PDCD4对高糖诱导的胰岛β细胞损伤的影响及机制研究

目的研究程序性细胞死亡4 (PDCD4)对高糖诱导的胰岛β细胞损伤的影响及机制。方法胰岛β细胞感染PDCD4 siRNA重组慢病毒,给予高糖处理,Realtime PCR和Western blot检测PDCD4表达水平。CCK8检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,Western blot方法检测细胞中活化型Caspase-3(Cleaved Caspase-3)蛋白水平,用黄嘌呤氧化法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性,硫代巴比妥酸法检测细胞中丙二醛(MDA)含量,ELISA法检测细胞分泌胰岛素水平。结果PDCD4 siRNA重组慢病毒能够有效下调高糖条件下胰岛β细胞中PDCD4的表达水平。高糖处理后的胰岛β细胞的增殖能力降低,细胞凋亡率升高,细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平升高,SOD活性降低,MDA含量升高,细胞分泌的胰岛素水平下调。敲低PDCD4可以明显提高高糖环境下胰岛β细胞增殖能力,减少细胞凋亡和细胞中Cleaved Caspase-3蛋白水平,提高细胞中SOD活性,降低细胞中MDA水平,促进细胞分泌胰岛素。结论敲低PDCD4能够通过减轻高糖诱导的胰岛β细胞氧化损伤减少细胞凋亡,促进胰岛β细胞分泌胰岛素。     

SOCS1对大鼠胰岛细胞功能及细胞凋亡影响的研究

目的观察增加胰岛细胞SOCS1表达后胰岛细胞功能及抗凋亡能力的变化。方法通过胆总管插管、逆行灌注胶原酶P溶液的方法分离大鼠胰岛,采用Ficoll密度梯度离心法纯化胰岛,采用AdMax法构建腺病毒载体Ad5 F35-SOCS1并转染大鼠胰岛细胞,使用Western blot法检测转染胰岛细胞的SOCS1表达水平,通过胰岛的糖刺激指数检测大鼠胰岛细胞的胰岛素释放功能,通过加入凋亡诱导剂及应用流式细胞仪检测凋亡细胞的比例。结果与对照组及未转染胰岛细胞相比,经Ad5 F35-SOCS1转染的大鼠胰岛细胞在具有高表达SOCS1的特性时其正常的胰岛素释放功能不受影响(三组的糖刺激指数分别为3.98±0.45、4.06±0.61和3.53±0.39,P>0.05),经凋亡诱导剂诱导后其凋亡细胞数明显低于对照组及未转染组,三组细胞凋亡率分别为(8.89±4.03)%、(24.60±6.88)%和(21.14±5.12)%,P<0.05。结论增加胰岛细胞SOCS1表达不影响胰岛细胞的功能,并能有效减少细胞的凋亡。     

脂多糖对巨噬细胞致胰岛β细胞炎症和凋亡的影响

目的探讨脂多糖对巨噬细胞诱导胰岛β细胞炎症反应和凋亡的影响。方法脂多糖处理单独RINm细胞培养组或RINm细胞、NR8383细胞共培养组一定时间,采用Real-time PCR法检测白细胞介素(IL)-1β、IL-6 m RNA水平,Western blot法检测细胞内IL-1β、IL-6蛋白水平,Annexin-Ⅴ/PI染色法和Caspase-3分光光度计法检测细胞凋亡。多组间比较采用单因素方差分析,多组间的两两比较采用最小有意义差异t检验。结果 (1)脂多糖可促进RINm细胞和RINm细胞、NR8383细胞共培养组中RINm细胞IL-1β、IL-6的表达,且共培养组RINm细胞IL-1β、IL-6水平升高较单独RINm细胞组更为显著(P<0.01);(2)脂多糖可促进NR8383+RINm细胞共培养组中RINm细胞的凋亡(8.41%±0.68%vs.2.69%±0.48%,P<0.01),但脂多糖对单独RINm细胞培养组细胞的凋亡无明显影响(1.69%±0.11%vs.1.34%±0.10%,P>0.05)。结论脂多糖促进巨噬细胞诱导胰岛β细胞凋亡,这可能与脂多糖和巨噬细胞促进IL-1β、IL-6的表达有关。     

生长激素释放肽对高糖诱导下胰岛β细胞凋亡的影响

目的 探讨生长激素释放肽(Ghrelin)对高糖诱导的胰岛β细胞凋亡的影响.方法 根据不同的培养基将胰岛β细胞株NIT-1细胞划分为四组:A组(5.6 mmol/L葡萄糖全程),B组(5.6 mmol/L葡萄糖+10-7 mol/L Ghrelin 24 h,5.6 mmol/L葡萄糖72 h),C组(5.6 mmol/L葡萄糖24 h,33.3 mmol/L葡萄糖72 h),D组(5.6 mmol/L葡萄糖+10-7 mol/L Ghrelin 24 h,33.3 mmol/L葡萄糖培养72 h).流式细胞仪Annexin V/PI双染色法测定四组NIT-1细胞早期凋亡率;Hoechst 33258标记细胞核并在荧光显微镜下测各组细胞总凋亡率;RT-PCR法测定Bcl-2、Bax mRNA水平.结果 (1)与A组比较,B组NIT-1细胞早期凋亡率及总凋亡率均无统计学意义(P均>0.05),而C组NIT-1细胞早期凋亡率及总凋亡率均显著增加(P均<0.01);与C组比较,D组NIT-1细胞早期凋亡率及总凋亡率均降低(分别P<0.01,P<0.05).D组较A组细胞早期凋亡率有增加(P<0.05),而总凋亡率无统计学意义(P>0.05).(2)与A组比较,B组NIT-1细胞Bax、Bcl-2、Bcl-2/Bax表达水平无变化,而C组Bcl-2、Bcl-2/Bax水平显著下降(P<0.05);与C组比较,D组Bcl-2、Bcl-2/Bax表达有升高趋势,但无统计学意义;各组Bax表达水平无差别.结论 Ghrelin对葡萄糖生理浓度下的胰岛β细胞凋亡无影响,但可抑制高浓度葡萄糖诱导的β细胞凋亡.Ghrelin可能不通过Bcl-2、Bax抑制高糖诱导的β细胞凋亡.     

敲除TRIF基因对TLR3介导胰岛β细胞损伤的影响及机制研究

目的 探讨敲除TRIF基因后,激活Toll样受体3(TLR3)对胰岛β细胞增殖的影响及可能的作用机制。方法 首先利用CRISPR/Cas9技术,在小鼠胰岛素瘤β细胞NIT-1细胞株中敲除TRIF基因,得到敲除TRIF基因细胞株。再以敲除TRIF基因的NIT-1细胞株为研究对象,用DMEM培养基进行细胞培养,当细胞处于增殖期比例达到80%～90%时进行实验分组,分为空白对照组和实验组,实验组予以不同水平(30、60、90μg/mL)的TLR3特异性激动剂病毒聚肌胞(PIC)刺激,刺激干预48 h后再检测细胞增殖、细胞周期与凋亡蛋白表达,以及核转录因子-κB(NF-κB)的mRNA和蛋白表达。结果 与空白对照组相比,PIC刺激敲除TRIF基因后的NIT-1细胞株,细胞停留在G₀/G₁期细胞的比例明显上调,而在S期和G₂/M期的细胞比例出现明显下调,差异均有统计学意义(P<0.05);CyclinD1表达在不同水平的PIC刺激下明显下调(P<0.05);细胞因子NF-κB和凋亡蛋白Caspase-3的表达在不同水平...     

TRAIL诱导白血病细胞凋亡的分子机制研究

目的　检测TRAIL引起的T淋巴白血病细胞凋亡及与之相关的蛋白和信号通路 ,为探索T淋巴细胞凋亡分子机制打下基础 ,为相关肿瘤的治疗提供依据。方法　用TRAIL( 1μg/ml)刺激Jurkat细胞 3 6h以诱导细胞发生凋亡 ,用流式细胞术和MTS比色法检测细胞存活率 ,计算细胞凋亡率 ;用免疫印迹 (Westernblot)检测NF κB的表达和胱天肽酶 (caspase) 3、cas pase 8的变化。 结果　TRAIL能诱导Jurkat细胞凋亡并伴随NF κB表达增加及caspase 3和caspase 8的活化。 结论　TRAIL诱导的T淋巴白血病细胞凋亡的分子机制涉及NF κB及caspase 3、caspase 8,为TRAIL用于治疗白血病提供实验基础。     

X射线辐射诱导HepG2细胞的凋亡及对核因子κB的激活作用

目的:探讨核因子κB在X射线电离辐射诱导HepG2细胞凋亡中的作用。方法:实验于2004-02/2005-03在南方医科大学南方医院完成。将HepG2细胞分3组:对照组不加任何处理因素;辐射组单纯X射线电离辐射6Gy;核转录因子κB抑制剂组是指在照射前30min用20μmol/L的lactacystin预处理细胞,然后按照同样的辐射条件进行X射线照射。流式细胞仪检测细胞凋亡率,免疫电泳迁移率改变分析法检测细胞内核因子κB的激活,应用SPSS10.0软件包行多组均数间方差分析。结果:对照组、辐射组、核转录因子κB抑制剂组的细胞凋亡率分别是1.73%,20.90%,35.23%。对照组的核因子κB微弱激活,辐射组明显激活,核转录因子κB抑制剂组的活性较辐射组减弱,与对照组相似。结论:辐射可以引起HepG2细胞凋亡,并诱导了核因子κB的激活,且可能在X射线辐射诱导HepG2细胞凋亡中发挥抗凋亡作用。     

严重烫伤内毒素血症大鼠胰岛β-细胞功能损害研究

目的探讨胰岛NF-кB基因表达对大鼠胰岛β-细胞胰岛素分泌功能免疫损伤的作用。方法制作12h、1d、3d、5d和7d组30%TBSAⅢ度烫伤内毒素血症大鼠模型,采用高糖钳夹技术检测大鼠胰岛在体内的功能状态,用胶原酶消化法分离出大鼠胰岛,观察其在体外的胰岛功能;并探讨胰岛功能变化与NF-кB基因表达的关系。结果烫伤12h和1d组大鼠血糖及血清胰岛素水平比正常组显著升高（P〈0.05）,并持续到伤后7天组;但烫伤组大鼠胰岛功能各时相点与正常组比较均明显受损（P〈0.01）;烫伤组大鼠NF-кB蛋白表达均较正常组明显升高（P〈0.05）,伤后1天达峰值,后逐渐下降。NF-кB阳性率与胰岛体外功能呈显著负相关（P〈0.01）。结论严重烫伤内毒素血症大鼠存在β-细胞功能损伤,NF-кB活化在胰岛β-细胞功能损伤中可能发挥着重要作用。     

严重烫伤内毒素血症大鼠胰岛β-细胞功能损害研究

目的探讨胰岛NF-кB基因表达对大鼠胰岛β-细胞胰岛素分泌功能免疫损伤的作用。方法制作12h、1d、3d、5d和7d组30%TBSAⅢ度烫伤内毒素血症大鼠模型,采用高糖钳夹技术检测大鼠胰岛在体内的功能状态,用胶原酶消化法分离出大鼠胰岛,观察其在体外的胰岛功能;并探讨胰岛功能变化与NF-кB基因表达的关系。结果烫伤12h和1d组大鼠血糖及血清胰岛素水平比正常组显著升高（P〈0.05）,并持续到伤后7天组;但烫伤组大鼠胰岛功能各时相点与正常组比较均明显受损（P〈0.01）;烫伤组大鼠NF-кB蛋白表达均较正常组明显升高（P〈0.05）,伤后1天达峰值,后逐渐下降。NF-кB阳性率与胰岛体外功能呈显著负相关（P〈0.01）。结论严重烫伤内毒素血症大鼠存在β-细胞功能损伤,NF-кB活化在胰岛β-细胞功能损伤中可能发挥着重要作用。     

新型hGLP-1基因对β-TC-6胰岛瘤细胞凋亡的影响

目的探讨新型人胰高血糖素样肽-1(hGLP-1)类似物基因(2×Val2-hGLP-1)对四氧嘧啶(AXN)诱导凋亡的β-TC-6胰岛瘤细胞株的影响。方法脂质体介导重组质粒pIRES2-EGFP/2×Val2-hGLP-1转染β-TC-6胰岛瘤细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP),酶联免疫吸附法(ELISA)检测目的蛋白表达;以AXN诱导细胞凋亡后观察细胞形态,Hoechst染色及四甲基偶氮唑盐光吸收法(WST-1)检测目的基因表达对细胞凋亡的影响。结果荧光显微镜观察到GFP表达;ELISA显示重组质粒转染组细胞培养液吸光度值为(2.53±0.05),高于其他研究组(P<0.05);细胞形态观察及Hoechst染色显示,AXN可诱导β-TC-6细胞凋亡;WST-1显示转染重组质粒的细胞组存活率为66.23%,高于其他研究组(P<0.05);Hoechst染色显示,经重组质粒转染的细胞凋亡减少。结论 2×Val2-hGLP-1的表达对胰岛β细胞凋亡具有一定抑制作用,为糖尿病基因治疗提供了相关试验研究基础。     

蛋白酶体抑制剂MG-132诱导L1210细胞凋亡及其机制研究

为了观察蛋白酶体抑制剂MG-132对淋巴细胞白血病细胞株L1210的致凋亡作用,探讨MG-132的致凋亡机制,分别以不同浓度的蛋白酶体抑制剂MG-132处理L1210细胞,用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测细胞活力,应用Annexin-Ⅴ和PI双染色细胞流式细胞术检测细胞凋亡率,比色法测定细胞中caspase3的活性,采用Western-blot法检测细胞NF-κB P65核蛋白的表达。结果表明:在相同的作用时间下,随着MG-132浓度的增高(0、2.5、5、10、20μmol/L),细胞增殖抑制率、凋亡率、caspase3活性逐渐升高;Western-blot法检测显示,细胞NF-κB P65核蛋白表达水平降低。结论:蛋白酶体抑制剂能够诱导L1210细胞凋亡,其机制可能是通过下调NF-κB的表达,进一步活化caspase3的活性而诱导凋亡。     

核因子-κB的结构和功能研究及与全身炎症反应综合征的关系

核因子-kappa B（NF-κB）是细胞中一个重要的转录调节因子，静息状态下与IKB相结合形成复合体，以无活性状态存在于胞浆中。当细胞受到外界因素刺激时，NF-κB暴露出核定位信号（NLS）并进入核内，使其具有生物活性。全身炎症反应综合征（SIRS）发生、发展的病理生理基础在于过度失控的炎症反应，NF-κB在SIRS的信号传递途径中占据重要角色。现就NF-κB的生物学特性和信号转导途径、NF-κB与SIRS的关系进行综述。     

内质网应激对2型糖尿病胰岛β细胞凋亡的影响研究概况

胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能受损被认为是T2DM发生发展的最重要的病理机制。生理状态下随着人们年龄的增长,人体胰岛素的敏感性会降低,胰岛素抵抗十分常见,但是不一定会出现高血糖,而胰岛β细胞功能的衰退一定会出现高血糖。流行病学研究显示,在T2DM初诊时,病人胰岛β细胞功能约为正常人的50%,以后每年以4.5%的速度下滑,且不受饮食及药物等治疗方法的影响,     

高糖和游离脂肪酸诱导胰岛INS-1细胞线粒体呼吸链改变的研究

目的:通过研究观察体外慢性高糖和游离脂肪酸(FFA)对培养的胰岛INS-1细胞线粒体琥珀酸脱氢酶、细胞色素C氧化酶活性及细胞内ATP含量的影响,初步探讨高糖和FFA损害胰岛β细胞功能的可能机制.方法:实验分为对照组(C组)(含5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG组)(含16.7 mmol/L葡萄糖)、高脂组(PA组)(含0.4 mmol/L棕榈酸)、高糖高脂联合组(HG+PA组)(含16.7 mmol/L葡萄糖及0.4 mmol/L棕榈酸).将INS-1细胞分别接种于上述不同浓度的葡萄糖和FFA中作用48 h后,用分光光度法测定INS-1细胞线粒体琥珀酸脱氢酶及细胞色素C氧化酶活性.用荧光素酶方法检测细胞内ATP含量.结果:与C组相比,HG组、PA组和HG+PA组INS-1细胞线粒体琥珀酸脱氢酶及细胞色素C氧化酶活性明显下降,差异有显著性(均P<0.05);HG组、PA组和HG+PA组明显降低细胞内ATP含量(均P<0.05).结论:在胰岛INS-1细胞中,高糖及FFA可能通过损伤线粒体呼吸链功能,产生对胰岛功能的损害作用.     

PM2.5对HaCaT细胞的损伤作用及机制研究

[目的]探讨PM2.5对人永生化角质形成细胞(HaCaT)的损伤作用及NF-κB抑制剂PDTC对PM2.5致HaCaT细胞损伤作用的影响.[方法]将HaCaT细胞分别PM2.5、PDTC、PM2.5+PDTC共孵育24h,同时设不加任何处理因素的正常组.24h后收集细胞,测定细胞内丙二醛(MDA)含量、活性氧(ROS)水平、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)的活性以及NF-κBp65的蛋白表达情况.[结果]HaCaT细胞的存活率随PM2.5浓度的增加而下降,浓度为200、400、800μg/mL组的细胞存活率明显低于正常组(P<0.05).PM2.5组细胞中MDA含量、ROS水平和NF-κBp65蛋白表达水平显著高于正常组、PDTC组和PM2.5+PDTC组(P<0.05),SOD、GSH-Px的活性显著低于上述各组(P<0.05).PM2.5+PDTC组细胞中MDA含量、ROS水平和NF-κBp65蛋白表达水平显著高于正常组和PDTC组.[结论]PM2.5能够降低HaCaT细胞的存活率.PM2.5能够对HaCaT细胞造成氧化损伤,而PDTC能够缓解这种损伤作用.应用NF-κB抑制剂PDTC可以特异性抑制NF-κB的表达,在一定程度上减轻PM2.5对HaCaT细胞的损伤作用.     

三氯化镧对糖尿病大鼠胰岛B细胞凋亡的剂量效应

目的:观察不同剂量的三氯化镧(LaCl3)对糖尿病大鼠胰岛B细胞凋亡的作用。方法:糖尿病大鼠随机分为低剂量组(0.01 mg/kg LaCl3)、中剂量组(0.05 mg/kg LaCl3)、高剂量组(0.25 mg/kg LaCl3)及对照组,隔日腹腔注射。治疗8周后取胰腺行HE染色及TUNEL染色。结果:治疗后8周低剂量治疗组仅发现少量凋亡细胞,凋亡率(6±1)%,比对照组显著降低(P<0.01)。结论:低剂量LaCl3可抑制胰岛B细胞凋亡,保护胰岛B细胞功能。     

缺血延迟预适应对心肌缺血再灌注所致细胞凋亡的保护

目的：分析心肌缺血延迟预适应能否抑制心肌缺血再灌注后心肌细胞凋亡的发生及其发生的可能原因。 方法：①实验于2003-08／2004-12在中山大学中西医研究所完成。选用出生两三个月的SD大鼠32只，雌雄不拘。②随机将大鼠分为4组：正常对照组（不做任何处理），假手术组（只穿线，不结扎），缺血再灌注组（采用经典大鼠冠状动脉结扎，缺血1h，再灌注1h），延迟缺血预处理组（采用经典大鼠冠状动脉结扎，缺血5min再灌注5min，重复3个缺血预处理，24h后，缺血1h，再灌注1h。③采用流式细胞仪测定心肌细胞凋亡率，反转录聚合酶链法检测Bcl-xl mRNA/Bcl-xs mRNA的表达情况，进行Bcl-xl的蛋白免疫印迹分析并利用免疫组织化学染色法检测大鼠心肌核因子KB亚单位P65蛋白的表达。 结果：大鼠32只均进入结果分析。①大鼠心肌细胞凋亡率：心肌缺血再灌注组明显升高（P〈0.01），延迟缺血预处理组明显低于缺血再灌注组（P〈0．01）。②大鼠心肌Bcl-xl mRNA与Bcl-xs mRNA表达的比值：缺血再灌注组明显低于正常对照组（P〈0．01），延迟缺血预处理组明显高于缺血再灌注组（P〈0．01）。③大鼠心肌Bcl-xl蛋白表达：缺血再灌注组明显减少（P〈0．01），延迟缺血预处理组明显高于缺血再灌注组（P〈0．01）。④大鼠心肌核因子κB P65蛋白表达：延迟缺血预处理组核因子κB P65发生核转位且明显高于与缺血再灌注组（P〈0．01）。 结论：心肌缺血延迟预适应可以减少心肌缺血再灌注造成的细胞凋亡，此种作用发生可能与核因子KB括化后促进Bcl-xl的表达，保护线粒体功能有关。     

两种砷化物诱导胰岛细胞的凋亡

背景：近年有流行病学调查显示砷暴露与糖尿病发病相关。目的：实验从砷导致胰岛β细胞凋亡的机制入手,阐明砷化物相关糖尿病的致病机制。方法：将砷酸氢二钠（Na2HAsO 4·7H2O,iAs5＋,50,100,200μmol/L）和二甲基胂酸钠（C2H6AsNaO2·3H2O,DMA5＋,100,200,400μmol/L）分别作用于大鼠胰岛细胞株（INS-1细胞）24 h或48 h。通过MTT法检测砷化物对胰岛细胞的毒性作用。用Annexin V-FITC/PI和Hoechst 33258染色法检测两种砷化物致细胞凋亡情况。用2’,7’-二氢二氯荧光素染色检测细胞内活性氧的含量,用Western blot检测细胞内P53的蛋白含量变化。结果与结论：砷酸氢二钠（〉50μmol/L）、二甲基胂酸钠（〉100μmol/L）均降低大鼠胰岛β细胞的细胞存活率（P〈0.05,P〈0.01）;砷酸氢二钠（50-200μmol/L）和二甲基胂酸钠（100-400μmol/L）作用于大鼠胰岛β细胞48 h后,细胞发生凋亡。砷酸氢二钠、二甲基胂酸钠暴露24 h引起大鼠胰岛β细胞内活性氧水平呈剂量依赖性升高（P〈0.05,P〈0.01）。经砷酸氢二钠染毒的胰岛β细胞的细胞核内P53蛋白表达增多（P〈0.05,P〈0.01）,而经二甲基胂酸钠染毒的大鼠胰岛β细胞的细胞核内P53蛋白表达差异无显著性意义。结果说明,两种砷化物砷酸氢二钠、二甲基胂酸钠均可引起胰岛β细胞凋亡,可能与砷所致活性氧水平增高有关。