自噬在hAMSCs促进血管新生作用的初探

目的：：通过构建人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)与人脐静脉内皮细胞(hUVECs)3D共培养体系,探讨自噬与血管新生的相关性。方法：使用蛋白酶和胶原酶消化法及胶原酶消化法提取hAMSCs和hUVECs。通过流式细胞仪、免疫荧光及多向分化实验鉴定hAMSCs和hUVECs。通过3D成管实验观察0、3、6、12、24、48、72 h hAMSCs-hUVECs(共培养)组及hUVECs(单培养)组中hUVECs出芽的长度及面积,检测各时间点中反应自噬水平的蛋白ATG5、Beclin-1、LC3Ⅱ表达水平。结果：流式细胞仪检测发现,hAMSCs中间充质细胞表面分子标志呈阳性表达,造血干细胞及血管细胞相关的表面分子标志呈阴性表达;hUVECs中CD34呈阳性表达,CD45呈阴性表达。免疫荧光检测发现,hUVECs细胞膜上表达CD31,胞浆中表达抗血管性血友病因子(vWF)。多向分化实验证实hAMSCs具有向成骨细胞、成脂细胞及成软骨细胞分化的潜能。3D成管实验中共培养组在12 h以后出芽的长度及面积均高于单培养组,共培养组ATG5表达水平在3、6 h高于单培养组,共培养组Beclin-1表达水平在0、3、6 h高于单培养组,共培养组LC3Ⅱ表达水平在0、3、6、12 h高于单培养组。结论：本研究发现hAMSCs可以促进血管新生,并证明其促进作用与共培养体系建立早期的胞内自噬水平增高密切相关。     

异种脱细胞真皮基质对新生血管作用的研究

目的：探讨不同异种脱细胞真皮基质对内皮细胞血管生成的促进作用。方法：利用人脐静脉内皮细胞（ HUVEC）,与猪脱细胞真皮基质（ P?ADM）和牛脱细胞真皮基质（ B?ADM）共培养,以Bio?Gide可吸收生物膜和空白组作对照,ELISA法分别检测细胞接种4、6、12、24、48、96 h共培物上清中血管内皮生长因子（ VEGF）的含量;GFP慢病毒转染于HUVEC后,在倒置相差显微镜下计数共培物上细胞管型的数目。结果：在细胞接种24 h时,ADM组与Bio?Gide组和空白组比较VEGF的浓度更高（ P＜0．05）;48 h时P?ADM组VEGF的浓度高于与Bio?Gide组和空白组（ P＜0．05）。转染GFP慢病毒的HUVEC与生物膜共培养6～48 h时,B?ADM组细胞管型多于P?ADM组和Bio?Gide组;24 h内,P?ADM组多于Bio?Gide组;空白组未见明显管型。结论：P?ADM与B?ADM比Bio?Gide具有更好的成血管作用,且B?ADM效果更明显,提示异种ADM有较好的促新生血管的作用,可作为替代物应用于膜龈手术。     

槲皮素对血管内皮细胞的作用及其机制研究

目的: 观察不同浓度槲皮素对人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）生物学特性的影响,探讨槲皮素抑制血管生成的机制。方法: 应用不同浓度槲皮素处理细胞,在不同时间点,采用CCK-8法检测槲皮素对HUVECs增殖能力的影响;采用细胞划痕实验、基质胶体外成管实验检测槲皮素对HUVECs迁移及形成管腔能力的影响;采用实时荧光定量PCR检测槲皮素对HUVECs中血管内皮细胞因子（VEGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）mRNA表达的影响;采用Western免疫印迹法检测HUVECs中AKT信号通路相关蛋白表达的变化。采用 SPSS 17.0 软件包对数据进行单因素方差分析和Tukey post-hoc分析。结果: 槲皮素能抑制HUVECs的增殖;与对照组相比,槲皮素处理后,HUVECs细胞迁移及形成管腔结构的数量明显减少,抑制作用呈剂量依赖性。槲皮素能抑制HUVECs中VEGF、bFGF mRNA的表达,抑制HUVECs中AKT相关信号通路。结论: 槲皮素抑制HUVECs增殖及体外血管形成能力,其机制部分通过AKT相关信号通路介导。     

牙本质胞外基质对人血管内皮细胞增殖的影响

目的：探讨牙本质胞外基质成分(dentine extracellular matrix components，DM)对血管内皮细胞增殖的影响。方法：用100g／L EDTA，在pH7．2和蛋白酶抑制剂存任的条件下，从健康人牙中提取DM。第3代人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell，HUVEC)，存含有不同浓度DM培养液中培养8d，每2天计数1次，绘制生长曲线。并对第8天对照(不含DM培养)与实验组的细胞数进行Mann—Whitney统计分析。结果：HUVEC在DM浓度为0.0001、0．001和0．01mg／mL的培养液中培养时较对照分别增长了49％(P=0．0006)、21％和9％，在DM浓度为0.1和1mg／mL时，减少22％和74％(P=0．0003)。结论：DM对血管内皮细胞增殖具有计量依赖型影响效应。低浓度DM可刺激内皮细胞的增殖，而高浓度DM则可抑制该细胞的增殖。提示：这一计量依赖型效应可能正是牙髓损伤后造成局部不同的血管形成方式，并最终导致不同修复结果的原因。     

VEGF 165基因转染HUVEC促进大鼠血管生成的实验研究

目的:探讨VEGF 165基因转染脐静脉内皮细胞(HUVEC)移植在体内促进血管生成的能力。方法:常规复苏HUVEC后体外培养,经缺陷性腺病毒介导VEGF 165基因转染HUVEC。大鼠背部建立缺血皮瓣模型,实验组(10只),将VEGF 165基因转染的HUVEC移植于皮瓣局部;对照组(10只),移植未转染基因的HUVEC;空白组(10只)注射等量生理盐水。分别检测皮瓣存活率、外周血血清中VEGF浓度,行HE染色及CD31的免疫组化,并计算各组皮瓣微血管密度(microvessel density,MVD)。结果:不同时期,实验组外周血中VEGF浓度明显高于其他两组(P<0.05);对照组和空白组各个时期血清中VEGF浓度无明显变化(P>0.05)。皮瓣术后11 d,各组皮瓣存活率分别为实验组(72.5±4.7)%、对照组(45.8±3.6)%、空白组(32.4±1.7)%,3组皮瓣存活率比较差异有统计学意义(P<0.05)。HE染色及CD31免疫组化染色结果显示,实验组中毛细血管密度远大于其他两组(P<0.05)。结论:VEGF 165基因转染的HUVEC,移植在体内,具有显著地促进血管生成能力。     

干细胞因子促进共培养DPSCs与HUVECs的成血管能力

目的 探讨干细胞因子（stem cell factor,SCF）对共培养的牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）和人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）成血管能力的影响。方法 本实验研究已通过单位伦理委员会审查批准。实验分为HUVECs组、SCF+HUVECs组、DPSCs+HUVECs组、SCF+DPSCs+HUVECs组。将SCF与培养液混合,制备成SCF浓度为100 ng/mL的混合培养液,按1∶5的比例将DPSCs和HUVECs在体外进行共培养。通过CCK-8增殖实验观察每组细胞在第1、3、5、7天的增殖能力,细胞划痕实验和Transwell迁移实验分别检测SCF对直接或间接共培养条件下细胞迁移的影响,采用基质胶管形成实验检测各组细胞血管生成能力,通过ELISA检测每组细胞培养上清液中血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)的浓度,Western blot检测CD31、CD34和VEGFA的蛋白表达水平。结果 ...     

脐静脉内皮细胞与牙本质浸提液诱导的牙髓干细胞共培养成血管的研究

目的:探讨共培养牙本质浸提液(dentin extract, DE)诱导的人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells, hDPSCs)和人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)在成血管方向的潜能。方法:制备人牙本质浸提液,分别诱导培养hDPSCs 7 d和14 d后,Real-time PCR和Western blot检测诱导后hDPSCs中牙本质涎蛋白(DSP)、牙本质涎磷蛋白(DSPP)和牙本质基质蛋白1(DMP-1)的表达;血管形成实验共分为5组,分别是:HUVECs组、DE诱导后的hDPSCs组以及按5∶1、5∶5、5∶10比例共培养HUVECs和诱导后hDPSCs组,分别在第3、6、9h检测各组小管形成的相对长度和节点数目。结果:DE诱导的hDPSCs 在mRNA和蛋白水平上表达的DSP、DSPP和DMP-1显著提高(P＜0.05);体外小管形成实验结果示共培养组较早形成稳定的网状结构,在3 h时,HUVEc与诱导后hDPSCs比例为5∶1组形成的小管相对长度和相对分支点数明显高于HUVECs组(P＜0.05),而5∶5组和5∶10组低于HUVECs组(P＜0.05)。结论:牙本质浸提液诱导后的hDPSCs与HUVECs按一定比例共培养可促进血管结构的形成。     

基于人源性成骨细胞的预血管化细胞膜片构建研究

目的:探索新的体外构建血管网络的方法以解决工程化骨组织预血管化的问题。方法:冻存颌骨来源成骨细胞(human osteoblasts, HOBs)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)用0,5,25,50μg/mL四氧化三铁纳米颗粒(Fe₃O₄ MNPs, magnetic nanoparticles)孵育;CCK-8试剂盒、普鲁士蓝染色检测不同浓度Fe₃O₄ MNPs对冻存颌骨来源HOBs和HUVECs生长、内吞的影响。采用50μg/mL Fe₃O₄ MNPs孵育HOBs和HUVECs,第0,1,3天用活/死细胞双染色试剂盒检测细胞存活情况。采用50μg/mL Fe₃O₄ MNPs孵育HOBs和HUVECs不同时间(0,30 min, 1 h, 2 h)后,N41超磁铁皿底吸引,鬼笔环肽(phalloidin)细胞骨架染色检测HOBs和...     

人成骨细胞与脐静脉血管内皮细胞直接混合培养的实验研究

目的探讨人成骨细胞(MG-63)与人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)共同培养后,对成骨细胞功能的影响。方法取MG-63与人HUVECs直接联合培养于培养皿中,通过对人成骨细胞内碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OC)定量测定,观察HUVECs对人成骨细胞功能的影响。结果人成骨细胞与HUVECs直接联合共培养后,两种细胞均生长良好,人成骨细胞内ALP活性和OC定量测定结果,共培养组明显高于对照组。结论HUVECs在体外与人成骨细胞直接联合共培养中,有促进人成骨细胞活性的作用。     

根尖牙乳头干细胞促进人脐静脉内皮细胞血管生成的研究

目的    血管早期生成是组织修复与再生的关键。本研究探究根尖牙乳头干细胞（stem cells from apical papilla,SCAP）对人脐静脉内皮细胞（human umbilical vein endothelical cells,HUVECs）血管生成能力的影响,为促进组织再生提供新的策略。方法　SCAP原代提取,流式细胞术鉴定干细胞表面标记物,茜素红S和油红O染色,鉴定SCAP的多向分化潜能。应用Transwell培养体系,将SCAP和HUVECs共培养,Western blot和管腔形成实验检测HUVECs血管生成相关蛋白表达和成管能力。采用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析。结果    　SCAP表达间充质干细胞表面标记物CD29、CD44、CD105、CD146,不表达造血干细胞表面标记物CD34、CD45,体外诱导培养后可见大量矿化结节和脂滴形成。SCAP和HUVECs共培养后,HUVECs中血管内皮生长因子VEGFA的蛋白表达水平显著提高（P < 0.001）,同时HUVECs的管腔形成能力明显增强（P < 0.01）。结论    SCAP能够促进HUVECs血管生成,且与其旁分泌作用相关。     

Human leukocyte histocompatibility antigen class II-induced cytokines from human gingival fibroblasts promote proliferation of human umbilical vein endothelial cells: potential association with enhanced angiogenesis in chronic periodontal inflammation

Background and Objective:  The role of human leukocyte histocompatibility antigen (HLA) class II molecules on non-antigen-presenting cells has been a matter of controversy. We previously reported that HLA-II molecules on human gingival fibroblasts (GF) do not present antigens, but transduce signals into the cells, resulting in the expression of several cytokines, such as interleukin-6 (IL-6), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), regulated upon activation, normal T-cell expressed and secreted (RANTES) and IL-8. However, the exact role of these cytokines, as well as other cytokines which are potentially secreted from GF, in the pathogenesis of chronic periodontal inflammation is not fully understood. The aim of this study was to observe the effects of HLA-II-induced cytokines on the proliferation of human umbilical vein endothelial cells (HUVEC).
Material and Methods:  Antibody-based cytokine-microarray analyses were performed to detect potential cytokines associated with angiogenesis. Next, cytokine productivity was confirmed by quantitative methods. Then, cell proliferation assay was performed to see whether these cytokines promoted the proliferation of HUVEC.
Results:  Besides IL-6, MCP-1, RANTES and IL-8, growth-related gene product (GRO) was newly identified as an HLA-II-induced cytokine released from GF. This was confirmed by a quantitative method. Cell culture supernatant from HLA-II-stimulated GF cultures promoted the growth of HUVEC. Addition of anti-IL-8 neutralizing antibody, anti-CXC receptor (CXCR)1 antibody and anti-MCP-1 antibody inhibited the growth of HUVEC in a dose-dependent manner, while addition of anti-GROα antibody did not.
Conclusion:  The HLA-II-induced IL-8, via CXCR1, as well as MCP-1 from GF, promotes endothelial cell proliferation, which is possibly associated with enhanced angiogenesis in chronic periodontal lesions.     

miRNA-21促进干细胞血管向分化的研究进展

[摘要] MicroRNAs(miRNAs)是一类真核生物内源性非编码单链RNA,通常为18-22nt长,以完全或非完全互补的方式与其靶mRNA相结合,调节mRNA的表达,从而影响其生物学特征。其作用机制已成为生物医学的主要研究领域,对不同病理类型的检测和治疗具有重要意义。miRNAs在血管系统中含量丰富,尤其是miRNA-21在干细胞血管向分化过程中发挥重要的调控作用,可能是血管系统疾病的重要介质。为此该文就miRNA-21对干细胞血管向分化的影响及机制作一综述。     

脐静脉内皮细胞外泌体和内皮祖细胞外泌体对hDPSCs增殖及迁移能力的比较研究

目的 将人脐静脉内皮细胞外泌体(human umbilical vein endothelial cells-derived exosome,HUVECs-exo)和内皮祖细胞外泌体(endothelial progenitor cells-derived exosome,EPCs-exo)对人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)增殖和迁移能力的影响进行比较研究,以期为外泌体在牙髓再生中的应用积累经验。方法 采用超速离心法分离提取外泌体,透射电镜观察外泌体形态,纳米粒子跟踪分析技术(nanoparticle tracking analysis,NTA)检测外泌体粒径大小,Western blot蛋白印迹检测外泌体标志蛋白CD9、CD63、TSG101的表达。将两种外泌体按照5、10、20 μg/mL浓度梯度分别作用于hDPSCs,通过CCK-8实验检测hDPSCs增殖能力,细胞划痕实验和Transwell实验检测hDPSCs迁移能力。结果 透射电镜下观察两种外泌体均呈圆盘状,粒径集中在30～150 nm,阳性表达CD9、CD63、TSG101三种标志蛋白。与对照组(Control组)相比,两种外泌体在不同浓度下均对hDPSCs增殖能力无显著促进作用,差异无统计学意义(P>0.05)。细胞划痕实验和Transwell实验表明,与对照组相比,两种外泌体均可促进hDPSCs迁移,差异有统计学意义(P<0.05),其中10 μg/mL外泌体浓度作用效果最明显(P<0.01)。相同浓度的两种外泌体组间作用效果差异无统计学意义(P>0.05)。结论 本实验成功分离提取到两种细胞来源的外泌体并进行鉴定,将不同浓度的两种细胞来源的外泌体作用于hDPSCs,发现对其增殖能力无明显促进作用,但可以促进其迁移,尤以10 μg/mL外泌体浓度促进迁移效果最为明显。     

基于生物打印技术的间接共培养体系的构建

目的 构建牙髓干细胞(dental pulp stem cells, DPSCs)与人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)的间接共培养模型,为建立可应用于体内外的间接共培养体系打下基础。方法 配制5%甲基丙烯酰化明胶(GelMA)30胶,摸索三维生物打印的最佳参数,进行可打印性测试。使用活死染色实验检测DPSCs和HUVECs在GelMA30胶中的存活情况。构建6组共培养模型:DPSCs与HUVECs直接共培养(M),单纯DPSCs培养(D-D200),单纯HUVECs培养(H-D200),DPSCs与HUVECs间接共培养(M-D0、M-D200、M-D400),拍照观察细胞共存情况。结果 Pr计算结果为0.97±0.02,表明结构具有良好的可打印性。第7天DPSCs活细胞率为96.48%,HUVECs活细胞率为96.00%,证明细胞保有活力。6组共培养模型打印成功。结论 利用三维生物打印可以构建DPSCs与HUVECs的间接共培养体系,为后续的研究奠定基础。     

人羊膜间充质干细胞旁分泌对成骨细胞的影响

目的 探究人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)旁分泌对人成骨细胞生物活性的影响.方法 酶消化法提取原代hAMSCs,并检测细胞表面标记物表达.收取hAMSCs 24 h培养上清与新鲜培养液1∶1配比作为条件培养基(condition medium...