内皮素-1对牙周膜干细胞肿瘤坏死因子表达的影响

目的:探讨内皮素-1(endothelin-1,ET-1)对牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells,PDLSCs)肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis Factor,TNF-α)表达的影响。方法:体外培养鉴定牙周膜干细胞,加入不同浓度(1,10,100 nmol/L)的ET-1培养12、24、72 h,以未作任何处理的牙周膜干细胞为对照,采用ELISA及Western blot检测ET-1作用下牙周膜干细胞TNF-α分泌及蛋白表达的改变。结果:与对照组相比,ET-1对牙周膜干细胞TNF-α分泌及蛋白表达具有显著促进作用,且促进作用具有剂量依赖性及时间依赖性。结论:内皮素-1可以诱导牙周膜干细胞分泌TNF-α,而且这种促进作用呈浓度依赖性及时间依赖性。     

低氧条件下人牙源性干细胞促血管相关miRNAs的表达差异研究

目的: 探讨人根尖乳头干细胞（stem cells from the apical papilla,SCAPs）、牙髓干细胞（dental pulp stem cells,DPSCs）和牙周膜干细胞（periodontal ligament stem cells, PDLSCs）在低氧条件下促血管相关微小RNA (miRNAs) 的表达及其意义。方法: 从离体牙中提取SCAPs、DPSCs 和PDLSCs,分别于常氧和低氧条件下培养1、3、5 d,通过实时定量PCR(RT-PCR) 检测细胞中已被证实具有特异性促血管相关功能的9个miRNAs的表达变化,以及低氧诱导因子1α (HIF-1α) 的表达变化。采用SPSS 19.0软件包对数据进行统计学分析。结果: 低氧条件下第5天,SCAPs中miR-126的表达相对升高,miR-20a、miR-20b、miR-21、miR-130a、miR-132、miR-210、miR-503的表达相对降低;DPSCs中miR-21、miR-130a、miR-126和miR-210的表达相对升高,miR-132的表达相对降低;PDLSCs中miR-126、miR-210和miR-296的表达相对升高。SCAPs、DPSCs和PDLSCs中HIF-1α的表达相对升高。结论: 低氧条件下,SCAPs、DPSCs和PDLSCs中促血管相关miRNAs具有各自特征性的表达谱。     

EZH2影响炎症状态下人牙周膜干细胞成骨分化能力的研究

目的：探究人类同源基因2(EZH2)对脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)刺激下的牙周膜干细胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)成骨分化能力的影响。方法：体外分离PDLSCs,使用Western Blot技术筛选出LPS体外刺激PDLSCs最佳浓度与时间模拟炎症环境,使用RNA沉默技术敲减EZH2基因,利用脂质体将siEZH2转染至PDLSCs细胞后使用Western blot检测EZH2的转染效率。使用脂质体转染技术敲低PDLSCs的EZH 2基因后使用Western Blot检测EZH 2的表达,Western Blot检测EZH 2敲低对炎症状态下PDLSCs中成骨蛋白Runx 2、碱性磷酸酶(Alkalineph osph atase,ALP)、骨钙素(osteocalcin, OCN)表达影响,使用茜素红染色检测PDLSCs成骨变化。结果：EZH2敲低后炎症状态下PDLSCs中骨形成标志物ALP、Runx2和OCN表达增强,茜素红染色矿化结节形成增加。结论：抑制EZH2可以促进LPS刺激所模拟炎症状态下PDL...     

P120ctn基因沉默及过表达对口腔鳞癌细胞迁移和侵袭的影响

目的:利用舌癌原发灶和转移淋巴结细胞系HN4和HN12,通过沉默和过表达P120连环蛋白(P120-catenin,P120^ctn)基因,观察P120ctn的表达对E-钙黏蛋白(E-cadherin, E-cad)表达和口腔鳞癌迁移和侵袭能力的影响。方法:采用质粒pGFP-V-RS-P120ctn shRNA转染P120ctn高表达的HN4细胞,使HN4中P120ctn的表达显著降低,采用质粒pCMV6-AC-GFP- P120^ctn转染HN12,使HN12过表达P120^ctn,进行P120^ctn和E-cad mRNA和蛋白水平的检测,并通过Transwell细胞迁移及侵袭试验检测转染前后肿瘤细胞迁移和侵袭能力的变化。结果:用质粒转染HN4细胞后发现,随着P120ctn表达的显著降低,E-cad的mRNA和蛋白表达水平明显降低,细胞迁移和侵袭能力显著提高。反之,HN12细胞被转染后发现,过表达P120^ctn的HN12细胞E-cad的蛋白表达水平也显著提高,细胞迁移和侵袭能力显著降低(P＜0.05)。 结论:在OSCC细胞系中P120ctn的表达与E-cad相关,可能参与了细胞粘附的调控,进而在口腔鳞癌细胞的迁移和侵袭过程中发挥作用。     

尼古丁通过调控Toll样受体4抑制牙周膜干细胞的成骨分化能力

目的 探讨尼古丁对牙周膜干细胞（PDLSCs）增殖和成骨分化能力的调控作用,检测尼古丁能否通过调控Toll样受体4（TLR4）抑制PDLSCs的增殖及成骨分化能力。方法 培养PDLSCs,采用流式细胞仪检测PDLSCs表面抗原标志,WST-1试剂盒检测不同浓度尼古丁刺激后PDLSCs增殖能力的改变。采用茜素红染色观察PDLSCs经不同浓度尼古丁刺激和成骨诱导后的矿化结节生产情况。运用实时定量聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot检测经尼古丁刺激后,PDLSCs成骨能力相关基因和蛋白的改变,以及尼古丁联合TLR4抑制剂TAK-242刺激后,PDLSCs成骨能力相关基因及蛋白的改变。结果 培养的细胞表达间充质干细胞表面标志物CD90和CD105,证实为PDLSCs。与对照组相比,培养3 d后,尼古丁浓度为10^-4 mol·L^-1的PDLSCs的增殖能力受到明显抑制（P<0.05）;成骨诱导21 d后,10^-4 mol·L^-1尼古丁刺激组茜素红染色矿化结节明显减少。RT-PCR反应及Western blot显示：与对照组相比,尼古丁刺激组PDLSCs的碱性磷酸酶、骨钙素、Runt相关转录因子2的基因及蛋白表达量均降低（P<0.05）,加入TLR4抑制剂TAK-242后,尼古丁的抑制效应减弱。结论 尼古丁可能通过TLR4信号通路抑制PDLSCs的增殖及成骨分化能力。     

赖氨酸乙酰基转移酶2A通过经典Wnt通路影响牙周膜干细胞成骨分化

目的 探讨赖氨酸乙酰基转移酶2A（KAT2A）调控牙周膜干细胞（PDLSCs）成骨分化的机制。方法 分离培养来自健康志愿者的PDLSCs（H-PDLSCs）和牙周炎患者的PDLSCs（P-PDLSCs）,比较传代细胞中KAT2A基因的表达水平。采用KAT2A基因干扰H-PDLSCs,检测KAT2A基因干扰对H-PDLSCs成骨分化的影响;同时检测KAT2A干扰后对经典Wnt通路及其配体的影响,确定KAT2A基因与经典Wnt通路的上下游关系。结果 与H-PDLSCs相比,P-PDLSCs中KAT2A基因的表达下降,差异有统计学意义（P<0.05）。KAT2A基因被干扰后,PDLSCs成骨能力下降（P<0.05）,同时经典Wnt通路被激活,拮抗剂Dickkopf-1（DKK-1）表达下调;加入DKK-1后,被干扰的PDLSCs成骨分化功能恢复,而KAT2A的表达不受影响,仍维持较低水平。结论 牙周炎可导致PDLSCs中KAT2A基因表达下降,激活经典Wnt通路,抑制细胞的成骨分化。     

P120-连环蛋白介导钙黏蛋白转换促进口腔鳞状细胞癌细胞迁移和侵袭的实验研究

目的 探索P120-连环蛋白（P120^ctn）在口腔鳞状细胞癌（OSCC）细胞钙黏蛋白转换中的作用及其对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响。方法 采用质粒pGFP-V-RS-P120^ctn shRNA转染OSCC细胞株TSCCA,采用实时荧光定量聚合酶链反应、Western blot检测细胞中P120^ctn、E-钙黏蛋白（E-cad）和N-钙黏蛋白（N-cad）的mRNA和蛋白表达的变化,通过Transwell细胞侵袭及细胞迁移实验检测转染前后细胞迁移和侵袭能力的变化。结果 质粒pGFP-V-RS-P120^ctn shRNA转染TSCCA细胞后,P120^ctn表达明显降低,E-cad的mRNA和蛋白表达水平也明显降低,而N-cad的mRNA和蛋白表达水平明显提高,细胞迁移和侵袭能力也明显提高,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论 在OSCC中P120^ctn可能通过介导钙黏蛋白转换来调节肿瘤的浸润和转移过程。     

环状RNA-BIRC6促进血管新生的作用研究

目的 分析人脐静脉内皮细胞(HUVEC)经人羊膜间充质干细胞上清(hAMSC-CM)诱导后差异表达的circBIRC6在血管新生中的作用。方法 运用实时定量PCR检测HUVEC中circBIRC6的表达水平;设计针对circBIRC6的siRNA和过表达质粒,通过转染构建敲减和过表达circBIRC6的HUVEC细胞模型;通过Transwell小室迁移实验、成管实验、创愈划痕实验检测HUVEC的血管新生能力。结果 hAMSC-CM诱导HUVEC中circBIRC6的表达上升;实时定量PCR验证了HUVEC敲减和过表达circBIRC6细胞模型的可靠性;在Transwell小室迁移实验、成管实验、创愈划痕实验中,敲减circBIRC6降低了HUVEC的小室细胞迁移率、总成管长度和划痕迁移率,而过表达circBIRC6则反之。结论 本研究初步阐明circBIRC6促进HUVEC血管新生的作用,并揭示hAMSC-CM可能通过上调HUVEC中circBIRC6的表达进而促进血管新生。     

浓缩生长因子促人脐静脉血管内皮细胞成血管化作用研究

目的 研究浓缩生长因子（CGF）对人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）的增殖、迁移和分化的作用。方法 取健康志愿者静脉血制成CGF,再用CGF制备浓缩生长因子提取液（CGFe）。体外培养细胞分为2%CGFe组、5%CGFe组、10%CGFe组和对照组。CCK-8和细胞周期实验检测各组细胞增殖活性;划痕实验检测内皮细胞迁移;实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测各组细胞血管内皮生长因子（VEGF）、趋化因子受体4（CXCR4）、血小板衍生因子（PDGF）mRNA表达量。结果 CCK-8法和细胞周期结果显示CGFe明显促进细胞增殖（P<0.05）,且增殖效应呈CGFe浓度依赖性,各组间均有统计学差异（P<0.05）;划痕实验中12 h时实验组划痕愈合效率明显高于对照组,且愈合效率与CGFe浓度呈正比（P<0.05）;CGFe明显促进VEGF、CXCR4、PDGF的mRNA表达量,促进效应与浓度呈正比（P<0.05）。结论 CGFe能有效促进HUVECs的增殖、迁移和成血管分化。     

敲减TULP3对头颈鳞癌细胞生物学行为的影响

目的 探讨敲减TULP3对头颈鳞状细胞癌(HNSCC)细胞生物学行为的影响。方法 应用TCGA数据比较头颈鳞癌组织与癌旁组织中TULP3表达水平;体外培养人HNSCC细胞系HN4、HN6、CAL27、HSC3、SCC4及正常口腔上皮角质细胞HOK并应用Western Blot比较TULP3蛋白表达水平,免疫组化分析TULP3在HNSCC组织中表达情况。构建RNA干扰寡核苷酸si-TULP3及si-NC转染HN4、HN6,应用CCK-8实验、平板克隆形成实验、划痕愈合实验、Transwell侵袭实验检测敲减TULP3对HNSCC细胞增殖、侵袭、迁移能力的影响。实时定量逆转录PCR及Western Blot检测细胞周期及上皮间质转化(EMT)相关指标变化。构建HN6-shTULP3及HN6-shNC细胞株接种于裸鼠皮下,分析裸鼠移植瘤体积差异。结果 TCGA数据显示头颈鳞癌组织TULP3表达量显著高于癌旁组织(P<0.000 1);HN4、HN6、CAL27、HSC3细胞中TULP3蛋白表达量均高于HOK细胞,TULP3在HNSCC组织中呈阳性表达。HN4、HN6细胞转染si-TUL...     

根尖牙乳头干细胞和人脐静脉血管内皮细胞联合培养对牙髓组织成血管能力的影响

目的 探讨联合培养根尖牙乳头干细胞（stem cells from the apical papilla,SCAPs）和人脐静脉血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells,HUVECs）对牙髓组织血管形成能力的影响。方法 分别使用α-MEM培养基和成骨、成脂、成神经诱导培养基处理SCAPs,采用油红O染色、茜素红染色、βIII-Tubulin免疫荧光染色,分别检测SCAPs的成脂、成骨和神经向分化能力。取单独SCAPs、HUVECs细胞以及联合培养SCAPs和HUVECs细胞进行小管形成实验,分别在3、6、9 h检测各组小管形成的长度、节点数目和结合区面积。采用SPSS16.0软件包对数据进行统计学分析。结果 染色结果显示,实验组SCAPs形成了更多的矿化结节、红色脂滴和神经样细胞。小管形成实验结果表明,联合培养组细胞可以更快地形成类血管状结构,差异显著。结论 SCAPs具有成骨、成脂和神经向诱导分化能力,联合培养SCAPs和HUVECs可以加速血管结构的形成。     

BMP4对牙源性干细胞精氨酸组蛋白甲基化酶表达影响的研究

目的 探索人重组骨形成蛋白4(BMP4)对牙源性干细胞精氨酸组蛋白甲基化酶表达的影响.方法 利用BMP4对根尖牙乳头干细胞和牙周膜干细胞进行诱导,Real-time PCR检测精氨酸组蛋白甲基化酶基因家族的主要相关基因PMRT1～9的表达变化.结果 Real-time PCR结果显示50 ng/ml BMP4促进根尖牙乳头干细胞精氨酸组蛋白甲基化酶基因家族中的PRMT2、PRMT4、PRMT5、PRMT6、PRMT7和PRMT9的表达,而在牙周膜干细胞50 ng/ml BMP4只促进PRMT6的表达.结论 BMP4促进根尖牙乳头干细胞和牙周膜干细胞部分精氨酸组蛋白甲基化酶的表达,可能在牙源性干细胞成骨分化中起一定的作用.     

釉原蛋白对牙周膜干细胞迁移、黏附及增殖的影响

目的：检测釉原蛋白（amelogenin,AML）对牙周膜干细胞（PDLSCs）迁移、黏附和增殖的影响。方法：用0．25、50和100μg／ml 的 AML 培养人 PDLSCs。用划痕实验和 transwell 法检测 AML 对 PDLSCs 迁移的影响。用黏附实验检测 AML 对PDLSCs 黏附的影响。用 MTT 法和计数法检测 AML 对 PDLSCs 增殖的影响。结果：AML 可促进 PDLSCs 的迁移,而且呈剂量效应关系（P ＜0．05）。AML 对 PDLSCs 迁移和黏附有促进作用（P ＜0．05）,且随培养时间延长而增加。AML 可促进 PDLSCs的增殖,且呈剂量效应关系。结论：AML 可促进 PDLSCs 的迁移、黏附和增殖。     

体外沉默Rce1对舌鳞状细胞癌细胞侵袭和迁移能力的影响

目的 通过RNA干扰技术沉默Rce1基因,探讨Rce1对舌癌细胞侵袭和迁移能力的影响。方法 体外培养舌鳞状细胞癌Cal-27和SCC-4细胞,设计合成Rce1基因的小干扰RNA（siRNA）,采用脂质体载体瞬时转染沉默Rce1基因。根据转染的siRNA不同,将实验组分为Rce1-siRNA-1组、Rce1-siRNA-2组、Rce1-siRNA-3组,脂质体载体分别转染相对应序列的siRNA。脂质体转染siCON作为阴性对照组,不转染siRNA作为空白对照组。采用实时定量聚合酶链反应检测各组Rce1、RhoA以及K-Ras基因的表达,蛋白质印迹法（Western blot）检测Rce1、RhoA、K-Ras、金属基质蛋白酶（MMP）-2及MMP-9的表达,采用体外侵袭实验检测Cal-27和SCC-4的侵袭能力,细胞划痕实验检测细胞迁移能力。结果 实时定量聚合酶链反应及Western blot检测结果显示,与阴性对照组和空白对照组相比,实验组的Rce1基因及蛋白表达均下调（P<0.05）,RhoA、K-Ras基因及蛋白表达无统计学差异（P>0.05）,MMP-2、MMP-9表达下降（P<0.05）。体外侵袭实验表明,与对照组相比,实验组在聚碳酯膜上的细胞总数明显减少（P<0.05）。细胞划痕实验表明,实验组划痕处细胞闭合时间明显长于对照组（P<0.05）。结论 体外沉默Rce1可以有效下调其在舌癌细胞Cal-27和SCC-4中的表达水平,降低迁移和侵袭能力。