反义bcr/abl寡核苷酸诱导K562细胞凋亡时Caspase3表达及活性的变化

用反义bcr／abl寡核苷酸片段诱导K562细胞凋亡,观察Caspase3表达及活性变化,以阐明Caspase3在慢性髓性白血病(CML)发病机制中的作用。方法用反义bcr／abl寡核苷酸片段AS和对照无义片段NS处理CML急变细胞系K562,检测细胞凋亡及Caspase3表达和活性的变化。结果K562细胞经AS处理72h,流式细胞仪检测未见亚二倍体细胞增多。原位末端标记法显示AS组24h始出现细胞凋亡增多,72h达高峰,为(78.50＋6.60)％,较对照组(18.21土3.32)％及NS组(24.13土4.17)％明显增多(P     

Bcr—abl特异性系列核酶体外切割活性比较及诱导K562细胞凋亡？…

构建单、双及三单位核酶、鉴定其体外切割活性及对Ｋ５６２生物学特性的影响,探讨核酶用于基因治疗的前景。方法首先针对ｂｃｒ－ａｂｌ融合位点设计并合成３个单核酶,耐后通过基因重组构建单、双及三核酶载体,以体外切试验鉴定并比较其活性。     

三氧化二砷诱导K562细胞凋亡的初步研究

目的：探讨三氧化二砷治疗慢性粒细胞性白血病（ＣＭＬ）的机制。方法：以ＣＭＬ细胞系Ｋ５６２为模型，通过细胞增殖、活力检测，形态学观察，肿瘤集落形成的琼脂糖凝胶电泳等检验。结果：经≥２．５μｍｏｌ／ＬＡｓ２Ｏ３处理的Ｋ５６２细胞可出现增殖受抑和凋亡的形态学改变及ＤＮＡ片段化。结论：Ａｓ２Ｏ３能有效地诱导Ｋ５６２细胞凋亡。     

慢性粒细胞白血病特异性bcr—abl三核酶体外转录载体的构建及鉴定

0引言her－abl融合基因编码的具有异常蛋白酪氨酸激酶活性的P210蛋白，是导致慢性粒细胞白血病（。hronicmveloidleukemia，CML）发生的主要原因．针对her－abl的核酶能有效抑制PZ10蛋白的合成，诱导CML细胞凋亡，是CML基因治疗的新思路．有关核酶及多核酶治疗CMI。的试验研究国内尚未见报道．成功构建了her－abl单核酶、双核酶及三核酶体外转录载体，为今后透选特异、高效的核酶载体，进一步开展CML的试验治疗奠定基础．互材料和方法1．l材料pGEM－3Zf载体购自华美公司，核酶基因单链由上海生工生物工程有限公司合成．1．2质粒提…     

bcr/abl基因特异性小干扰RNA对K562细胞增殖凋亡和SH2肌醇磷脂酶基因表达的影响研究

目的 通过小干扰RNA（siRNA）沉默K562细胞bcr/abl基因使SH2肌醇磷脂酶（SHIP）基因表达增加,探讨SHIP基因缺失对K562细胞增殖凋亡的影响及机制。方法 构建bcr/abl基因的化学合成siRNA,并转染到K562细胞,分为转染特异性siRNA实验组、转染非特异性siRNA对照组、空白对照组。Western blotting法检测转染后K562细胞p210表达量,实时荧光定量PCR（FQ-RT-PCR）检测各组细胞中SHIP mRNA表达量;Western blotting法检测SHIP、磷酸化蛋白激酶B 308（p-Akt308）和磷酸化蛋白激酶B 473（p-Akt473）的表达量;MTT比色法检测K562细胞增殖率;流式细胞仪检测K562细胞凋亡率;酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测核因子（NF）-κB活性。结果 转染特异性siRNA实验组K562细胞p210表达量、p-Akt308表达量、p-Akt473表达量较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低,SHIP mRNA表达量、SHIP表达量、细胞凋亡率较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组升高（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组K562细胞p210表达量、SHIP mRNA表达量、SHIP表达量、p-Akt308表达量、p-Akt473表达量、细胞凋亡率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。第1天、第3天、第5天转染特异性siRNA实验组K562细胞增殖率较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组K562细胞增殖率比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。第3天、第5天转染特异性siRNA实验组NF-κB活性较空白对照组和转染非特异性siRNA对照组降低（P＜0.05）;空白对照组与转染非特异性siRNA对照组NF-κB活性比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。结论 SHIP基因表达受bcr/abl基因的调控,SHIP表达缺失可能是K562细胞过度增殖和凋亡减少的重要因素。     

芸香诱导K562细胞凋亡时细胞色素C表达变化

【目的】研究芸香诱导白血病K562细胞凋亡过程中细胞色素C的表达。【方法】体外培养K562细胞,Hoechst33342/PI双荧光染色后,荧光显微镜下观察细胞核形态,分离细胞线粒体和胞浆,经SDS-PAGE电泳分离蛋白,Western Bloting检测线粒体、细胞浆细胞色素C表达。【结果】芸香浓度为2×10-5、4×10-5、8×10-5mol/L时,细胞生长受到显著抑制,并呈剂量依赖性;Hoechest33342/PI双荧光染色可观察到明显核固缩、凝集等细胞凋亡表现,Western Bloting检测4×10-5mol/L药物处理细胞后线粒体细胞色素C表达水平下调,细胞浆出现明显细胞色素C蛋白条带。【结论】芸香诱导白血病细胞发生凋亡,可能与线粒体途径有关。     

清毒饮对K562细胞bcr/abl mRNA基因表达的影响

目的 观察不同药物浓度清毒饮对人白血病细胞株K562细胞bcr/abl基因表达水平的影响,为临床应用清毒饮提供依据.方法 制备不同药物浓度清毒饮(5、10、20 mg/mL)含药血清并处理K562细胞48 h,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量RT-PCR技术分析各组培养细胞bcr/abl mRNA表达的水平.结果 清毒饮中、高2种浓度清毒饮含药血清与对照组比较,对人白血病K562细胞株bcr/abl融和基因表达水平具有显著影响,差异有统计学意义(P<0.05,0.01),且呈浓度依赖性.结论 清毒饮具有抑制人白血病K562细胞株bcr/abl mRNA表达的作用,提示清毒饮具有从分子水平抗肿瘤细胞增殖的效应.     

胃溃疡愈合与Caspase3的表达及细胞凋亡的关系研究

目的:探讨胃溃疡愈合与Caspase3及凋亡的关系.方法:采用原位末端标记(TUNEL)法和免疫组化SABC法,检测溃疡愈合前后胃黏膜组织中细胞凋亡和Caspase3的表达.结果:溃疡愈合后胃黏膜组织中Caspase3的表达减弱,与愈合前相比较差异有统计学意义(P＜0.01);与此同时,溃疡愈合后胃黏膜上皮细胞凋亡指数明显下降,与愈合前相比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论:Caspase3过表达促进胃黏膜上皮细胞凋亡,导致胃溃疡发生,并影响其愈合.     

慢性粒细胞性白血病bcr/abl融合基因的表达

目的：研究慢性粒细胞性白血病患者bcr／abl融合基因阳性率及其临床意义。方法：取慢性粒细胞性白血病(CML)患者骨髓或外周血，提取单核细胞的总RNA，用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)，观察其ber／abl基因的表达。结果：9例CML患者中，8例ber／abl基因阳性，占88.9％。结论：bcr／abl基因检测可以用来辅助CML的临床诊断。     

丹参酮ⅡA诱导NB4细胞凋亡时Caspase3活性变化

目的：研究Caspase3在丹参酮ⅡA(TanⅡA)诱导NB4细胞凋亡过程中的变化及与凋亡的关系。方法：通过细胞形态学、DNA含量分析及DNA片段比率，证实TanⅡA是否可诱导NB4细胞凋亡，用荧光分光光度仪检测Caspase3活性及N-乙酰-天冬氨酸-谷氨酸-颉氨酸-天冬氨酸-7氨基-4甲基-香豆素(AC-DEVD-AMC)行Caspase3抑制试验探讨细胞凋亡与Caspase3间的关系。结果：TanⅡA可诱导NB4细胞凋亡，并伴有Caspase3活性增高。AC-DEVD-乙醛(AC-DEVD-CHO)可抑制TanⅡA诱导NB4细胞凋亡。结论。TanⅡA诱导NB4细胞凋亡可通过激活Caspase3而实现。     

抗bcr/abl mRNA特异性核酶作用于靶基因的细胞内外切割实验

目的 将已构建的具有抗慢性粒细胞性白血病(CML)融合基因bcr／ablmRNA的含核酶载体，进行细胞内外实验，了解抗bcr／ablmRNA核酶的切割效应。方法 含有抗靶基因的真核表达载体pAVGS4经酶切后，其中抗CML核酶M1-GSRNA的DNA序列被构建到pUCl9上得到pGS210，并经酶切和测序鉴定；合成bcr／abl融合位点前后的一段靶序列，克隆到pGEM-7zf( )上得到Pbcr-abl经测序鉴定，将pGS210和pbcr-abl进行体外转录，获得M1-GS RNA及其作用底物，将两者混合、孵育，通过放射自显影术检测切割的效果；将pAVGS4转染到CML细胞株K652细胞内，通过RT-PCR方法了解核酶对于目标RNA的作用效应。结果 Pbcr-abl经酶切电泳及测序证实载体中含有目标序列，M1-GSRNA作用于底物后，放射自显影术检测显示底物RNA被有效切割。pAVGS4转染到K562细胞48和72h后，RT-PCR显示bcr／ablmRNA被有效切割。结论 pAVGS4可以有效地切割K562细胞内的bcr／ablmRNA，预期可作为CML池分子靶向治疗的工具。     

Caspase8、3蛋白在PUVA诱导K562细胞凋亡时的变化

目的研究Caspase8、3蛋白在补骨脂素（PSO）加长波紫外线（UVA）光化学疗法（PUVA）诱导人白血病K562细胞凋亡时的变化。方法用不同浓度的中药补骨脂中提取的PSO和（或）不同照射时间、波长为360nm的UVA作用于K562细胞,检测细胞凋亡率、在电镜下细胞超微结构改变及Caspase8、3蛋白的表达,用多因素方差分析法对定量资料进行统计分析。结果PSO、UVA照射及PUVA均可使细胞凋亡率增加,后两者上调Caspase8、3蛋白的表达,PUVA的作用显著强于前两者;PUVA处理后的K562细胞超微结构出现明显的凋亡形态学改变。结论PUVA可通过激活Caspase8、3基因诱导K562细胞凋亡。     

硫化砷诱导K562细胞凋亡

研究硫化砷（Ａｓ２Ｓ２）对Ｋ５６２细胞凋亡的诱导作用。采用Ｋ５６２细胞体外培养，应用流式细胞仪（ＦＣＭ）分析细胞周期，鉴定凋亡细胞，检测线粒体膜蛋白Ａｐｏ２．７的表达。结果显示：Ａｓ２Ｓ２能够诱导Ｋ５６２细胞凋亡，使细胞周期中的Ｓ期细胞减少，Ｇ２／Ｍ期细胞升高，提示：Ａｓ２Ｓ２具有促凋亡效应。     

用DNA-PCR方法于基因组水平检测K562细胞及慢性粒细胞白血病患者bcr/abl融合基因

目的：在慢性粒细胞白血病（慢粒）细胞系K562及慢粒患者中尝试基于DNA水平的bcr／abl融合基因检测方法。方法：以Waller的“L—T DNA PCR”方法为基础，并针对其引物位置设计的缺陷，改进设计了一套DNA—PCR引物，分别提取K562细胞及慢粒患者外周血单个核细胞DNA，进行bcr／abl融合基因扩增，并对扩增片段进行序列测定。结果：运用DNA—PCR方法成功地扩增出了K562细胞及2名CML患者外周血基因组的bcr／abl融合基因片段，随后进行的片段测序进一步明确了融合基因的断裂位点。结论：DNA—PCR提供了一种基于基因组DNA水平的新检测手段，结合测序能鉴定融合基因的断裂位点，若结合定量PCR的方法则能监测患者的治疗效果与预后，还能检测患者经化疗后的残留微小病灶。     

雄黄诱导K562／ADM细胞凋亡的研究

探讨雄黄诱导多药耐药细胞Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞凋亡的能力,并初步探讨其分子机制,方法：采用荧光标记形态学观察,流式细胞仪进行ＤＮＡ分析及测定细胞表面ｐ－ｇｐ的表达。结果显示：雄黄能明显诱导Ｋ５６２／ＡＤＭ细胞凋亡,且在４８ｈ后ｐ－ｇｐ的表达下调。     

PUVA诱导K562细胞凋亡时对Fas表达的影响

目的探讨补骨脂素（PSO）加长波紫外线（UVA）光化学疗法（PUVA）诱导人白血病细胞K562凋亡时对Fas表达的影响。方法以K562细胞为研究对象,以细胞凋亡率、电镜下细胞超微结构改变以及细胞Fas基因表达水平、蛋白表达水平为检测指标,观察中药补骨脂中提取的PSO加波长为360 nm的UVA对人白血病细胞诱导凋亡的作用以及部分作用途径,并采用多因素方差分析法进行统计学处理。结果（1）单纯PSO、单纯UVA照射及PUVA均可诱导K562细胞发生凋亡,PUVA的作用显著强于前两者。（2）电镜下观察经PUVA处理后的K562细胞超微结构,可见明显的凋亡形态学改变。（3）单纯PSO、单纯UVA照射及PUVA均可上调K562细胞Fas基因表达水平,PUVA的作用显著强于前两者。（4）单纯PSO、单纯UVA照射及PUVA均可上调K562细胞Fas蛋白表达水平,PUVA的作用显著强于前两者。结论（1）PUVA可诱导白血病细胞K562发生凋亡,作用强于单纯PSO及单纯UVA照射。（2）PUVA诱导K562凋亡的途径之一为上调K562细胞Fas基因表达水平。