比差异有显著性(P<0.01).结论APBMV能够阻止CNE-2Z细胞周期的移行,并抑制抑癌基因p53的表达.     

腺病毒介导siCD44实验性治疗人CNE-2L2鼻咽癌

目的探讨用siCD44治疗实体瘤的可能性。方法以高表达CD44的人鼻咽癌细胞CNE-2L2为研究对象,用软琼脂集落形成实验和细胞接种裸鼠后成瘤性生长及肿瘤肺转移检测细胞恶性生物学行为。构建Ad5-siCD44,用293细胞包装产生病毒。接种CNE-2L2细胞于裸鼠皮下,待肿瘤长到50～100mm3大小,瘤体内注射Ad5-siCD44,以注射PBS或Ad5-egfp为对照,2周后比较肿瘤的大小和重量。结果CD44表达抑制致细胞的恶性生物学行为明显受抑。瘤体内注射PBS、Ad5-egfp和Ad5-siCD442周后,肿瘤的平均体积分别为(3.139±0.850)、(3.612±0.888)和(1.512±0.742)cm3,实验组与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。3组的平均瘤重分别为(2.28±0.73)、(1.83±0.26)和(1.20±0.64)g,实验组与对照组相比差异有显著性(P<0.05)。结论瘤体内注射Ad5-siCD44对CD44高表达的鼻咽癌细胞CNE-2L2所生成的肿瘤有一定治疗作用。     

高效小鼠CD40siRNA基因片段的筛选及对淋巴细胞CD40基因表达的影响

目的: 应用RNA干扰技术筛选高效小鼠CD40siRNA基因序列片段.方法: 体外化学合成小鼠CD40基因为靶标的siRNA 3对(siCD40-1、siCD40-2、siCD40-3),通过脂质体瞬时转染小鼠脾淋巴细胞(实验组),并分别以转染无关siRNA片段及未转染细胞作为对照(对照组).分别采用流式细胞术、实时荧光定量PCR检测转染24 h细胞表面CD40抗原、CD40 mRNA表达,蛋白质印迹检测转染48 h蛋白表达的变化.结果: 与对照组相比,实验组CD40抗原表达、CD40 mRNA及蛋白表达明显下降(P<0.01);3对实验组siRNA能明显抑制CD40基因表达,抑制率分别为69%、78%和41%,差异有统计学意义(P< 0.05).而各对照组之间比较差异无统计学意义(P>0.05).结论: siRNA可抑制小鼠淋巴细胞表达CD40,并具有良好的特异性,其中siRNA-2为最高效干扰片段.     

小檗碱体内外对人鼻咽癌细胞CNE-2生长的抑制作用

目的观察小檗碱体内外对人鼻咽癌CNE-2细胞生长的影响,探讨小檗碱的抗肿瘤作用机制。方法MTT法测定小檗碱对CNE-2细胞生长的抑制作用;流式细胞仪检测小檗碱对CNE-2细胞凋亡和周期的影响;透射电镜观察CNE-2细胞经小檗碱处理后凋亡形态变化;Westernblotting法检测小檗碱对CNE-2细胞的细胞周期相关蛋白(cyclin)B1、CDK1、cdc25c表达的影响;3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)和3H-亮氨酸(3H-Leu)标记前体掺入法检测小檗碱对CNE-2细胞DNA和蛋白质合成的影响;利用荷人鼻咽癌的裸鼠模型验证小檗碱的体内抗肿瘤作用。结果小檗碱能抑制CNE-2细胞生长,48h的半数抑制浓度(IC50)为(49.5±5.8)μmol/L,72h的IC50为(13.3±2.0)μmol/L;小檗碱能抑制CNE-2细胞DNA和蛋白质合成;小檗碱能诱导CNE-2细胞凋亡,细胞经过25.0μmol/L小檗碱处理48h后的凋亡指数为(48.9±10.4)%;50.0μmol/L小檗碱能诱导CNE-2细胞G2/M期阻滞,并且下调细胞周期相关蛋白B1、CDK1、cdc25c表达;小檗碱能抑制人鼻咽癌CNE-2细胞在裸鼠体内的生长,30mg/kg剂量组的肿瘤体积中位数为317.9mm3,明显低于对照组(P<0.05)。结论小檗碱体内外均能抑制人鼻咽癌CNE-2细胞的生长,其抗肿瘤作用可能与其诱导细胞周期阻滞和凋亡,下调相关细胞周期蛋白有关。     

RNA干扰靶向DNMT1基因对乳腺癌MCF-7细胞和RASFF1A基因的影响

目的：RASSF1A基因在乳腺癌MCF-7细胞的表达及其对乳腺癌MCF-7细胞周期和凋亡的影响.方法：DNA重组技术合成针对人乳腺癌MCF-7细胞DNA甲基转移酶1（DNMT1）基因3条siRNA（siRNA1,siRNA2,siRNA3）,以脂质体2000做为载体将其转入人乳腺癌MCF-7细胞,采用RT-PCR法检测DNMT1mRNA的表达,选择特异性较高的siRNA并以此为标准建立10,30,50nmol/L,3个浓度梯度,采用WesternBlot检测RASSF1A基因的蛋白表达,选出最低且有效浓度已达到基因抑制的最适浓度.采用流式细胞仪检测siRNA抑制DNMT1前后细胞周期和凋亡率的变化.结果：siRNA成功转染了人乳腺癌MCF-7细胞,转染率达到80%;3对siRNA中siRNA2特异性较高;WesternBlot检测终浓度为30nmol/L的siRNA抑制效率较高;细胞周期大部分停滞在G0/G1期,抑制细胞增殖分裂,细胞凋亡率增加.结论：通过RNA干扰可以抑制DNMTI的表达,从而逆转由于启动子高甲基化沉默的抑癌基因RASSF1A的表达,最终抑制乳腺癌细胞的生长.为肿瘤基因治疗提供依据.     

白杨素对人鼻咽癌细胞CNE-2增殖的抑制作用

探讨白杨素对人鼻咽癌细胞CNE-2增殖的抑制作用及机制。采用CCK-8法检测细胞存活率,Hochest 33258染色检测细胞形态变化,流式细胞仪检测细胞凋亡率及细胞周期的变化,caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3的活性。结果表明白杨素对CNE-2细胞的生长具有较强的抑制作用,并具有明显的量-效关系;白杨素可诱导CNE-2细胞凋亡,使G0/G1期细胞明显增多,S期明显减少,使细胞周期被阻滞于G0/G1期;白杨素可升高CNE-2细胞caspase-3的活性。白杨素对CNE-2细胞生长有明显的抑制作用,其机制可能与白杨素诱导的细胞周期阻滞和细胞凋亡有关。     

CD40发夹siRNA真核表达质粒与siRNA表达框架对CA46细胞CD40表达的影响

目的 构建人类CD40膜蛋白siRNA真核表达质粒，观察其能否抑制CA46细胞CD40表达。方法 合成2条编码发夹siRNA序列的单链DNA，克隆到pSilenCircle载体中，构建成含目的基因片段的重组质粒——siCD40／pSilenCircle，在polⅢ U6基因启动子控制下表达siRNA。同样方法构建相对应的编码反义RNA以及无关基因的重组质粒anticD40／psilencircle和siFly／psilen Circle，以作比较和对照。PCR制备CD40-SECs（CD40-siRNA表达框架）。以脂质体FuGene6为介质瞬时转染CA46细胞，利用流式细胞技术检测细胞膜CD40的表达。结果 （1）成功构建了CD40发夹siRNA真核表达质粒siCD40／pSilen Circle、CD40反义RNA真核表达质粒anticD40／psilencircle和无关基因重组质粒siFly／psilencircle；（2）PCR成功制备CD40-SEC；（3）与siFly／pSilencircle转染组相比较，siCD40／pSilenCircle、anticD40／pSilencircle和CD40-SEC转染组的CA46细胞CD40的表达均明显减少。结论 CD40发夹siRNA真核表达质粒siCD40／pSnencircle和CD40-SEC可有效地抑制CA46细胞CD40分子的表达。RNA干扰技术可望作为一种有效的调控基因功能的工具。     

三苯氧胺对人脑胶质瘤细胞SHG-44增殖的影响

目的研究三苯氧胺（TAM）对人脑胶质瘤细胞SHG-44增殖的影响并探究其可能机制。方法将不同浓度TAM和脑胶质瘤细胞作用,分别用细胞划痕法、3H-TdR掺入法、流式细胞仪和免疫组化法检测细胞转移能力、细胞DNA合成情况、细胞周期改变和细胞凋亡率及雌激素受体的表达情况。结果TAM在体外能明显抑制SHG-44细胞转移,抑制细胞DNA合成,且抑制作用呈浓度依赖性。流式细胞仪显示细胞经TAM处理后,表现为G0/G1期和G2/M期细胞所占比例增加,而S期细胞所占比例减少。用0、2、10μmol/LTAM处理时细胞凋亡率分别为（2.05±0.28）%、（7.66±0.52）%和（19.00±0.77）%,SHG-44细胞不表达雌激素受体。结论TAM可能通过改变细胞周期和诱导细胞凋亡来抑制脑胶质瘤细胞SHG-44的生长。     

粉防己碱对人乳腺癌细胞 MDA - MB -435S的作用

目的：探讨粉防己碱（Tet）对雌激素受体（ER）阴性人乳腺癌 MDA - MB -435S 细胞的作用。方法 MTT 方法检测 Tet 对 MDA - MB -435S 细胞体外生长的影响。用碘化丙啶单染流式细胞术测定法检测 Tet 对 MDA - MB -435S 细胞周期的影响。结果 Tet 对 MDA - MB -435S 细胞生长的抑制作用随着 Tet 浓度的增加、时间的延长而增大,Tet 剂量与时间之间存在交互作用（P ﹤0.01）。Tet 作用于 MDA - MB -435S 细胞24 h 后,G0/ G1期细胞比例均显著增多,随 Tet 浓度增加,G0/ G1期细胞比例增多;S 期、G2 M 期细胞比例均明显降低,并且随 Tet 浓度增加,S 期、G2 M 期细胞比例降低。结论 Tet 对雌激素受体阴性乳腺癌细胞系 MDA - MB -435S 增殖有明显抑制作用,且存在浓度和时间依赖性。Tet 阻滞 MDA - MB -435S 细胞于 G0/ G1期,降低 S 期比例,抑制 DNA 合成是其抑制乳腺癌细胞生长的机制之一。     

PTEN基因诱导人脑胶质瘤SHG-44细胞凋亡及bcl-2表达下调

目的 探讨PTEN基因对人脑胶质瘤SHG－44细胞凋亡及凋亡相关基因bcl-2表达的影响，阐明PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的机制。方法PTEN基因体外转染SHG－44细胞，筛选阳性细胞克隆，以原位杂、免疫组化方法检测PTEN基因的表达情况；采用透射电镜、流式细胞仪和核DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞的凋亡情况；以免疫荧光法检测bcl-2基因的表达。结果 PTEN基因转染的SHG－44细胞有PTEN蛋白的表达。透射电镜下可见转染PTEN基因后细胞核染色质浓缩边集、胞质浓缩、核破裂及凋亡小体形成等典型的凋亡表现；流式细胞仪显示细胞周期从G1期到S期发生抑制，并且在G1期峰前出现一明显的凋亡峰（15．9％）；细胞核DNA琼脂糖凝胶电泳呈现凋亡细胞特有的梯状条带；bcl-2的表达也显著下调。结论 PTEN基因可诱导SHG－44细胞凋亡，并下调bcl-2蛋白的表达，这可能是PTEN基因抑制肿瘤细胞增殖的分子机制之一。     

A study on apoptosis of nasopharyngeal carcinoma cell line induced by Tanshinone II A and its molecular mechanism]

OBJECTIVE: To assess effect of Tanshinone II A on the apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell line CNE-1 and inquire into the mechanism there in involved. METHODS: The CNE-1 cells cultured in vitro were treated with 0.5 microgram/ml Tanshinone II A for 4 days. The morphology of the cells was observed by microscopy. The cell growth and proliferation were measured by cell counting. The DNA break was examined by gel electrophoresis. The cell cycle, apoptosis index (AI) and the expression of apoptosis associated gene were analysed by flow cytometry. RESULTS: 0.5 microgram/ml Tanshinone II A could induce the apoptosis of CNE-1 cells. In the treatment group, the morphologic characteristics of apoptotic cells were observed, the DNA of cells presented "ladder" break, the cell growth and proliferation were inhibited obviously, and the AI was 16.9% (the AI of control group was 6.4%). The cells were arrested in G0/G1 phase and cellular DNA synthesis was inhibited. The expressions of apoptosis associated gene fas, bax, p53 and p21 were up-regulated; the expression of bcl-2 was down-regulated. CONCLUSION: Tanshinone II A can induce apoptosis of human nasopharyngeal carcinoma cells. Its molecular mechanism may relate to modulation of the apoptosis associated gene expression.     

血管内皮生长因子干扰RNA对人鼻咽癌CNE一2Z细胞VEGF表达调控的实验研究

目的：研究血管内皮生长因子（VEGF）的特异性小片段干扰RNA（siRNA）对低分化人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF表达的抑制作用，为鼻咽癌的治疗提供新的途径。方法：体外培养人鼻咽癌细胞CNE-2Z，并分成正常氧状态培养组（20％）和低氧（1％）培养组。采用脂质体（LF2000）将VEGF siRNA转染两组细胞，并采用RT—PCR、ELISA检测鼻咽癌细胞在正常氧状态和低氧状态下VEGF mRNA和蛋白质表达的差异。结果：与未转染组和转染空载体组相比，在正常氧和低氧状态下，VEGFsiRNA均能明显抑制VEGFmRNA的表达（P〈0．01）；正常氧状态下VEGFsiRNA的抑制效率比低氧状态高。正常氧状态下：未转染组、转染空载体组、转染VEGFsiRNA组CNE-2Z细胞培养上清液中VEGF165的含量分别为：423．92、419．68和328．86pg／mL；低氧状态下VEGF165的含量分别为：813．62、799．89和500．96pg／mL，转染VEGF siRNA组VEGF的表达下调。结论：VEGF siRNA能有效地、特异地抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF mRNA和蛋白质的表达，因而有望成为治疗鼻咽癌的一种有效方法。     

血管内皮生长因子干扰RNA对人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF表达调控的实验研究

目的研究血管内皮生长因子(VEGF)的特异性小片段干扰RNA(siRNA)对低分化人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGF表达的抑制作用,为鼻咽癌的治疗提供新的途径。方法体外培养人鼻咽癌细胞CNE-2Z,并分成正常氧状态培养组(20%)和低氧(1%)培养组。采用脂质体(LF2000)将VEGFsiRNA转染两组细胞,并采用RT-PCR、ELISA检测鼻咽癌细胞在正常氧状态和低氧状态下VEGFmRNA和蛋白质表达的差异。结果与未转染组和转染空载体组相比,在正常氧和低氧状态下,VEGFsiRNA均能明显抑制VEGFmRNA的表达(P<0.01);正常氧状态下VEGFsiRNA的抑制效率比低氧状态高。正常氧状态下:未转染组、转染空载体组、转染VEGFsiRNA组CNE-2Z细胞培养上清液中VEGF165的含量分别为:423.92、419.68和328.86pg/mL;低氧状态下VEGF165的含量分别为:813.62、799.89和500.96pg/mL,转染VEGFsiRNA组VEGF的表达下调。结论VEGFsiRNA能有效地、特异地抑制人鼻咽癌CNE-2Z细胞VEGFmRNA和蛋白质的表达,因而有望成为治疗鼻咽癌的一种有效方法。     

莱菔硫烷对鼻咽癌RASSF1A基因甲基化及表达的影响

目的探讨莱菔硫烷（SFN）对鼻咽癌CNE-2细胞RASSF1A甲基化及蛋白表达水平的影响。方法体外培养鼻咽癌CNE-2细胞,用0,5、10、30μM的SFN与其孵育24～96h,用MTT法检测细胞的增值情况;流式细胞术分析细胞周期的改变;采用甲基化特异性PCR检测RASSF1A基因启动子区域的甲基化改变情况;提取SFN处理后细胞的RNA,用逆转录PCR检测RASSF1A的表达水平,并用Western blot检测处理前后RASSF1A蛋白的表达。结果 SFN能以时间和剂量依赖性方式抑制CNE-2细胞增值,并能使细胞周期阻滞于S期和G2/M期。随着SNF浓度的增加,甲基化RASSF1A水平逐渐减弱,非甲基化RASSF1A水平逐渐增多。同时SFN能明显上调RASSF1A的mRNA和蛋白表达水平。结论 SFN能使RASSF1A基因去甲基化,并上调非甲基化基因的表达水平,从而抑制细胞的增值和分化而具有抗肿瘤的效应。     

尼妥珠单抗对鼻咽癌CNE-2细胞放射敏感性的影响

目的 初步探讨尼妥珠单抗对鼻咽癌CNE-2细胞的放射增敏作用.方法 MTT法检测尼妥珠单抗对CEN-2细胞的半数抑制浓度（IC50）,集落形成实验计算细胞存活率,多靶单击模型拟合细胞存活曲线并计算放射增敏比,流式细胞仪检测尼妥珠单抗联合放疗的凋亡率及细胞周期分布.结果 尼妥珠单抗对CNE-2细胞有增殖抑制作用,24h IC50为945μg/ml,0.2×IC50及0.3×IC50剂量下的放射增敏比分别为1.26和1.38,尼妥珠单抗联合放疗组凋亡率、G0/G1期细胞比例较对照组增多（P＜0.05）.结论 尼妥珠单抗联合照射可提高鼻咽癌CNE-2细胞的放射敏感性并阻碍细胞增殖、促进凋亡和干扰细胞周期分布.     

冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞株CNE-2细胞的放射增敏作用

目的:观察冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞株CNE-2细胞的放射增敏作用,并探讨其可能机制。方法:用克隆形成实验计算药物的放射增敏比,流式细胞仪法分别检测、比较单纯药物组、单纯照射组、联合治疗组各组的细胞周期变化。结果:冬凌草甲素的放射增敏比为1.227,流式细胞仪法分析显示,联合治疗组的细胞周期变化以G2/M期阻滞为主(45.2%),与单纯药物组、单纯照射组比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:冬凌草甲素对人鼻咽癌细胞株CNE-2细胞具有一定的放射增敏作用,其机制可能与改变细胞周期有关。     

干扰AURKA基因表达对人骨肉瘤细胞系U2-OS细胞增殖与细胞周期的影响

目的:探讨AURKA基因表达下调对骨肉瘤细胞增殖和细胞周期分布的影响?方法:脂质体瞬时转染法介导AURKA 小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)处理骨肉瘤U2-OS细胞, 采用实时荧光定量PCR及 Western blot方法检测转染前后AURKA mRNA和蛋白表达,CCK8实验检测细胞活力变化,流式细胞术检测细胞周期分布变化,Western blot检测周期相关蛋白的表达,5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)细胞增殖实验检测细胞增殖情况?结果:AURKA siRNA作用U2-OS细胞后, AURKA mRNA和蛋白的表达水平较正常对照组及阴性对照组显著降低,且差异有统计学意义 (P < 0.05),两对照组间AURKA表达无明显差异;下调AURKA表达后,细胞活力降低,且作用72 h后抑制率最高,约为(36.63 ± 2.38)%;细胞周期中S期细胞比例下降,G2/M期细胞比例增加,与正常对照组及阴性对照组相比差异有统计学意义(P < 0.05),提示存在G2/M期阻滞,S期细胞增殖率下降(P < 0.05),周期相关蛋白D1(Cyclin D1)表达水平下降(P < 0.05),周期相关蛋白B1(Cyclin B1)表达水平明显增加(P < 0.05)?结论:下调AURKA表达可抑制骨肉瘤细胞U2-OS的增殖, 同时导致细胞阻滞于G2/M期?